Summary
Dit protocol demonstreert een eenvoudig, robuust en hoge doorvoer enkel molecuul stroom-stretching assay voor het bestuderen van de eendimensionale (1D) verspreiding van moleculen langs DNA.
Abstract
Beschrijven we een eenvoudig, robuust en hoge doorvoer enkel molecuul stroom-stretching assay voor het bestuderen van de 1D verspreiding van moleculen langs DNA. In deze test, zijn glas coverslips matiemaatschappij in een one-step-reactie met silane-PEG-biotine. Stroom cellen worden geconstrueerd door een plakband met voorgesneden kanalen tussen een functionalized dekglaasje aan en een plaat van de PDMS inlaat en uitlaat gaten met klemmen. Meerdere kanalen zijn geïntegreerd in één cel en de stroom van reagentia in elk kanaal kan volledig geautomatiseerd worden, die aanzienlijk verhoogt de doorvoer assay en vermindert van hands-on tijd per test. Binnen elk kanaal, Biotine-λ-Ani zijn geïmmobiliseerd op het oppervlak en een laminaire flow wordt toegepast om de stroom-stretch het DNAS-systeem. De DNA moleculen zijn uitgerekt tot > 80% van hun contour lengte en serveer als ruimtelijk uitgebreid sjablonen voor het bestuderen van de activiteit van het bindende en vervoer van fluorescently geëtiketteerde molecules. De trajecten van afzonderlijke moleculen worden bijgehouden door time-lapse beeldvorming van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF). RAW-beelden worden geanalyseerd met behulp van gestroomlijnde aangepaste één deeltje voor het bijhouden van software voor het automatisch identificeren trajecten van afzonderlijke moleculen verspreiden langs DNA en schatten hun verspreiding van 1D-constanten zijn.
Introduction
Een langdurige probleem in de biologie is hoe endogene eiwitten die op specifieke handelen locaties in het genoom kunnen vinden hun DNA doelstellingen snel genoeg voor het organisme om te overleven en doeltreffend reageren op zijn omgeving. Studies in de afgelopen veertig jaar voorgesteld en grotendeels ondersteunen de hypothese dat de kinetiek van DNA zoeken door een eiwit gericht kan versneld worden door vergemakkelijkt diffusie waarin de proteïne afwisselend 3D diffusie in de bulk- en verspreiding van de 1D (met inbegrip van glij- en hoppen processen) langs de DNA-1. Het is nu bekend dat vele eiwitten die betrokken zijn in genregulatie, nucleic zuur metabolisme en andere processen kunnen glijden op DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Bovendien, de recente studies gemeld dat zelfs kleine peptiden kunnen binden aan en schuif op DNA, met de mogelijkheid om het dragen van een lading; bijvoorbeeld een eiwit molecuul of PCR primer, langs DNA10,11,12,13,14.
In de afgelopen 15 jaar, is het enkel molecuul stroom-stretching assay wijd verbeid gebruikt om bindende en verspreiding van moleculen langs DNA2,15,16te studeren. In dit type van test, biotinyleerd double-stranded DNA-moleculen worden geïmmobiliseerd op het oppervlak en een laminaire flow wordt toegepast op stroom rekken het DNA. De > 80% uitgerekt ANI's dienen als ruimtelijk uitgebreide sjablonen voor het bestuderen van bindende en vervoer activiteit van moleculen aangeduid met fluorophores waar de trajecten van afzonderlijke moleculen langs DNA worden bijgehouden door time-lapse fluorescentie imaging. In onze uitvoering, geoptimaliseerd voor reproduceerbaarheid en gebruiksgemak, deze test bestaat uit vijf hoofdstappen: voorbereiding van biotine-λ-DNA, dekglaasje aan functionalization, stroom cel bouw, fluorescentie beeldvorming en data-analyse. In eerdere protocollen17, waren glas coverslips eerste reactie met (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) en vervolgens met de amine-reactieve polyethyleenglycol (PEG) reagentia (bijvoorbeeld NHS-PEG-Biotine) vormen een PEG-laag die weerstaat matiemaatschappij niet-specifieke adsorptie van assay onderdelen aan de oppervlakte van het dekglaasje aan. De kwaliteit van coverslips matiemaatschappij is grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van PEG reagentia en reactie voorwaarden bij elke stap. Ons protocol beschrijft een vereenvoudigde functionalization protocol en multiplex stroom cel bouw waarvoor geen vloeibare lijm of genezen van tijd op de dag stroom cellen worden geassembleerd. Ook beschrijven we een gestroomlijnde en robuuste data analyse procedure11 die computationeel intensief regressie stappen elimineert door het toepassen van een radiaal symmetrie methode voor centroid lokalisatie18 en een covariantie gebaseerde verspreiding constante schatter19.
Hier, rapporteren we een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul stromen uitrekkende assay uitvoering met aanzienlijke verbeteringen in het dekglaasje aan functionalization, de stroom cel constructie en de data-analyse. In het bijzonder, ontwikkelden we een one-step dekglaasje aan functionalization protocol, waarin de schone, droge coverslips direct met silane-PEG-Biotine reageren. Dit protocol vereenvoudigt het dekglaasje aan voorbereiding en verbetert de betrouwbaarheid van de kwaliteit van matiemaatschappij oppervlakken in vergelijking met het protocol van de reactie van standaard in twee stappen. We beschrijven het gebruik van coverslips dus matiemaatschappij met meerkanaals PDMS stroom cellen waarmee u robuuste buizen verbindingen worden gemaakt zonder lijm. Deze stroom cellen verder omvatten meerdere computergestuurde inhammen voor elke stroom kamer waarmee geautomatiseerde reagens stroom om hands-on tijd tijdens setup en verhoogde assay doorvoer.
Protocol
1. voorbereiding van biotine-λ-DNA
Opmerking: Biotine-λ-DNA-moleculen worden voorbereid door een Biotine-geëtiketteerden oligonucleotide, 5 ligating '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - Biotine - 3 ' aan Λ-DNA moleculen 20.
- Voorbereiden 0.1 mM Biotine label oligo in TE buffer.
- Warmte 0,5 mg/mL λ-DNA voorraad bij 65 ° C gedurende 60 s, en duik in nat ijs rechtsweg.
Opmerking: Snelle demping koeling vermindert λ-DNA concatemerization. - Pipetteer 100 µL van de λ-DNA-oplossing in een buis microcentrifuge.
- Voeg 1 µL van de oligo 0.1 mM in 9 µL van TE buffer.
- Toevoegen 2 µL van de oligo-oplossing aan de buis van de microcentrifuge met de λ-DNA. Meng.
Opmerking: Oligo is aanwezig in ongeveer een 12-fold molaire overschrijding van het einde van de λ-cDNA. - Verwarm het mengsel van de λ-DNA/oligo bij 65 ° C gedurende 60 s.
- Langzaam het mengsel tot kamertemperatuur afkoelen.
Opmerking: Deze stap maakt het mogelijk de oligo te ontharden aan het einde van de λ-cDNA. - Plaats het mengsel op het ijs. Voeg 11 µL van T4 DNA ligase reactie buffer (laatste buffer concentratie 1 x). Meng voorzichtig. Voeg vervolgens 2 µL (800 eenheden) van T4 DNA ligase enzym. Meng voorzichtig.
- Incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij 16 ° C of 's nachts bij 4 ° C.
- Zuiveren het product centrifugaal filter buizen met een nominale moleculair gewicht limiet van 100 kDa. Specifiek, breng het mengsel stap 1.9 in een centrifugaal filter buis en centrifuge op 14.000 x g gedurende 5 minuten wassen met 400 µL TE buffer tweemaal en verzamelen van het gezuiverde product.
Opmerking: De als-gezuiverd Biotine-λ-ANI in de buffer TE zijn stabiel op-20 ° C voor maximaal één jaar.
2. Dekglaasje aan functionalization
Opmerking: glas coverslips zijn matiemaatschappij door te reageren met silane-PEG-biotine. Dit protocol one-step reactie is eenvoudiger en betrouwbaarder in onze ervaring dan de standaard twee stappen reactie protocol 20. Dekglaasje aan functionalization met silane-PEG-Biotine bandplaatsen voor daar maakt en niet-specifieke DNA en eiwit adsorptie aan het oppervlak van het dekglaasje aan minimaliseert.
- Sonicate vijf nummer 1 coverslips in ethanol van 95% binnen een kleuring jar gedurende 10 minuten en spoel na met ultrazuiver water voor driemaal.
Opmerking: De vijfde dekglaasje aan biedt een reserve in geval van breuk. - Vul de kleuring pot met 1 M KOH, bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 10 minuten en spoel na met ultrazuiver water driemaal.
- De 2.1-2.2 cyclus tweemaal herhalen.
- Droog de coverslips onder de schone, droge N 2 gasstroom.
- Verder schoon en droog zijn de coverslips door het toepassen van plasma luchtbehandeling bij 900 mTorr druk gedurende 5 minuten
- Coverslips met 25 mg/mL silane-peg-biotine, opgelost in ethanol van 95% bij kamertemperatuur voor 2 h. specifiek Incubeer sandwich 50 µL siliciumwaterstof-peg-Biotine oplossing tussen twee schone, droge coverslips en Incubeer het dekglaasje aan " broodjes " in een gesloten Pipetteer tip doos met ongeveer 10 mL water aan de onderkant (niet in contact met de coverslips) te minimaliseren verdampend oplosmiddel.
- Wegwassen overtollige PEG moleculen met ultrazuiver water en droog de PEG coverslips onder schoon gecoat droog N 2 gasstroom.
Opmerking: De functionalized coverslips kan worden opgeslagen tot drie dagen onder omgevingsomstandigheden.
3. Stromen van cel bouw
Opmerking: Flow cellen worden geconstrueerd door een dubbel-plakband met voorgesneden kanalen tussen klemmen een PEG matiemaatschappij dekglaasje aan en een PDMS plaat met inlaat en uitlaat gaten. Meerdere kanalen zijn geïntegreerd per stroom cel.
- Stroom kanalen in een CAD-software ontwerp en knippen van de kanalen (de breedte, diepte en lengte van elke kanalen zijn 1, 0.13 en 12 mm, respectievelijk) op een dubbel-plakband met behulp van een cutter tape (doorgaans acht kanalen per stroom cel zijn geïntegreerd). Verwijderen van tape storingswaarden tot de kanalen van de stroom.
- Om PDMS platen, meng grondig 45 g PDMS met 5 g van het crosslinking reagens (genoeg voor het maken van twaalf 5 mm dikke PMDS platen die voor onbepaalde tijd kunnen worden opgeslagen onder omgevingsomstandigheden) met behulp van een mixer, giet het mengsel in twee petrischaaltjes van 10 cm, en laat de gerechten binnen een vacuuemcel totdat in wezen alle luchtbellen zijn verdwenen (handmatig verwijderen luchtbellen als om het even welk blijven wanneer de gerechten uit de Vacuuemcel zijn verwijderd). Breng de gerechten in een oven van 80 ° C, totdat PDMS stolt (ongeveer 2 h).
- Knip een PDMS plaat die overeenkomt met de grootte van de dubbel-plakband met voorgesneden kanalen. Peel een beschermfolie uit de double-plakband en houden de film naar een platte gezicht van de PDMS plak. Punch van de uitlaat en inlaat gaten op de plaat van de PDMS een biopsie-perforator met een naald Gauge 23.
- Schil van de tweede film van de bescherming van de dubbel-plakband en houden van de vergadering van de PDMS-tape op het functionalized oppervlak van het dekglaasje aan (zorg ervoor dat het dekglaasje aan plat is. Zie een afbeelding van een cel volledig geassembleerd stroom in Figuur 1a).
4. TIRF Imaging
Opmerking: Biotine-λ-Ani zijn vastgebonden aan een stroom kanaal oppervlak en laminaire flow wordt toegepast op stroom rekken de DNA moleculen ( Figuur 1b). De > 80% uitgerekt DNA moleculen dienen als ruimtelijk uitgebreide sjablonen voor de observatie van de activiteit van het bindende en vervoer van fluorescently geëtiketteerde molecules. De trajecten van afzonderlijke moleculen worden bijgehouden door time-lapse TIRF imaging ( Figuur 1 c & e).
- Fix de cel in de stroom van een Microscoop fase en belasting vooraf ontgaste lege buffer (10 mM natriumfosfaat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM ethanol, 5% (v/v) glycerol, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-mercaptoethanol, pH 7.4), 0,2 mg/mL daar oplossing, 1 mg / mL boviene serumalbumine (BSA) oplossing en 100 pM Biotine-λ-DNA oplossing in vier reservoirs dat elk hebben een Tygon buis op een magneetventiel waarde aangesloten en een ander Tygon buis op een buis PEEK aangesloten door de Tygon buis over de kleinere PEEK buis (sleeving Hiermee voorkomt u dat terugvoer van reagentia). Kleine hoeveelheid buffer ontgas door nachtelijke blootstelling aan vacuüm of kortere blootstelling aan vacuüm met roeren (tot bubbels niet langer zichtbaar zijn).
- Steek de buis PEEK van het reservoir leeg buffer in een inlaat-opening van de stroom-cel. Het kanaal door stroomt in lege buffer Prime en drie andere PEEK-tubing in inlaat gaten de luchtdruk gedreven stroom van elk reagens is gecontroleerd door magneetafsluiters en volledig geautomatiseerd via een computer script invoegen. Wees voorzichtig niet te induceren lucht luchtbel vorming in het kanaal.
- Sluit een Tygon buizen met een korte buis PEEK uit het gat van de uitlaat naar een afval container. De korte buis PEEK aan de uitlaat helpt lucht zeepbel formatie tijdens infusie onderdrukken door het behoud van de positieve druk in het kanaal.
- Tethering Biotine-λ-DNA moleculen op een stroom kanaal oppervlak.
- Flow in 0,2 mg/mL daar oplossing, Incubeer gedurende 5 min en dan stromen in lege buffer te wassen uit de niet-afhankelijke streptavidine.
- Stroom in 1 mg/mL BSA oplossing, Incubeer gedurende 1 min en vervolgens stromen in lege buffer voor het wassen van de niet-afhankelijke BSA.
Opmerking: BSA verder onderdrukt DNA en monster adsorptie aan de oppervlakte. - Stroom in 100 pM Biotine-λ-DNA oplossing, Incubeer gedurende 10 min en vervolgens stromen in lege buffer te wassen de ANI van de niet-afhankelijke.
Opmerking: Nadat het DNA is gebonden aan het oppervlak, Vermijd snelle stromen om schade te voorkomen aan de vastgebonden DNA moleculen.
- Om te controleren de kwaliteit van de functionalized dekglaasje aan, stromen in DNA op kleuring kleurstof zoals Sytox oranje onder de voorwaarden van de test worden gebruikt (Lees 4.6 hieronder), en beginnen met fluorescentie onder 532 nm laser verlichting imaging.
Opmerking: De kwaliteit van de functionalized dekglaasje aan is meestal goed en de dichtheid van stroom uitgerekt DNA moleculen zullen hoog. Het is absoluut noodzakelijk dat er een hoog genoeg dichtheid van stroom uitgerekt DNA moleculen zodat DNA bindende en glijden / 1D diffusie evenementen kunnen worden waargenomen. - Fine tune de hoek van de TIRF om de beste signaal / ruisverhouding van beelden van gestrekte DNA moleculen ( Figuur 1 d).
- Om vast te leggen trajecten van afzonderlijke moleculen bewegen langs DNA, herhaal stap 4.2-4.4 binnen een nieuw kanaal (zonder DNA kleuring kleurstof), dan vooraf ontgaste sub-nanomolar fluorophore moleculen op een hoog genoeg stroomtarief aangeduid met behulp van een spuitpomp infusie en verzamelen van time-lapse fluorescentie beelden met een framerate van 100 Hz.
Opmerking: Een debiet equivalent aan enkele Weissenberg (Wi: de dimensieloze product van het polymeer ontspanning langst - ongeveer 0,2 s voor λ-DNA- en de shear rate - de verandering van de stroomsnelheid met afstand het dekglaasje aan oppervlak) van 500 binnen de kanaal wordt aanbevolen voor enkel molecuul beeldbewerking met een framerate van 100 Hz 21.- Verzamelen 10.000 frames in een veld-Of-View (FOV) om een film te produceren, en het verzamelen van soortgelijke films uit meerdere (meestal tien) FOVs per monster.
Opmerking: De dichtheid van enkele deeltjes in een FOV moet niet te hoog - die data-analyse door het maken van object toewijzing in kaders dubbelzinnig, noch te laag - die tot lage plaatsvinden van één molecuul gebeurtenissen op DNA leiden kan zal compliceren. - Optimaliseren de verlichting intensiteit zodat moleculen gebonden aan het dekglaasje aan oppervlak snel foto-gebleekt achtergrond onderdrukken terwijl verspreiden op DNA moleculen niet te snel gebleekt zijn dus dat langere trajecten kunnen worden gedetecteerd.
Opmerking: We gebruiken meestal 200-800 W/cm 2 vermogensdichtheid in de FOV.
- Verzamelen 10.000 frames in een veld-Of-View (FOV) om een film te produceren, en het verzamelen van soortgelijke films uit meerdere (meestal tien) FOVs per monster.
- Aan het einde van stap 4.6, Infundeer DNA kleurstof vlekken om te bevestigen dat DNA moleculen nog steeds stroom-uitgerekt kunnen.
- Lopen zowel positieve en negatieve controlemonsters.
Opmerking: Een goede positieve controle is een tetrapeptide, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR is gekoppeld aan de N-terminale amine) die heeft een gemiddelde constante van de verspreiding van de 1D van 10,5 ± 0,7 (standaardfout) M (bp 2/s) bij neutrale pH 11. Een goede negatieve controle is voor het meten van gelabelde monsters van belang in assay buffer in een kanaal dat geen DNA aangebonden, waar geen op-DNA diffusie-activiteit moet worden gedetecteerd heeft.
5. Gegevensanalyse:
Opmerking: een aangepaste één deeltje tracking software wordt gebruikt voor het identificeren van de trajecten van afzonderlijke moleculen verspreiden langs DNA en schatten van diffusie-constanten zijn. Deze software bepaalt eerst de centroid posities van enkele deeltjes met een hoge nauwkeurigheid, identificeert deeltjes die op het dekglaasje aan oppervlak vastzitten, en dan links deeltjes in verschillende frames te vormen van time-lapse trajecten. Uit deze trajecten, de 1D-diffusie-constanten zijn geschatte.
- Om te beginnen van data-analyse, open een scripting software (zie tabel van materialen) en ga naar de directory van het één deeltje tracking software. Open het script met de naam " largedataprocess3.m ". Een belangrijke parameter in te stellen is de drempelwaarde voor de detectie van één deeltje.
- Om te bepalen van de optimale drempelwaarde, lopen de " Determine_threshold_value.m " script. Dit script zal aangeven hoe de drempelwaarde van invloed is op één deeltje detectie. Na het bepalen van de optimale drempelwaarde, lopen de " largedataprocess3.m " script.
- Na de voltooiing van één deeltje bijhouden van analyse, filteren de ruwe trajecten door het uitvoeren van de " Trajectory_filtering.m " script. Een grafische User Interface (GUI) is ingebouwd in de filterprocedure visualiseren.
- Op the GUI paneel, stelt u de minimale verplaatsing langs DNA, MinXDisp, op 2 pixels ingesteld de maximale verplaatsing dwars op DNA, MaxYDisp, 2 pixels; het minimale aantal frames, minFrames, ingesteld op 10; het minimale aantal staten triplet, minTriplets, ingesteld op 10; de constante minimale verspreiding langs DNA, D_par, ingesteld op 0; de constante maximale geschatte diffusie dwarse ingesteld op DNA, D_trans, tot 10 M (bp 2) S -1; de minimale statistiek parameter, Chi 2 _stat, ingesteld op -5; de minimale verhouding van verplaatsing langs DNA instelt dat dwarse aan DNA, MinX/Y, 2.
Opmerking: Alle rauwe trajecten die passeren deze filteren parameters zijn vermeld in tabel 1, en die niet zijn vermeld in tabel 3. - Klik op een traject nummer in tabel 1, het traject zal worden verplaatst in Graphics 1 & 2. Klik op de " Play " knop om te spelen de beelden van de ruwe fluorescentie. Klik op de " Add_to_Table2 " om te identificeren van het traject als een enkel molecuul glijden traject. Op het einde, alle trajecten toegevoegd aan tabel2 worden opgeslagen bij het afsluiten van de GUI.
- Voor het berekenen van de gemiddelde diffusie-constanten, voer het script " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". De constante gemiddelde diffusie wordt geschat uit de reeks van de trajecten die heb geslaagd voor alle filteren stappen en toegevoegd aan tabel 2.
Representative Results
Figuur 2a toont de gedetecteerde trajecten van pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B is geconjugeerd aan het cysteine residu) moleculen verspreiden op DNA in 2 mM NaCl buffer met een pH van 6.5. De diffusie van pVIc is bi-directionele en gedreven door ambient thermische energie. Van deze trajecten, de 1D diffusie-constanten zijn (D1-waarden) worden geschat voor elk traject (Zie het histogram in Figuur 2b). De gemiddelde waarde van de D1 van de geconjugeerde van deze pVIc wordt berekend op 22.2 ± 0,9 (standaardfout) M (bp2/s) door gemiddeld elke D1-waarde voor trajecten gewogen naar het aantal triplet opeenvolgende positie gesprekken opgenomen in elk traject.
Figuur 1 : Apparaat voor het bijhouden van de motie van afzonderlijke moleculen langs DNA.
a) een acht-kanaals PDMS microfluidic chip vastgehouden aan een functionalized dekglaasje aan waarnaar DNA kan worden aangebonden (met USA kwartaal munt voor schaal); b) flow cel zoom schematisch weergegeven: stroom-uitgerekt λ-DNA moleculen; c) Schematische voorstelling van Microscoop en stroom systeem van TIRF voor het uitrekken van DNA; d) TIRF beeld van een stroom-uitgerekt λ-DNA; e) TIRF beeld van pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B is geconjugeerd aan het cysteine residu) moleculen gebonden aan een stroom-uitgerekt λ-DNA. Dit cijfer is aangepast met toestemming2,12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Eendimensionale verspreiding van pVIc (GVQSLKRRRCF) langs DNA.
a). verspreiding van pVIc langs de stroom uitgerekt λ-Ani (137 trajecten) in 2 mM NaCl buffer met een pH van 6.5. x(t) en y(t) zijn de verplaatsingen langs- en dwarswapening naar λ-DNA, respectievelijk. Gestippelde horizontale lijnen geven aan ontbrekende punten als gevolg van de kleurstof knipperen. b). Histogram van de diffusie-constante, D1 voor pVIc verspreiden langs λ-Ani. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Wanneer overschakelen van het traditionele tweestaps dekglaasje aan functionalization reactie protocol naar een one-step reactie protocol, merkten we dat de betrouwbaarheid van dekglaasje aan functionalization aanzienlijk is verbeterd. Als de totale hands-on tijd dekglaasje aan voorbereiding minder dan dertig minuten is, is het raadzaam de voorbereiding van verse coverslips elke dag enkel molecuul imaging is gepland. U wilt minimaliseren verslechtering van silane-PEG-biotine, moet het reagens aliquoted en opgeslagen onder droge N2 gas bij-20 ° C na ontvangst. Wij doen hier niet gebruiken PEG-moleculen die produceren -COO- of -CH3 terminal groepen die zijn gebruikt in de afgelopen20. De negatieve ladingen van -COO- groepen en de hydrofobe -CH3 groepen werden gebruikt om te voorkomen dat niet-specifieke adsorptie van DNA moleculen en specifieke EiwitSteekproeven aan de oppervlakte, respectievelijk. We bekijken op zeer lage oppervlakte adsorptie door kleine peptide monsters op het volledig Biotine-beëindigd PEG oppervlak, silane-PEG-COOH en/of silane-PEG-CH3 misschien nuttig zijn voor het testen van bepaalde EiwitSteekproeven of wanneer assay voorwaarden (zoals pH < 7.5) DNA-oppervlak interacties te bevorderen.
De verschuiving van glas dia stroom cellen naar PDMS stroom versnelt de stroom cel bouw cellen en maakt eenvoudige integratie van meerdere kanalen. We ingenieur vaak acht kanalen per stroom cel om acht onafhankelijke experimenten per matiemaatschappij dekglaasje aan. Om verder verhogen doorvoer per dekglaasje aan, kunnen zelfs grotere aantallen micro-verzonnen kanalen worden gebruikt.
Het is raadzaam om te voorkomen dat de lucht zeepbel vorming binnen het kanaal op elk gewenst moment na de eerste vullen. Meestal, luchtbellen doen niet leiden tot verlies van vastgebonden Ani (hoewel dit mogelijk is), maar veeleer verstoren stroom en eventueel veroorzaken Ani vast te houden aan het dekglaasje aan. Buffer ontgassing en de toevoeging van de kleine oppervlakteactieve stof hoeveelheden zijn meestal effectief bij het voorkomen van bubble vorming binnen het leidingen en stroom kanaal. In gevallen waar de luchtbellen worden ingevoerd voor de buis, proberen de bubbels spoelen onder een langzame stroming en ervoor te zorgen dat ze niet doorstromen naar de regio waar de ANI's worden aangebonden.
Een gestroomlijnde en efficiënte data-analysesoftware is van cruciaal belang, als gevolg van de enorme hoeveelheid gegevens gegenereerd. Wij verzamelen meestal 700.000 resolutieafbeeldingen van metingen op één cel, die kan worden verwerkt met behulp van onze aangepaste één deeltje het bijhouden van software binnen één dag op een desktop computer met een quad-core processor en 32 Gb geheugen. De valse positieve tarief voor het opsporen van 1 D diffusie trajecten door de software (stap 5.5) van monster afhankelijk is en kan worden vrij laag, gezien het feit dat: 1) de dichtheid van enkele deeltjes in de FOV is laag genoeg, zodat er weinig dubbelzinnigheid deeltjes over frames (koppelen EiwitSteekproeven zijn in het algemeen gevoeliger voor niet-specifieke adsorptie aan het dekglaasje aan dan peptide monsters, en dus de buffer en de vermogensdichtheid voor elke proteïne proef moet worden geoptimaliseerd); 2) de signaal / ruisverhouding van enkele deeltjes is hoog genoeg zodat de kans op false-identificatie van de deeltjes laag is. Toch, de software kan af en toe fouten maken, en we raden handmatige inspectie van de gegevens met behulp van de meegeleverde GUI te evalueren van de prestaties van de software. In een toepassing die bijzonder gevoelig zijn voor de detectie van de vals-positieve traject, procesparameters met inbegrip van de drempelwaarde, minFrames, minTriplets en Chi2_stat instelbaar stringentere ten koste van de lagere gevoeligheid voor waar bindende evenementen en potentieel meer statistische bias in traject identificatie. Wij delen en beschrijven onze één deeltje voor het bijhouden van software met de hoop standaardiseren van gegevens analysemethoden en stimuleren van de discussie over de beste praktijken te helpen.
In ons protocol, waarvoor voortdurende stroom tijdens imaging om te handhaven de uitgerekte staat van de moleculen van de sjabloon DNA, kon de vloeistofstromen bias het vervoer van sommige eiwitten langs DNA sjablonen als ze door een hopping mechanisme diffuus of als de hydrodynamische straal van de gelabelde fluorophore is groot22,23. Terwijl dergelijke bias kan worden gemeten en gecorrigeerd in de meeste datasets, het vervoer van eiwitten aangeduid met een kleine fluorophore en verspreiden door een glijdende mechanisme is niet typisch bevooroordeeld in een detecteerbare mate door stroom2,4, 24. Met name is het effect van de stroomsnelheid over het vervoer van eiwitten langs DNA gebruikt om te studeren van de mechanismen van eiwit verspreiden langs DNA23. A nauw gerelateerde alternatieve aanpak waarmee metingen in de afwezigheid van stroom maakt gebruik van DNA sjablonen met biotine op beide termini dat Transient in stroom uitgerekt zijn en vastgebonden door beide uiteinden aan het dekglaasje aan dergelijke dat de DNA-moleculen blijven een uitgebreide configuratie wanneer de stroom is uitgeschakeld25,26,27,28. De dubbel-ketting-aanpak heeft het voordeel dat stroom-gratis vervoer experimenten maar vereist wijzigen van beide uiteinden van de DNA-moleculen sjabloon, zorgvuldige datatransportbesturing tijdens binden, en karakteriseren van de afstanden tussen de twee sites die vastgebonden. Daarnaast, moet de impact van heterogene spanningen en DNA conformationele dynamiek over DNA moleculen op de single-molecuul bepaling worden beoordeeld.
Over het geheel genomen naast het studeren 1 D verspreiding van moleculen langs DNA, de bepaling van de enkel molecuul gemeld kan profiteren veel in vitro biochemische en biofysische studies op het niveau van de enkel molecuul met inbegrip van DNA target search processen door eiwitten, enzymatische activiteiten op DNA, en meer.
Probleemoplossing
Probleem 1: De kanalen van de stroom lekken.
Oplossing: Eerst, zorg ervoor dat het ontwerp van de kanalen van de stroom ten minste 1,5 mm marge voor afdichting rondom en tussen kanalen zorgt; en vervolgens, tijdens de vergadering van de stroom-cel, zorg ervoor dat contactvlakken tussen het dekglaasje aan, de dubbel-plakband en de PDMS plaat vlak, droog en vrij van vuil, dat de druk toegepast om te vormen van het zegel uniform zijn is, en dat de afdichtende werking uitgevoerd bij kamertemperatuur.
Probleem 2: De dichtheid van de ANI van de vastgebonden is te laag.
Oplossing: Dit probleem doet zich voor wanneer de PEG functionalization-efficiëntie laag is of de DNA moleculen zijn niet matiemaatschappij met biotine. Uit onze ervaring, moet de dichtheid van vastgebonden DNA hoog voor > 90% van de coverslips bereid uit verse of correct opgeslagen silane-PEG-Biotine reagens. In gevallen wanneer de dichtheid van vastgebonden DNA laag met een bewezen partij van biotine-λ-DNA is, proberen stimuleren van concentraties van silane-PEG-Biotine tijdens PEG functionalization en concentraties van daar en biotine-λ-DNA tijdens het binden van DNA. Als dit mislukt, vervangen de PEG en daar reagentia.
Probleem 3: ANI vasthouden aan het dekglaasje aan eend kan niet worden opgerekt door stroom.
Oplossing: Dit probleem kan zich ook voordoen wanneer de PEG functionalization efficiëntie laag is, en wordt nog verergerd door lage assay pH. Probeer stroomt in meer BSA of het verhogen van de pH (bv op 8.0) om te helpen onderdrukken DNA adsorptie aan het oppervlak (stap 4.3.2). Als DNA adsorptie een hardnekkig probleem onder de voorwaarde van een bepaalde bepaling is, probeer waaronder up tot 90% silane-PEG-COOH tijdens PEG functionalization.
Opmerkingen bij DATA analyse:
Gebruiken we aangepaste één deeltje tracking software te identificeren van de trajecten van afzonderlijke moleculen verspreiden langs DNA van die hun 1D diffusie-constanten zijn, D1 worden geschat. Ter verbetering van gegevensanalyse, wij de radiale symmetrie algoritme18 voor het lokaliseren van deeltjes en de covariantie gebaseerde schatter19 voor schatten 1 D diffusie-constanten zijn, die drastisch versneld gegevensanalyse zonder afbreuk te doen aan nauwkeurigheid. We eerder de douanesoftware gevalideerd door het analyseren van de gesimuleerde gegevens11. De grote stappen worden hieronder beschreven.
Particle identificatie:
Deze stap is voor het opsporen en segmenteren van deeltjes - diffractie-beperkte plekken - van achtergrond. Eerst, ruimtelijk band pass filter de beelden ter verbetering van het signaal van de deeltjes in de 3-5 pixel bereik (die overeenkomt met de grootte van de punt-spread-functie op onze systeem) en vervolgens drempel gebaseerd op intensiteit (Zie script: spt2_SD_sandbox.m).
Centroid toewijzing
Het segmenteren van de afbeelding alleen lokaliseert moleculen de ruimtelijke resolutie van pixel-niveau. Om te lokaliseren moleculen aan veel hogere precisie, gebruikmaken van de symmetrie van de radiale super resolutie algoritme18 naar afbeeldingen gefilterd zoals hierboven. (Deze methode is gebaseerd op de berekening van een analytische en dus enorm vermindert computationele belasting vergeleken met andere populaire methoden, hoog-nauwkeurigheid zoals 2D Gaussian montage (Zie script: spt2_SD_sandbox.m).)
Deeltje bijhouden:
Voor het bijhouden van het traject van een deeltje door de tijd, moeten we opnieuw de dezelfde deeltjes identificeren als zij zich tussen frames verplaatsen. Wij beschouwen de inleiding, knipperen en beëindiging stadia als onderdelen van een traject. We beperken de koppeling van deeltjes in de huidige frames die appearing in vorige frames van de maximale verplaatsing per frame toegestaan. In gevallen waar meerdere verbanden mogelijk zijn, de Jonker-Volgenant algoritme wordt gebruikt om te leveren wereldwijd optimale koppeling sets (Zie script: traceTraj4_kx.3.m).
D1 schatting:
Als u wilt schatten D1 waarden van trajecten, gebruiken we de covariantie gebaseerde Estimator (CVE)19. Gebaseerd op de berekening van een analytische, deze methode is meer computationeel efficiënt en statistisch strenge dan andere veelgebruikte methoden zoals regressie van gemiddelde kwadraat verplaatsingen (Zie script: runspt5_SD.m).
Traject filteren:
Sommige trajecten artefacten zoals koppeling aan de oppervlak-gebonden moleculen bevatten en moeten worden verwijderd. Wij verschillende functies zoals minimale verplaatsing parallel aan DNA, maximale waterverplaatsing dwars aan DNA, minimale lengte van het traject, minimaal aantal triplet opeenvolgende gedetecteerd posities, en minimale kans score (Zie Xiong et al.11 voor de definitie) die kan worden gefilterd om te isoleren een minimaal vooringenomen aantal trajecten kunnen verspreiden op DNA moleculen vertegenwoordigen (Zie script: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Het brede Instituut mag ervoor kiezen bestand octrooiaanvragen waarin aspecten van het werk hier gepresenteerd.
Acknowledgments
Wij danken Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick en Evangelos Gatzogiannis voor hulp bij de initiële instrumentatie setup en testen. We bedanken verder Tony Kulesa voor belangrijke hulp schrijven en de evaluatie van het aangepaste één deeltje tracking software. Dit werk werd gesteund door de financiering van het opstarten en een carrière Award op de wetenschappelijke Interface (PCB) van de Burroughs-Wellcome Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al.
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
