Summary
Dieses Protokoll zeigt einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium eindimensionale (1D) Diffusion von Molekülen entlang DNA.
Abstract
Wir beschreiben einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium 1D Diffusion von Molekülen entlang DNA. In diesem Test sind Glasdeckgläser in eine einstufige Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Durchflusszellen entstehen durch ein Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen einem funktionalisierten Deckgläschen und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen sandwiching. Mehrere Kanäle in einer Messzelle integriert sind und die Strömung von Reagenzien in jedem Kanal kann vollständig automatisiert werden, die deutlich erhöht den Durchsatz Assay und Hands-on-Zeit pro Assay reduziert. In jedem Kanal Biotin-λ-DNA sind auf der Oberfläche immobilisiert und eine laminare Strömung wird angewendet, um Fluss-die DNAs Stretch. Die DNA-Moleküle werden gedehnt > 80 % ihrer Kontur Länge und dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu studieren. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse Total interne Reflexion Fluoreszenz (TIRF) Bildgebung. RAW-Bilder werden analysiert, optimierte benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software verwenden, um automatisch Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen ihre 1D-Diffusion-Konstanten.
Introduction
Ein altes Problem in der Biologie ist wie körpereigene Proteine, die auf spezifische Handeln stellen im Genom finden ihre DNA Ziele schnell genug für den Organismus zu überleben und wirksam auf seine Umwelt reagieren. Studien in den vergangenen vierzig Jahren vorgeschlagen und weitgehend Unterstützung, die die Hypothese, dass die Kinetik der DNA durch ein Protein Suche gezielt durch beschleunigt werden kann erleichterte Diffusion, in dem das Protein zwischen 3D Diffusion in der Masse und 1D Diffusion (einschließlich wechselt Rutschen und hüpfen Prozesse) entlang des DNA-1. Es ist nun bekannt, dass viele Proteine, die in der Genregulation, Nukleinsäure-Stoffwechsel und andere Prozesse in der Lage des Gleitens auf DNA-2,3,4,5,6,7 ,8,9. Neuere Studien berichtet darüber hinaus, dass sogar kleine Peptide binden an und schieben Sie auf DNA, mit der Fähigkeit, eine Ladung tragen können; zum Beispiel ein Eiweißmolekül oder PCR Primer entlang DNA-10,11,12,13,14.
In den letzten 15 Jahren hat Einzelmolekül Fluss-stretching Assay verbreitet, Bindung und Diffusion von Molekülen entlang DNA2,15,16zu studieren. Bei dieser Art des Tests, Biotinylierte doppelsträngige DNA-Moleküle auf der Oberfläche immobilisiert sind und eine laminare Strömung gilt für Durchfluss dehnen die DNA. Die > 80 % gedehnt DNAs dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Untersuchung von Bindung und Transport Aktivität von Molekülen mit Fluorophore beschriftet wo werden die Bahnen der einzelnen Moleküle entlang DNA durch Time-Lapse Fluoreszenz-Bildgebung verfolgt. In unserer Implementierung optimiert hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit, dieser Test besteht aus fünf Hauptschritte: Vorbereitung der Biotin-λ-DNA, Deckglas Funktionalisierung, Flow Zelle Bau, Fluoreszenz-Bildgebung und Datenanalyse. In früheren Protokollen17waren Glasdeckgläser funktionalisiert durch erste reagierenden mit (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) und dann mit Amin-reaktive Polyethylenglykol (PEG) Reagenzien (z. B. NHS-PEG-Biotin) um eine PEG Schicht bilden, die widersteht unspezifische Adsorption von Assay-Komponenten auf dem Deckglas Oberfläche. Die Qualität der funktionalisierter Deckgläsern hing weitgehend von der Qualität der PEG Reagenzien und Reaktionsbedingungen bei jedem Schritt. Unser Protokoll beschreibt eine vereinfachte Funktionalisierung Protokoll und Multiplex-Flow Zelle Konstruktion erfordert keine flüssigen Klebstoff oder Aushärtungszeit auf die Tag-Durchflusszellen montiert. Wir beschreiben auch eine schlanke und robuste Daten Analyse Verfahren11 , die rechenintensive Regression Schritte beseitigt durch die Anwendung einer radiale Symmetrie-Methode für Zentroid Lokalisierung18 und eine Kovarianz-basierte diffusion konstante Schätzer19.
Hier berichten wir eine einfache, robuste und Hochdurchsatz-Molekül fließen stretching Assay-Umsetzung mit signifikanten Verbesserungen im Deckglas Funktionalisierung, Flow-Zelle-Bau und Datenanalyse. Unter anderem entwickelten wir eine einstufige Deckglas Funktionalisierung Protokoll, in dem sauberen und trockenen Deckgläsern direkt mit Silan-PEG-Biotin reagieren. Dieses Protokoll vereinfacht die Vorbereitung Deckglas und verbessert die Zuverlässigkeit der Qualität der funktionalisierten Oberflächen im Vergleich zu den standard zweistufige Reaktion Protokoll. Wir beschreiben die Verwendung von so funktionalisiert Deckgläsern mit Mehrkanal PDMS Durchflusszellen, die robuste Schlauchverbindungen erfolgen ohne Leim zu ermöglichen. Diese Durchflusszellen weiter gehören mehrere computergesteuerte Einlässe für jede Kammer fließen die automatisierte Reagenz Stromfluss, Hands-on-Zeit während der Installation und erhöhte Assay Durchsatz zu verringern zu können.
Protocol
1. Vorbereitung der Biotin-λ-DNA
Hinweis: Biotin-λ-DNA-Moleküle sind bereit, durch Ligation eine Biotin-markierten Oligonukleotid, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - Biotin - 3 ', Λ-DNA Moleküle 20.
- Prepare 0,1 mM Biotin beschriftet Oligo in TE-Puffer.
- Wärme 0,5 mg/mL λ-DNA Lager bei 65 ° C für 60 s und Sprung in nassem Eis sofort.
Hinweis: Schnelle Quench Kühlung reduziert λ-DNA-Concatemerization. - Pipette 100 µL der λ-DNA-Lösung zu einem Microcentrifuge Schlauch.
- Add 1 µL 0.1 mM Oligo in 9 µL TE-Puffer.
- Add 2 µL der Oligo-Lösung für den Microcentrifuge Schlauch mit λ-DNA. Gründlich mischen.
Hinweis: Oligo ist in etwa eine 12-fold Molaren Überschuss über ergänzende λ-DNA Ende. - Erhitzen Sie die Mischung der λ-DNA/Oligo bei 65 ° C für 60 s.
- Langsam die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen.
Hinweis: In diesem Schritt können die Oligo bis zu ergänzenden λ-DNA Ende Tempern. - Legen Sie die Mischung auf dem Eis. Fügen Sie 11 µL T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (endgültige Puffer Konzentration 1 X). Mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie 2 µL (800 Stück) T4 DNA-Ligase-Enzym. Vorsichtig mischen.
- Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei 16 ° C oder über Nacht bei 4 ° c
- Reinigen Sie das Produkt mit zentrifugalen Filterschläuche mit einem nominalen Molekulargewicht Limit von 100 kDa. Insbesondere übertragen die Schritt 1,9-Mischung in eine zentrifugale Filter Schlauch und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min, mit 400 µL TE-Puffer zweimal waschen und sammeln das gereinigte Produkt.
Hinweis: Die als gereinigt Biotin-λ-DNA in TE-Puffer sind stabil bei-20 ° C bis zu einem Jahr.
2. Deckglas Funktionalisierung
Hinweis: Glasdeckgläser sind durch die Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Diese einstufige Reaktion Protokoll ist einfacher und zuverlässiger erfahrungsgemäß als standard zweistufige Reaktion Protokoll 20. Deckglas Funktionalisierung mit Silan-PEG-Biotin schafft Bindungsstellen für Streptavidin und minimiert die unspezifische DNA und Protein Adsorption an der Oberfläche des Deckglases.
- Sonicate fünf Nr. 1 Deckgläsern in 95 % igem Ethanol im Inneren eine Färbung jar für 10 min und dann mit Reinstwasser dreimal ausspülen.
Hinweis: Die fünfte Deckglas bietet einen Ersatz bei Bruch. - Füllen Sie die Färbung Glas mit 1 M KOH, 10 min. lang beschallen und dann spülen Sie mit Reinstwasser dreimal.
- 2.1-2.2 Zyklus zweimal wiederholen.
- Trocknen Deckgläsern unter trockenen, sauberen Gasstrom der N 2.
- Weitere reinigen und trocknen Sie die Deckgläsern durch Luft Plasmabehandlung bei 900 mTorr Druck für 5 min.
- Brüten Deckgläsern mit 25 mg/mL Silan-Peg-Biotin speziell in 95 % igem Ethanol bei Raumtemperatur für 2 h aufgelöst, sandwich-50 µL Silan-Peg-Biotin Lösung zwischen zwei sauberen und trockenen Deckgläsern und inkubieren Sie das Deckglas " Sandwiches " innerhalb einer geschlossenen Pipette Tip Box mit ca. 10 mL Wasser an der Unterseite (nicht in Kontakt mit den Deckgläsern) Lösungsmittel verdampfen zu minimieren.
- Waschen entfernt überschüssige PEG Molekülen mit Reinstwasser und Trocknen der PEG Deckgläsern unter sauberen beschichtet trocknen Gasstrom N 2.
Hinweis: Die funktionalisierten Deckgläsern können bis zu drei Tage unter Umgebungsbedingungen gelagert werden.
3. Bau der Zelle fließen
Hinweis: Durchflusszellen entstehen durch sandwiching eine Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen eine PEG funktionalisiert Deckglas und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen. Mehrere Kanäle fließen pro Durchflusszelle.
- Strömungskanäle in einer CAD-Software-design und Schnitt die Kanäle (Breite, Tiefe und Länge der einzelnen Kanäle sind 1, 0,13 und 12 mm, beziehungsweise) auf ein Doppel-Klebeband mithilfe einer Bandabschneider (in der Regel acht Kanäle fließen pro Zelle). Entfernen Sie Klebeband Residuen der Strömungskanäle bilden.
- Zu PDMS Platten, mischen Sie 45 g PDMS mit 5 g Vernetzung Reagenz (genug für die Herstellung von zwölf 5 mm dicker PMDS Platten die unter Umgebungsbedingungen auf unbestimmte Zeit gespeichert werden kann) mit einem Mixer, den Teig in zwei 10 cm Petrischalen und lassen die Gerichte in einer Vakuumkammer bis im Wesentlichen alle Luftblasen sind verschwunden (manuell entfernen Luftblasen, wenn irgendwelche bleiben, wenn die Gerichte aus der Vakuumkammer entfernt werden). Übertragen Sie dann die Gerichte in einem Ofen 80 ° C bis PDMS erstarrt (ca. 2 h).
- Schneiden Sie ein PDMS-Platte, die die Größe der Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanälen entspricht. Peel ein Schutzfilm aus dem Doppel-Klebeband und halten den Film auf eine Ebene Fläche der Platte PDMS. Ablauf und Zulauf Lochen auf der PDMS-Platte mit einem 23 Gauge-Nadel eine Biopsie Loch-Puncher.
- Schälen die zweite Schutzfolie aus dem Doppel-Klebeband und halten die PDMS-Band Montage an die funktionalisierten Oberfläche das Deckglas (stellen Sie sicher, dass das Deckglas flach ist. Sehen ein Bild von einer fertig montierten Durchflusszelle in Abbildung 1a).
4. Imaging-TIRF
Hinweis: Biotin-λ-DNA sind angebunden an eine Flow-Kanal-Oberfläche und Laminar-Flow gilt für Flow erstrecken sich die DNA-Moleküle ( Abbildung 1 b). Die > 80 % gedehnt DNA Moleküle dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu beobachten. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse TIRF Imaging ( Abbildung 1 c & e).
- Fix der Messzelle am Mikroskop Bühne und Last bereits entgast leeren Puffer (10 mM Natriumphosphat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM Ethanol, 5 % (V/V) Glycerin, 0,01 % Tween-20, 1 % (V/V) β-Mercaptoethanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 1 mg / mL Bovine Serum Albumin (BSA) und 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung in vier Stauseen, dass jeweils ein Tygon-Schlauch mit einem Magnetventil-Wert verbunden und eine PEEK-Schlauch durch Sleeven den Tygon-Schlauch über die kleineren PEEK Rohr (ein weiteres Tygon Schlauch verbunden verhindert Rückfluss von Reagenzien). Entgasen von Kleinmengen des Puffers durch Übernachtung Exposition, Vakuum oder kürzeren Exposition gegenüber Vakuum unter Rühren (bis Bläschen nicht mehr sichtbar sind).
- PEEK-Schläuche des leeren Puffer Reservoirs in einer Bucht Loch der Durchflusszelle einfügen Prime den Kanal fließt in leeren Puffer, und drei andere PEEK-Schlauch In Saugbohrungen ist der Luftdruck angetrieben von Energiefluss jedes Reagenz durch Magnetventile gesteuert und vollautomatisch über ein Computer-Skript einfügen. Achten Sie darauf, keine Luft Blasenbildung im Kanal zu induzieren.
- Schließen Sie ein Tygon-Schlauch mit einer kurzen PEEK Schläuche aus der Austrittsöffnung zu einem Abfallbehälter. Der kurze Blick Schlauch am Ausgang hilft Luft Blasenbildung während der Infusion zu unterdrücken, durch die Aufrechterhaltung der Überdruck im Inneren des Kanals.
- Tethering Biotin-λ-DNA-Moleküle zu einer Strömung Kanal Oberfläche.
- Flow in 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 5 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen Streptavidin.
- Durchfluss bei 1 mg/mL BSA-Lösung 1 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen BSA.
Hinweis: BSA weiter unterdrückt DNA und Probe Adsorption an der Oberfläche. - Flow in 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung, 10 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen DNAs.
Hinweis: Nachdem die DNA an die Oberfläche gebunden ist, vermeiden Sie schnelle fließt die gefesselte DNA-Moleküle beschädigt.
- Um die Qualität der funktionalisierten Deckglas, fließen in DNA Färbung Farbstoff wie Sytox orange unter der Assay-Bedingungen verwendet werden (siehe 4.6 unten), und starten Sie Fluoreszenz imaging unter 532 nm Laser Beleuchtung.
Hinweis: Die Qualität der funktionalisierten Deckglas ist in der Regel gut, und die Dichte der Strömung gestreckt DNA-Moleküle wird hoch sein. Es ist wichtig, hochdichte der Fluss erstreckte sich DNA-Moleküle haben, dass DNA-Bindung und Schiebe/1D Verbreitung Ereignisse beobachtet werden können. - Feinabstimmung den TIRF Winkel zum besten Signal Rauschabstand von Bildern der gestreckten DNA-Moleküle ( Abbildung 1-d) zu erreichen.
- Bahnen der einzelne Moleküle DNA, voran aufzeichnen wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 in einen neuen Kanal (ohne DNA Farbstoff Färbung), dann ziehen bereits entgast Sub-nanomolaren Fluorophore beschriftet Moleküle mit einer genug hohen Durchflussrate mithilfe einer Spritzenpumpe und sammeln Sie Zeitraffer Fluoreszenzbilder mit einer Frame-Rate von 100 Hz.
Hinweis: Eine Durchflussmenge entspricht einem Weissenberg-Zahl (Wi: die dimensionslose Produkt die längste Polymer-Relaxationszeit - ca. 0,2 s für λ-DNA- und die Scherrate - die Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit mit Abstand von der Oberfläche des Deckglases) von 500 innerhalb der Kanal wird für die Einzelmolekül-Bildgebung mit einer Frame-Rate von 100 Hz 21 empfohlen.- Sammeln 10.000 Bilder in einem Field Of View (FOV), einen Film zu produzieren und ähnliche Filme aus mehreren (in der Regel zehn) FOVs pro Probe zu sammeln.
Hinweis: Die Dichte der Partikel in einem FOV sollte weder zu hoch - das wird Datenanalyse erschweren, indem man Objektzuordnung in Frames nicht eindeutig noch zu niedrig - die zu geringe Auftreten von Einzelmolekül-Veranstaltungen auf DNA führen könnte. - Die Beleuchtungsintensität so optimieren, dass Moleküle gebunden an das Deckglas Oberfläche sind schnell Foto-gebleicht, Hintergrund zu unterdrücken, während Moleküle diffundieren auf DNA nicht vorschnell gebleicht werden, so dass längere Trajektorien erkannt werden können.
Hinweis: Wir verwenden in der Regel 200-800 W/cm 2 Leistungsdichte in der FOV.
- Sammeln 10.000 Bilder in einem Field Of View (FOV), einen Film zu produzieren und ähnliche Filme aus mehreren (in der Regel zehn) FOVs pro Probe zu sammeln.
- Am Ende des Schrittes 4.6 Infusion DNA Farbstoff Färbung zu bestätigen, dass DNA-Moleküle noch Strömung gestreckt werden können.
- Laufen sowohl positive als auch negative Kontrollproben.
Hinweis: Eine gute positive Kontrolle ist ein Tetrapeptid, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR ist gekoppelt an das N-terminale Amin) hat eine mittlere 1D Verbreitung konstante 10,5 ± 0,7 (Standardfehler) M (bp- 2/s) bei neutralem pH 11. Eine gute Negativkontrolle ist beschriftete Proben von Interesse in Testpuffer in einem Kanal zu messen, die hat keine DNA angebunden, wo keine Diffusion auf DNA-Aktivität erkannt werden sollten.
5. Datenanalyse:
Hinweis: eine benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software wird verwendet, um die Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen Verbreitung Konstanten. Diese Software ermittelt zunächst Zentroid Positionen der einzelnen Partikel mit hoher Genauigkeit, Partikel, die auf das Deckglas Oberfläche geklebt sind identifiziert und dann links Partikel in verschiedenen Frames Time-Lapse Trajektorien bilden. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten geschätzt.
- Zur Datenanalyse zu starten, öffnen Sie eine scripting Software (siehe Tabelle der Materialien) und gehen Sie zum Verzeichnis der einzelnen Partikel tracking-Software. Öffnen Sie das Skript mit dem Namen " largedataprocess3.m ". Ein wichtiger Parameter definiert werden, ist der Schwellenwert für einzelne Partikeldetektoren.
- Zu bestimmen, die optimale Schwellwert, laufen die " Determine_threshold_value.m " Skript. Dieses Skript zeigt wie der Schwellenwert einzelner Partikeldetektoren auswirkt. Nach der Bestimmung des optimalen Schwellenwerts, laufen die " largedataprocess3.m " Skript
- Nach Abschluss der einzelnen Partikels tracking-Analyse, filtern die rohen Flugbahnen durch Ausführen der " Trajectory_filtering.m " Skript. Eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) basiert der Filterung Schritt zu visualisieren.
- Auf die GUI-Panel setzt die minimale Verschiebung entlang DNA, MinXDisp, auf 2 Pixel soll die maximale Verschiebung quer zur DNA, MaxYDisp, 2 Pixel die minimale Anzahl der Frames, MinFrames, auf 10 festgelegt; minimale Anzahl der Staaten von Triplett, MinTriplets, um 10; Geben Sie die minimale Diffusion konstante entlang DNA, D_par, 0; Geben Sie die maximale geschätzte Verbreitung Konstante, DNA, D_trans, auf 10 M (bp 2) S -1 quer; der minimale statistische Parameter, Chi 2 _stat auf-5 festgelegt; Legen Sie das minimale Verhältnis der Verschiebung entlang der DNA, die quer zur DNA, MinX/Y, 2.
Hinweis: Alle rohe Flugbahnen, die diese Filterung Parameter übergeben sind in Tabelle 1 aufgeführt, und diejenigen, die nicht in Tabelle 3 aufgeführt sind. - Klicken Sie auf eine Flugbahn Nummer in der Tabelle 1, die Flugbahn wird in Grafik 1 verdrängt & 2. Klicken Sie auf die " Play " der rohen Fluoreszenzbilder abzuspielen. Klicken Sie auf die " Add_to_Table2 ", die Flugbahn als ein einzelnes Molekül Schiebe-Flugbahn zu identifizieren. Am Ende werden alle Trajektorien zu Tabelle2 hinzugefügt gespeichert werden, beim Schließen der GUI.
- , Berechnen Sie die durchschnittliche Verbreitung konstanten, führen Sie das Skript " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Die durchschnittliche Verbreitung konstante beläuft sich aus der Menge der Flugbahnen, die haben alle Filter Schritte bestanden und wurden hinzugefügt, Tabelle 2.
Representative Results
Abbildung 2a zeigt die erkannten Flugbahnen der pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B ist konjugiert, die Cystein-Reste) Moleküle diffundieren auf DNA in 2 mM NaCl-Puffer bei pH 6,5. Die Verbreitung von pVIc ist Bi-direktional und getrieben von ambient Wärmeenergie. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten (D1-Werte) für jede Trajektorie geschätzt (siehe das Histogramm in Abbildung 2 b). Der Mittelwert D1 Wert dieser pVIc Konjugat ist sein 22,2 ± 0,9 (Standardfehler) M (bp2/s) von durchschnittlich jeder D1-Wert über Flugbahnen gewichtet nach der Anzahl der Triplett aufeinander folgende Position Forderungen in jeder Bahn berechnet.
Abbildung 1 : Vorrichtung zum Verfolgen von Bewegung der einzelnen Moleküle entlang DNA.
(a) eine achtkanalige PDMS Mikrofluidik-Chip eingehalten einem funktionalisierten Deckgläschen auf die DNA kann angebunden werden, (mit USA Viertel für Skala Münze); (b) fließen Sie Zelle Zoom Schaltplan zeigt Fluss-gestreckten λ-DNA-Moleküle; (c) schematische Darstellung der TIRF Mikroskop und Flutsystem zur Dehnung DNA; (d) TIRF Bild der Flow-gestreckten λ-DNA; (e) TIRF Bild der pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B ist konjugiert, die Cystein-Reste) Moleküle gebunden an einen Fluss gestreckt λ-DNA. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis2,12geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Eindimensionale Diffusion von pVIc (GVQSLKRRRCF) entlang DNA.
(a). Verbreitung der pVIc entlang erstreckte sich λ-DNA (137 Trajektorien) in 2 mM NaCl-Puffer bei pH 6,5. x(t) und y(t) sind die Verschiebungen entlang und quer zur λ-DNA. Gepunktete horizontale Linien zeigen fehlende Punkte aus Farbstoff zu blinken. (b). Histogramm der Diffusion Konstante, D1 für pVIc diffundieren entlang λ-DNA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Beim Umschalten von der traditionellen zweistufigen Deckglas Funktionalisierung Reaktion Protokoll auf eine einstufige Reaktion Protokoll, bemerkten wir, dass die Zuverlässigkeit des Deckglases Funktionalisierung deutlich verbessert wird. Wie die praktische Gesamtzeit für Deckglas Vorbereitung weniger als 30 min ist, empfehlen wir bereitet frische Deckgläsern jeden Tag Einzelmolekül-Bildgebung geplant ist. Um die Verschlechterung von Silan-PEG-Biotin zu minimieren, sollte das Reagenz regelmÄÑig und abgelegt unter N2 Trockengas bei-20 ° C nach Erhalt. Hier verwenden wir keine PEG-Moleküle, die produzieren -COO– oder -CH3 terminal Gruppen, die in den letzten20verwendet wurden. Die negativen Ladungen von -COO– und die hydrophoben -CH3 Gruppen wurden genutzt, um unspezifische Adsorption von DNA-Molekülen und spezifische Proteinproben bzw. an die Oberfläche zu verhindern. Wir beobachten sehr geringe Oberfläche Adsorption von kleinen Peptid Proben auf der Biotin-terminierte PEG Oberfläche, während Silan-PEG-COOH und/oder Silan-PEG-CH3 für Tests von bestimmten Proteinproben nützlich sein könnte oder wenn Bedingungen Test (z.B. pH < 7,5) Förderung der DNA-Oberflächen-Wechselwirkungen.
Die Verlagerung von Glas-Folie-Durchflusszellen PDMS Flow Zellen beschleunigt den Fluss Zelle-Bau und ermöglicht die einfache Integration von mehreren Kanälen. Oft konstruieren wir acht Kanäle pro Durchflusszelle acht unabhängige Experimenten pro funktionalisierten Deckglas zu ermöglichen. Durchsatz pro Deckglas weiter zu steigern, könnte sogar größere Anzahl von Mikro-fabrizierten Kanäle verwendet werden.
Es ist ratsam, zu verhindern, dass Luft Blasenbildung im Inneren des Kanals zu jedem Zeitpunkt nach der Erstbefüllung. Luftblasen verursachen in der Regel keinen Verlust der gefesselte DNAs (obwohl dies möglich ist), sondern eher Fluss gestört und möglicherweise verursachen DNAs an das Deckglas halten. Puffer Entgasung und die Zugabe von kleinen Tensid Mengen sind in der Regel wirksam verhindern Blasenbildung innerhalb der Schläuche und Flow-Kanal. Versuchen Sie in Fällen, wo Luftblasen in das Rohr eingeführt werden, die Bläschen unter eine langsame Strömung durchspülen und stellen Sie sicher, dass sie nicht durch die Region fließen wo DNAs angebunden sind.
Eine schlanke und effiziente Datenanalyse-Software ist von entscheidender Bedeutung, durch die riesige Menge an Daten generiert. Wir sammeln in der Regel 700.000 hochauflösende Bilder von Messungen auf einer Messzelle, die unsere benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software innerhalb eines Tages auf einem Desktop-Computer mit einem Quadcore-Prozessor und 32 Gb Speicher verarbeitet werden können. False-positive-Rate 1D Verbreitung Flugbahnen von der Software (Schritt 5.5) zu erkennen ist Probe abhängig und kann ziemlich niedrig da: 1) die Dichte der einzelnen Partikel in das Blickfeld ist niedrig genug, so dass es etwas Mehrdeutigkeit Teilchen ganz Frames (verbindet Proteinproben sind im Allgemeinen anfälliger für unspezifische Adsorption auf das Deckglas als Peptid Proben, und somit der Puffer und die Leistungsdichte für jedes Protein probieren muss optimiert werden); (2) das Signal Rauschabstand von einzelnen Partikeln ist hoch genug, so dass die Wahrscheinlichkeit falsch-Identifikation der Partikel gering ist. Doch die Software kann gelegentlich Fehler machen, und wir empfehlen manuelle Inspektion der Daten mit dem mitgelieferten GUI zur Bewertung der Softwareleistung. In einer Anwendung, die besonders empfindlich auf falsch-Positive Flugbahn Erkennung Prozess-Parameter einschließlich der Schwellenwert, MinFrames, MinTriplets und Chi2_stat stringenter auf Kosten der geringeren Empfindlichkeit für wahre Bindung einstellbar Veranstaltungen und potenziell höhere statistische Verzerrungen bei der Flugbahn Identifikation. Wir hier teilen und unsere Einzelkorn-Tracking-Software mit der Hoffnung auf Hilfe für Daten-Analyse-Methoden zu standardisieren und zur Diskussion über best Practices zu beschreiben.
In unserem Protokoll, die kontinuierlichen Fluss erfordert während der Bildgebung um den gestreckten Zustand der DNA Schablone Moleküle zu erhalten, könnte der Flüssigkeitsströmung den Transport einiger Proteine entlang DNA-Templates bias, wenn sie durch einen hopping-Mechanismus diffundieren oder der hydrodynamischen Radius der beschrifteten Fluorophor ist große22,23. Während solche Vorurteile gemessen und in die meisten Datensätze korrigiert werden kann, der Transport von Proteinen mit einer kleinen Fluorophore beschriftet und Verbreitung durch einen Schiebemechanismus ist nicht in der Regel voreingenommen nachweisbar Maße von Flow2,4, 24. Insbesondere wurde die Auswirkungen der Strömungsgeschwindigkeit auf den Transport von Proteinen entlang DNA verwendet, die Mechanismen der Verbreitung entlang DNA23Protein zu studieren. A eng im Zusammenhang mit alternativer Ansatz, die es Messungen in Ermangelung des Flusses ermöglicht nutzt DNA-Templates mit Biotin an beiden Termini, die vorübergehend im Fluss gestreckt sind und angebunden durch beide Enden auf dem Deckglas so, dass die DNA-Moleküle bleiben ein Erweiterte Konfiguration25,26,27,28der Strom ausgeschaltet ist. Die Doppel-Tether-Methode hat den Vorteil, dass strömungsfreien Transport Experimente aber erfordert eine Änderung der beiden Enden der DNA-Vorlage Moleküle, sorgfältige Flusssteuerung in Anbindehaltung und charakterisieren die Abstände zwischen den beiden Standorten angebunden. Darüber hinaus muss die Auswirkungen der heterogenen Spannungen und DNA Konformationsänderungen Dynamik über DNA-Moleküle auf der Einzelmolekül-Assay bewertet werden.
Insgesamt neben dem Studium 1D Diffusion von Molekülen entlang DNA, als berichtet Einzelmolekül-Assay profitieren viele in-vitro- biochemischen und biophysikalische Studien Ebene einschließlich DNA Einzelmolekül Ziel Suchprozesse durch Proteine, enzymatischen Aktivitäten auf DNA und mehr.
Fehlerbehebung
Problem 1: Die Strömungskanäle auslaufen.
Lösung: Stellen Sie zunächst sicher, dass die Gestaltung der Strömungskanäle mindestens 1,5 mm Rand zur Abdichtung rund um und zwischen den Kanälen ermöglicht; und dann, während der Montage der Messzelle, stellen Sie sicher, dass Kontaktflächen zwischen dem Deckglas, Doppel-Klebeband und PDMS-Platte sind flach, trocken und frei von Schmutz, dass der Druck angewendet, um die Dichtung zu bilden einheitliche, und der Schweißvorgang wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
Problem 2: Die Dichte der gefesselte DNAs ist zu niedrig.
Lösung: Dieses Problem entsteht, wenn die PEG Funktionalisierung Effizienz gering ist oder die DNA-Moleküle sind nicht mit Biotin funktionalisiert. Aus unserer Erfahrung, die Dichte der gefesselte DNA sollte so hoch für > 90 % von den Deckgläsern zubereitet aus frischen oder Silan-PEG-Biotin Reagens ordnungsgemäß gelagert. In Fällen wenn die Dichte der gefesselte DNA mit einem bewährten Batch von Biotin-λ-DNA niedrig ist, versuchen Sie, Steigerung der Konzentration von Silan-PEG-Biotin während PEG Funktionalisierung und Konzentrationen von Streptavidin und Biotin-λ-DNA während DNA Anbindehaltung. Wenn dies fehlschlägt, ersetzen Sie die PEG und Streptavidin Reagenzien.
Problem 3: DNAs halten Sie sich an das Deckglas eind kann nicht durch Strömung gedehnt werden.
Lösung: Dieses Problem kann auch entstehen, wenn die PEG Funktionalisierung Effizienz gering ist und wird durch niedrige Assay pH verschärft. Versuchen Sie fließt in mehr BSA oder Erhöhung des pH-Werts (zB auf 8.0) zu helfen, DNA-Adsorption an der Oberfläche (Schritt 4.3.2) zu unterdrücken. Wenn DNA-Adsorption eine anhaltende Problem unter einer bestimmten Assay-Bedingung ist, versuchen Sie auch bis zu 90 % Silan-PEG-COOH während PEG Funktionalisierung.
Daten-Analyse-Hinweise:
Wir verwenden benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software, um Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA, von identifizieren die ihre 1D Verbreitung konstanten, D1 geschätzt. Um die Datenanalyse zu verbessern, haben wir die radiale Symmetrie Algorithmus18 zur Lokalisierung der Partikel und der Kovarianz-basiertes Kalkulationstool19 für die Schätzung der 1D Verbreitung konstanten, die Datenanalyse ohne dramatisch beschleunigt Genauigkeit. Wir zuvor validiert die Individualsoftware durch die Analyse von simulierten Daten11. Die wichtigsten Schritte sind nachfolgend beschrieben.
Teilchenidentifikation:
Dieser Schritt ist für die Erkennung und Segmentierung Partikel - Beugung begrenzte Flecken - Hintergrund. Erstens räumlich Bandpass-filtern die Bilder verbessern das Signal von Partikeln im 3-5 Pixelbereich (entspricht der Größe der Point-Spread Funktion in unserem System) und dann Schwelle anhand der Intensität (siehe Skript: spt2_SD_sandbox.m).
Schwerpunkt-Zuordnung
Segmentierung des Bildes lokalisiert nur Moleküle auf Pixel-Ebene räumliche Auflösung. Um Moleküle zu viel höhere Präzision zu lokalisieren, beschäftigen Sie die radiale Symmetrie Superresolution Algorithmus18 Bilder gefiltert wie oben beschrieben. (Diese Methode basiert auf einer analytischen Berechnung und rechnerische Belastung im Vergleich zu anderen beliebten präzise Methoden wie 2D "glockenförmig" Montage erheblich reduziert (siehe Skript: spt2_SD_sandbox.m).)
Particle tracking:
Um die Flugbahn eines Teilchens durch die Zeit zu verfolgen, müssen wir die gleichen Partikel wieder erkennen, wie sie zwischen den Rahmen bewegen. Wir betrachten die Einleitung, blinken und Beendigung Stadien Komponenten eine Flugbahn. Wir beschränken die Verknüpfung der Partikel im aktuellen Frames für diejenigen, die in vorherigen Frames durch die maximale Verschiebung erlaubt pro Frame. In Fällen wo mehrere Verbindungen möglich sind, der Jonker-Volgenant-Algorithmus wird verwendet, um Global optimale Verknüpfung Sätze ergeben (siehe Skript: traceTraj4_kx.3.m).
D1-Einschätzung:
Um D1-Werte von Trajektorien abschätzen zu können, verwenden wir die Kovarianz-basierten Schätzer (CVE)19. Basierend auf eine analytische Berechnung, diese Methode ist mehr rechnerisch effizient und statistisch strenger als andere gängigen Methoden wie die Rückbildung der mittleren quadratischen Verschiebungen (siehe Skript: runspt5_SD.m).
Flugbahn zu filtern:
Einige Bahnen Artefakte wie Anbindung an Oberfläche gebundene Moleküle enthalten und müssen entfernt werden. Wir implementiert verschiedene Funktionen wie minimale Verschiebung parallel zur DNA, maximale Verschiebung quer zur DNA, minimale Länge der Flugbahn, minimale Anzahl von Triolen in Folge erkannt Positionen und minimale Wahrscheinlichkeitsergebnis (siehe Xiong Et al.,11 Definition), kann gefiltert werden, um einen minimal voreingenommene Satz von Trajektorien Moleküle diffundieren auf DNA dar zu isolieren (siehe Skript: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Broad Institute können wählen, Patentanmeldungen, die Aspekte der hier vorgestellten Arbeit enthalten.
Acknowledgments
Wir danken Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick und Evangelos Gatzogiannis für Unterstützung bei der anfänglichen Instrumentierung einrichten und testen. Wir danken weiter Tony Kulesa für bedeutende Hilfe schreiben und Bewertung der individuellen Einzelkorn-Tracking-Software. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Start und einen Karriere-Award auf der wissenschaftlichen Schnittstelle (PCB) von Burroughs Wellcome Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al.
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
