Summary
이 프로토콜에서는 간단 하 고 강력 하 고 높은 처리량 단일 분자 흐름 스트레칭 분석 결과를 1 차원 (1d) 확산 따라 DNA 분자의 공부에 대 한 보여 줍니다.
Abstract
우리는 간단 하 고 강력 하 고 높은 처리량 단일 분자 흐름 스트레칭 분석 결과 1 D 확산 따라 DNA 분자의 공부에 대 한 설명 합니다. 이 분석 결과에 유리 coverslips는 기능성 실 란-말뚝-biotin과 1 단계 반응에서. 흐름 세포는 미리 잘라 채널 기능성된 coverslip 및 입구와 출구 구멍을 포함 하는 PDMS 석판 사이 접착 테이프 사이 의해 구성 됩니다. 여러 채널은 하나의 흐름 셀에 통합 하 고 각 채널에 시 약의 흐름 자동화 될 수 있다 완벽 하 게,는 크게 분석 결과 처리량을 증가 하 고 분석 결과 당 실습 시간. 각 채널 내부 biotin-λ-DNAs는 표면에 움직일 하 고 층 류 흐름-스트레치는 DNAs에 적용 됩니다. DNA 분자는 뻗어 > 윤곽선 길이 서브의 80%는 공간으로 붙일 레이블된 분자의 바인딩 및 수송 활동 공부에 대 한 템플릿 확장. 단일 분자의 궤도 추적 경과 총 내부 반사 형광 (TIRF) 영상에 의해. Raw 이미지는 자동으로 단일 분자 DNA를 따라 확산의 궤적을 확인 하 고 그들의 1 D 확산 상수 추정을 간소화 된 사용자 지정 단일 입자 추적 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다.
Introduction
생물학에서 오랫동안 문제는 어떻게 내 생 단백질 특정 행동을 게놈에서 사이트 신속 하 게 생존 하 고 환경에 효과적으로 대응 유기 체에 대 한 그들의 DNA 목표를 찾을 수 있습니다. 지난 40 년 동안 연구 하 고 DNA의 활동 단백질에 의해 검색 대상 가설에 의해 가속 될 수 있다 지원 크게 촉진 된 유포는 단백질 대량에서 3D 보급와 번갈아 1 D 보급 (포함 슬라이딩 및 프로세스를 호핑) DNA1따라. 그것은 지금 많은 단백질 유전자 규칙, 핵 산 물질 대사, 및 기타 프로세스에 관련 된 DNA2,3,,45,6,7에 슬라이딩 할 수 있다 알려져 ,,89. 또한, 최근 연구 보고는 작은 펩 티 드 수 바인딩할; 화물을 운반 하는 기능, DNA에 슬라이드 예를 들어 단백질 분자 또는 DNA10,11,12,,1314따라 PCR 뇌관.
지난 15 년 동안 단일 분자 흐름 스트레칭 분석 결과 바인딩 및 DNA2,,1516함께 분자의 확산 연구를 널리 사용 되었습니다. 이 유형의 분석 결과에서 biotinylated 이중 가닥 DNA 분자는 표면에 움직일 수 및 층 류 흐름에 적용 됩니다 흐름 스트레칭 DNA. > 80% 뻗어 DNAs 서브 fluorophores로 표시 하는 분자의 바인딩 및 수송 활동 공부에 대 한 공간적 확장 템플릿으로 DNA 따라 단일 분자의 궤도 시간 경과 형광 영상에 의해 추적 됩니다. 재현성 및 사용의 용이성에 최적화 된 우리의 구현에서이 분석 결과 5 개의 주요 단계로 구성 됩니다: biotin-λ-DNA, coverslip 기능화, 흐름 셀 건설, 형광 이미징 및 데이터 분석의 준비. 이전 프로토콜17, 유리 coverslips 했다 공업화 첫 번째 반응 (3-Aminopropyl)와 triethoxysilane (항)에 의해 그리고 아민 반응 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 시 약 (예를 들어, 보 건국-말뚝-비오 틴) 저항 못 층을 형성 하 일반적인 흡착 coverslip 표면 구성 요소 분석 결과의. 기능성된 coverslips의 품질은 크게 못 시 약 및 반응 조건 각 단계에서의 품질에 의존합니다. 우리의 프로토콜 단순된 기능화 프로토콜 및 아무 액체 접착제 또는 경화 시간 날짜 흐름 셀에 조립 되는 다중 흐름 셀 건설에 설명 합니다. 우리 또한 간소 하 고 강력한 데이터 분석 절차11 중심 지역화18 및 공분산 기반 확산에 대 한 방사형 대칭 메서드를 적용 하 여 계산 집중적인 회귀 단계를 제거 하는 설명 일정 견적19.
여기, 우리 보고 간단 하 고, 강력한과 높은 처리량 단일 분자 스트레칭 분석 결과 구현 coverslip 기능화, 흐름 셀 건설 및 데이터 분석에 중요 한 개선 합니다. 특히, 우리는 깨끗 하 고 마른 coverslips silane-말뚝-biotin과 직접 반응 단계 coverslip 기능화 프로토콜을 개발 했다. 이 프로토콜 coverslip 준비를 단순화 하 고 표준 2 단계 반응 프로토콜에 비해 기능성 표면 품질의 안정성을 향상 시킵니다. 멀티 채널 PDMS 흐름 셀 강력한 튜브 연결 접착제 없이 만들 수 있도록 그래서 기능성된 coverslips 사용 하 여를 설명 합니다. 이러한 흐름 셀 추가 여러 컴퓨터 제어 후미 각 흐름 챔버에 대 한 설치 및 증가 분석 결과 처리량 동안 실습 시간을 줄이기 위해 자동된 시 약 흐름을 포함 합니다.
Protocol
1. biotin-λ-DNA의 준비
참고: Biotin-λ-DNA 분자는 5 biotin 표시 oligonucleotide ligating 준비 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20-비오 틴-3 '를 Λ-DNA 분자 20.
- 준비 0.1 m m biotin 테 버퍼에 올리고 표시.
- 60 65 ° C에서 열 0.5 mg/mL λ DNA 주식 s, 그리고 젖은 얼음 바로 뛰어들.
참고: λ DNA concatemerization 감소 빠른 냉각 냉각. - Microcentrifuge 튜브에 λ-DNA 솔루션의 피펫으로 100 µ L.
- 테 버퍼의 9 µ L로 0.1 m m oligo의 추가 1 µ L.
- Λ-DNA를 포함 하는 microcentrifuge 관을 올리고 솔루션의 추가 2 µ L. 철저 하 게 혼합.
참고: Oligo는 보완 λ-DNA 끝에 약 12-fold 어 금 니 과잉에. - 60 65 ° C에서 λ-DNA/올리고 혼합물이 열 s.
- 천천히 차가운 실내 온도에 혼합물.
참고:이 단계 보완 λ-DNA 끝에 anneal를 올리고 있습니다. - 얼음에 있는 혼합물을 놓습니다. T4 DNA 리가 반응 버퍼의 11 µ L 추가 (최종 버퍼 농도 1 x). 부드럽게 혼합. T4 DNA 리가 효소의 2 µ L (800 단위)을 추가 합니다. 부드럽게 혼합.
- 2 시간 또는 하룻밤 4 16 ° C에 대 한 혼합물을 품 어 ° c.
- 100 kDa의 공칭 분자량도 원심 필터 튜브를 사용 하 여 제품을 정화. 특히, 원심 필터 튜브와 5 분 14000 x g에서 원심 분리기로 단계 1.9 혼합물을 전송, 400 µ L TE 버퍼 두 번 세척 및 정제 제품 수집.
참고:는으로 정화 biotin-λ-DNAs 테 버퍼에는-20 ° C에서 안정적인 최대 1 년.
2. Coverslip 기능화
참고: 유리 coverslips는 기능성 실 란-말뚝-biotin 반응 하 여. 이 1 단계 반응이 프로토콜은 간단 하 고 신뢰할 수 있는 우리의 경험에서 표준 2 단계 반응 프로토콜 20 보다 더. Silane-말뚝-biotin과 Coverslip 기능화 streptavidin 바인딩 사이트 만들고 일반적인 DNA 및 단백질 흡착 coverslip 표면에 최소화.
- Sonicate 5 no. 1 coverslips 한 얼룩 내부 95% 에탄올에 10 분 동안 자 고 다음 세 번에 대 한 초순 수 린스.
참고: 다섯 번째 coverslip 파손 시 예비를 제공 합니다. - 얼룩 항아리 1 m 코, 10 분 동안 sonicate를 다음 세 번 초순 물으로 린스.
- 2.1-2.2 주기 두 번 반복.
- 건조 깨끗 하 고 마른 N 2 가스 흐름 아래 coverslips.
- 더 깨끗 하 고 건조 일 분에 대 한 900 mTorr의 압력에서 공기 플라즈마 처리를 적용 하 여 coverslips
- 25 mg/mL silane-말뚝-biotin 특별히 2 헤에 대 한 실 온에서 95% 에탄올에 용 해 된 coverslips를 품 어, 두 개의 깨끗 하 고 마른 coverslips, 사이 50 µ L silane-말뚝-biotin 솔루션 샌드위치와 coverslip 품 어 " 샌드위치 " (coverslips) 접촉 하지 하단에 물 약 10 mL와 함께 닫힌된 피 펫 팁 상자 안에 용 매 증발을 최소화 하기 위해.
- 씻어 초순을 못 코팅 아래 coverslips 청소와 초과 못 분자 N 2 가스 흐름 건조.
참고: 기능성된 coverslips 저장 될 수 있다 주위 조건 하에서 3 일.
3. 흐름 세포 건설
참고: 흐름 세포 사이 사이의 미리 잘라 채널 이중 접착 테이프에 의해 생성 되는 페그 기능성 coverslip 및 PDMS 슬 래 브 인 레트와 출구 구멍을 포함 하. 여러 채널은 흐름 세포 당 통합.
- CAD 소프트웨어에서 흐름 채널을 디자인 하 고 테이프 커터를 사용 하 여 이중 접착 테이프 (폭, 깊이, 각 채널의 길이 1, 0.13, 12 m m, 각각) 채널을 잘라 (일반적으로 8 채널은 통합 흐름 셀 당). 흐름 채널 테이프 오차 제거.
- PDMS 석판을 철저 하 게 혼합 5 g (12-5mm 두꺼운 PMDS 석판 주변 조건에서 무기한 저장할 수 수를 만들기 위한 충분) 가교 시 약의 PDMS의 45 g 2 10 cm 배양 접시에 혼합물을 부 어 믹서를 사용 하 여, 그리고 두고는 기본적으로 모든 공기 거품 때까지 진공 챔버 내부 요리가 사라 (수동으로 제거 공기 방울 어떤 요리는 진공 약 실에서 제거 될 때 남아 있는 경우). PDMS 굳은 (약 2 시간)까지 80 ° C 오븐에 요리 전송.
- 미리 잘라 채널 이중 접착 테이프의 크기와 일치 하는 PDMS 석판을 잘라. 껍질 1 보호 필름 이중 접착 테이프와 필름 PDMS 슬 래 브의 평평한 얼굴을 준수. 23 게이지 바늘 생 검은 구멍 펀칭기를 사용 하 여 PDMS 슬 래 브에 출구와 입구 구멍을 펀치.
- 껍질 이중 접착 테이프에서 두 번째 보호 필름 및 준수는 coverslip의 기능성 표면 PDMS 테이프 어셈블리 (는 coverslip 평평 있는지 확인 합니다. 그림 1a에서 완벽 하 게 조립된 흐름 셀의 그림 참조).
4. TIRF 이미징
참고: Biotin-λ-DNAs는 흐름 채널 표면에 닿는 곳에 및 층 류 흐름에 적용 됩니다 흐름 스트레칭 DNA 분자 ( 그림 1b). > 80% 붙일 레이블된 분자의 바인딩 및 수송 활동을 관찰에 대 한 공간적 확장 템플릿으로 DNA 분자 서브를 뻗어. 단일 분자의 궤도 추적 경과 TIRF 이미징 하 여 ( 그림 1 c & e).
- 0.2 mg/mL streptavidin 솔루션, 1 mg / mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션 및 각각 Tygon 튜브 솔레노이드 값에 연결 되어 있고 다른 Tygon 튜브 작은 픽 튜브 (이상 Tygon 튜브를 sleeving 여 엿 봄 배관에 연결 된 4 개의 저수지로 100 오후 biotin-λ-DNA 솔루션 시 약의 역류 방지). 진공에 하룻밤 노출 또는 진공 교 반 (때까지 거품이 더 이상 볼 수 없습니다)와 짧은 노출에 의해 버퍼의 작은 볼륨 드.
- 흐름 0.2 mg/mL streptavidin 솔루션, 5 분 동안 품 어 하 고 다음 언바운드 streptavidin를 빈 버퍼에서 흐름.
- 흐름 1 mg/mL BSA 솔루션에 1 분 동안 품 어 그리고 다음 언바운드 BSA를 빈 버퍼에서 흐름.
참고: 추가 BSA 억제 DNA 및 샘플 표면에 흡착. - 흐름 100 오후 biotin-λ-DNA 솔루션, 10 분 동안 품 어 고 다음 언바운드 DNAs를 빈 버퍼에서 흐름.
참고: DNA 표면에 바인딩되어, 후 방지 테더 DNA 분자에 손상을 방지 하기 위해 빠른 흐름.
참고: 기능성된 coverslip의 품질은 일반적으로 좋은 하 고 뻗어 흐름 DNA 분자의 밀도 높을 것 이다. DNA 바인딩 및 슬라이딩/1 D 보급 이벤트를 관찰할 수 있다 흐름 뻗어 DNA 분자의 높은 밀도가지고 필수적입니다.
참고: 흐름 속도 Weissenberg 수와 동일 (Wi: 긴 폴리머 휴식 시간-약 0.2의 치수 제품 λ-DNA-고 전단 속도-coverslip 표면에서 거리와 흐름 속도 변화에 대 한 s) 안으로 500의는 채널 100 Hz 21의 프레임 속도와 단일 분자 이미징에 대 한 것이 좋습니다.
- .
참고: 한 FOV에 단일 입자의 밀도 이어야 한다도 너무 높은-는 DNA에 단일 분자 이벤트의 낮은 발생으로 이어질 수 있습니다 모호 하거나 너무 낮은-프레임 개체 할당 함으로써 데이터 분석을 복잡 하 게 합니다.
참고: 우리가 일반적으로 사용 하 여 200-800 W/c m 2 전력 밀도 FOV에.
참고: 좋은 긍정적인 컨트롤은 tetrapeptide, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR는 N 맨끝 아민에 결합)는 10.5 ± 0.7 (표준 오차) M의 평균 1 일 확산 상수는 (bp 2/s) 중립 pH 11에서. 좋은 부정적인 제어 채널을 아무 DNA에 DNA 보급 활동이 탐지는 곁에 분석 결과 버퍼의 레이블된 샘플을 측정 하는.
5. 데이터 분석:
참고: 사용자 지정 단일 입자 추적 소프트웨어는 단일 분자 DNA를 따라 확산의 궤적을 확인 하 고 확산 상수를 추정 하는 데 사용 됩니다. 이 소프트웨어는 먼저 높은 정확도 가진 단일 입자의 중심 위치 coverslip 표면에 붙어 입자를 식별 하 고 다음 시간 경과 궤도를 다른 프레임에 입자를 링크를 결정 합니다. 이러한 궤도에서 1 D 확산 상수 추정 됩니다.
데이터 분석 시작 스크립트 소프트웨어를 열고를- (재료의 표 참조) 단일 입자 추적 소프트웨어의 디렉토리에가 서. 라는 스크립트를 열고 " largedataprocess3.m ". 정의 되어야 한 중요 한 매개 변수는 단일 입자 검출을 위한 임계값 값.
- 최적의 임계값 값을 확인 하려면 실행 된 " Determine_threshold_value.m " 스크립트. 이 스크립트는 임계값 값 단일 입자 감지에 미치는 영향을 나타낼 것 이다. 최적의 임계값 값을 결정 한 후 실행에 " largedataprocess3.m " 재구현
- 단일 입자의 완료 후 분석, 추적 필터링 원시 궤적 실행 하 여는 " Trajectory_filtering.m " 스크립트. 필터링 단계를 시각화 하기 위해 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 만들어집니다.
- GUI에 패널, 2 픽셀에 따라 DNA, MinXDisp, 최소 변위를 설정, 최대 변위 가로 dna, MaxYDisp, 2 픽셀로 설정, 10 프레임, minFrames, 최소 수를 설정, 세 개, minTriplets의 국가의 최소 수를 설정 10; 0; DNA, D_par에 따라 최소한의 확산 상수 설정 설정 최대 예상된 확산 상수 가로 dna, D_trans, 10 M (bp 2) S -1; -5; 치 2 _stat, 최소한의 통계 매개 변수 설정 2 dna, 할 망 구/Y, 그 가로 DNA 따라 변위의 최소 비율 설정.
참고: 이러한 매개 변수를 필터링을 통과 하는 모든 원시 궤도 표 1에 나열 되 고 하지 않는 표 3에 나열 된. - 클릭 궤적에 번호 표 1에, 궤적 그래픽 1에 전치 될 것입니다 & 2. 클릭은 " 재생 " 원시 형광 이미지를 재생 하는 버튼. 클릭은 " Add_to_Table2 " 단일 분자 궤도 슬라이딩으로 궤적을 확인 하. 결국, 모든 궤도 테이블 2에 추가 저장 됩니다 GUI를 닫을 때.
- 의미 확산 상수를 계산 하는 스크립트 실행 " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". 말은 확산 상수 모든 필터링 단계를 통과 하 고 표 2에 추가 된 궤도의 세트에서 추정 된다.
Representative Results
그림 2a 보여준다 pVIc Cy3B의 감지 된 궤도 (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B는 시스테인 잔류물에 활용 된) 2 m NaCl DNA에 확산 하는 분자는 pH 6.5에서 버퍼. PVIc의 보급은 양방향 주변 열 에너지에 의해 구동. 이 궤도에서 1 D 확산 상수 (D1 값)은 각 궤적에 대 한 추정 ( 그림 2b에서 막대 그래프 참조). D1 값이 pVIc 공액의 평균 궤도 triplet 연속 위치 호출 각 궤도에 포함 된 수에 의해가 중에서 22.2 ± 0.9 (표준 오차) M (bp2/s) 각 D1 값을 평균 하 여 계산 됩니다.
그림 1 : DNA에 따라 단일 분자의 움직임을 추적 하기 위한 기구.
8-채널 PDMS)는 미세 칩을 DNA (규모에 대 한 미국 쿼터 동전)와 닿는 수; 기능성된 coverslip 준수 b) 흐름 셀 줌 회로도 보여주는 흐름 뻗어 λ-DNA 분자; c) DNA; 스트레칭 TIRF 현미경과 흐름 시스템의 회로도 d) TIRF 이미지의 흐름 뻗어 λ-DNA; pVIc-Cy3B의 e) TIRF 이미지 (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B는 시스테인 잔류물에 활용 된) 분자 흐름 뻗어 λ DNA에 바인딩된. 이 그림은 권한2,12수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : DNA에 따라 pVIc (GVQSLKRRRCF)의 1 차원 확산.
a). 흐름을 따라 pVIc의 보급 pH 6.5에서 2 mM NaCl 버퍼에 λ-DNAs (137 궤적)을 뻗어. x(t) 및 y(t)은 각각 치환 따라와 λ-DNA를 통과. 수평 점선된 라인 깜박이 염료에서 발생 누락 포인트를 나타냅니다. b). 히스토그램의 확산 상수, λ DNAs 따라 확산 하는 pVIc에 대 한 d 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
1 단계 반응 프로토콜을 전통적인 2 단계 coverslip 기능화 반응 프로토콜에서 전환할 때 우리는 coverslip 기능화의 안정성이 크게 향상 됩니다 것으로 나타났습니다. Coverslip 준비에 대 한 총 실습 시간 30 분 미만으로, 계획은 각 주 단일 분자 이미징 신선한 coverslips를 준비 하는 것이 좋습니다. Silane-말뚝-비오 틴의 저하를 최소화 하기 위해 시 약 aliquoted 및 접수-20 ° C에서 건조 N2 가스 아래 저장 해야 합니다. 여기 못 분자-- 쿠를 생성 하는 또는 과거20에 사용 된 채널3 터미널 그룹을 사용 하지 마십시오. -- 쿠 그룹 및 소수 채널3 그룹의 부정적인 요금 각각 표면에 DNA 분자와 특정 단백질 샘플의 일반적인 흡착을 방지 하기 위해 활용 했다. 우리 완전히 biotin 종료 말뚝 표면에 작은 펩 티 드 샘플에 의해 매우 낮은 표면 흡착 관찰 실-말뚝-COOH 또는 silane PEG 채널3 특정 단백질 견본의 분석에 유용할 수 있습니다 또는 때 시험의 조건 (pH 등 < 7.5) DNA-표면 상호 작용을 촉진 합니다.
PDMS 흐름을 유리 슬라이드 흐름 셀에서 shift 셀 속도 흐름 셀 구조를 하 고 여러 채널의 쉬운 통합을 허용 한다. 우리는 종종 기능성된 coverslip 당 8 개의 독립적인 실험 수 있도록 흐름 셀 당 8 채널 엔지니어. Coverslip 당 처리량을 더욱 높이기 위해 마이크로 조작 채널의 더 큰 숫자를 사용할 수 있습니다.
그것은 초기 작성 후 언제 든 지 채널 내부 공기 거품 형성을 방지 하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 기포 발생 하지 않는 테더 DNAs의 손실 (비록 이것이 가능), 하지만 오히려 흐름을 방해 하 고 가능성이 발생할 DNAs는 coverslip에 충실. 버퍼 degassing 및 작은 계면 활성 제 수량 추가 일반적으로 튜브와 흐름 채널 내의 거품 형성 방지에 효과적입니다. 어디 공기 방울 튜브를 도입 하는 경우에 하려고 느린 흐름에서 밖으로 거품을 제거 하 고 그들이 DNAs는 테더 링 하는 영역을 통해 흐름 하지 않습니다 있는지 확인 합니다.
간소 하 고 효율적인 데이터 분석 소프트웨어는 생성 된 데이터의 엄청난 금액으로 인해 중요 한. 우리가 일반적으로 우리의 사용자 정의 단일 입자 쿼드-코어 프로세서와 32 Gb 메모리와 데스크톱 컴퓨터에 1 일 안에 추적 소프트웨어를 사용 하 여 처리할 수 있는 하나의 흐름 셀에 측정에서 700000 고해상도 이미지를 수집 합니다. 소프트웨어 (단계 5.5) 1 D 확산 궤적을 탐지의 거짓 긍정적인 평가 샘플 종속 이며 주어진 매우 낮은 수: 1)는 FOV에 단일 입자의 밀도 충분히 낮은 프레임 (전체 입자를 연결 하는 작은 모호성이 단백질 견본 일반적 펩 티 드 샘플 보다는 coverslip로 일반적인 흡착 하는 경향이 있으며 따라서, 버퍼 및 각 단백질에 대 한 전력 밀도 샘플 최적화가 필요); 2) 단일 입자의 잡음 비율로 신호는 충분히 높은 입자의 false-식별의 가능성은 낮다. 하지만, 소프트웨어는 가끔 실수를 할 수 있습니다 그리고 소프트웨어 성능을 평가 하기 위해 제공 된 GUI를 사용 하 여 데이터의 수동 검사 것이 좋습니다. 허위-긍정 궤적 탐지에 특히 민감한 응용 프로그램 프로세스 매개 변수 임계값, minFrames, minTriplets, 및 치2_stat을 포함 하 여 설정할 수 있습니다 더 엄격 하 게 진정한 바인딩에 대 한 더 낮은 감도 비용 이벤트와 궤적 식별에 잠재적으로 큰 통계 편견. 여기에 우리가 공유 하 고 우리의 단일 입자 추적 데이터 분석 방법 표준화 및 모범 사례에 대 한 토론을 자극 도움의 희망으로 소프트웨어를 설명.
그들은 도약 메커니즘에 의해 확산 또는 이미징 DNA 템플릿 분자의 기지개 된 상태를 유지 하는 동안 지속적인 흐름을 요구 한다, 우리의 프로토콜에서 유체 흐름 DNA 서식 파일에 따라 어떤 단백질의 수송 바이어스 수는 유체 레이블이 fluorophore의 반지름은 큰22,23입니다. 이러한 바이어스 측정 하 고 대부분의 데이터 집합에서 수정 수 있습니다, 하는 동안 단백질의 수송 작은 fluorophore와 고 슬라이딩 메커니즘에 의해 확산 되지 일반적으로에 편향 되어 감지 범위 흐름2,4, 24. 특히, DNA에 따라 단백질의 수송에 흐름 속도의 영향 단백질 DNA23따라 확산의 메커니즘을 연구에 사용 되었습니다. A 밀접 하 게 관련 흐름의 부재에서 측정을 가능 하 게 다른 접근 활용 흐름에서 뻗어 뚜렷이 두 테르미니에서 biotin 서식 파일 DNA와 coverslip 등을 양 끝에 의해 곁에 DNA 분자에 남아 있는 확장된 구성 흐름25,26,,2728을 해제 한 경우. 이중 밧줄 접근 DNA 템플릿 분자, 밧줄, 및 두 테더 사이트 간의 거리 동안 주의 흐름 제어의 양쪽 끝을 수정 하지만 흐름 무료 전송 실험을 허용의 이점이 있다. 또한, 이기종 긴장과 단일 분자 분석 결과에 DNA 분자에서 DNA 구조적 역학의 영향을 평가 해야 합니다.
전부, 뿐만 아니라 공부 따라 DNA 분자의 1 D 보급, 단일 분자로 보고 분석 결과 많은 생체 외에서 생 화 확 적인 혜택을 받을 수와 DNA를 포함 한 단일 분자 수준에서 생물 연구 대상으로 하 여 검색 프로세스 단백질, 효소, DNA에 활동과 더.
문제 해결
문제 1: 흐름 채널 누출.
해결 방법: 먼저, 확인 하십시오 그 흐름 채널의 디자인 적어도 1.5 m m 마진 씰링 및 채널; 사이 다음, 흐름 셀의 조립 하는 동안 확인는 coverslip, 이중 접착 테이프와 PDMS 슬 래 브 사이의 접촉 표면은 평면, 건조 하 고 잔해, 물개를 형성 하는 압력은 균일, 무료 하 고 씰링 작업 실 온에서 수행.
문제 2: 테더 DNAs의 밀도 너무 낮은.
해결 방법:이 문제 못 기능화 효율은 낮은 또는 DNA 분자는 하지 기능성 비타민 b 복합체와 때 발생 합니다. 우리의 경험에서 속박 되 DNA의 밀도 높은 해야 합니다에 대 한 >는 coverslips의 90% 신선한에서 준비 또는 제대로 silane-말뚝-비오 틴 시 약 저장. 경우에 때 속박 되 DNA의 밀도 biotin-λ-DNA의 입증 된 배치와 함께, DNA 테더 링 하는 동안 못 기능화와 streptavidin과 비오 틴-λ-DNA의 농도 중 실-말뚝-비오 틴의 농도 증폭 시도. 이 실패 하는 경우이 고 streptavidin 시 약 교체 합니다.
문제 3: DNAs는 coverslip에 충실 한d 흐름으로 신축 할 수 없습니다.
해결 방법: 못 기능화 효율 낮은, 낮은 분석 결과 pH에 의해 악화 됩니다 때이 문제가 발생도 수 있습니다. 시도 더 BSA에 흐르는 또는 DNA (4.3.2 단계) 표면에 흡착을 억제할 수 있도록 pH (8.0)에 예를 올리는. DNA 흡착 특정 시험 조건 하에서 지속적인 문제는를 포함 하 여 90 %silane-말뚝-COOH를 못 기능화 동안 보십시오.
데이터 분석 참고 사항:
사용자 지정 단일 입자 추적 소프트웨어를 사용 하 여 단일 분자에서 DNA를 따라 확산의 궤적을 식별 하는 우리는 그들의 1 D 확산 상수, D1 추정. 데이터 분석, 개선 하기 위해 우리가 구현 입자 및 극적으로 타협 하지 않고 데이터 분석 빨라 1 D 확산 상수 추정을 위한 공분산 기반 견적19 지역화에 대 한 방사형 대칭 알고리즘18 정확도입니다. 우리는 이전11시뮬레이션 된 데이터 분석 하 여 사용자 지정 소프트웨어를 검증. 아래는 주요 단계를 설명 합니다.
입자 식별:
이 단계는 검색 및 입자-회절 제한 된 관광 명소-배경에서 세그먼트입니다. 첫째, 공간 대역 통과 필터링에 3-5 픽셀 범위 (는 우리의 시스템에 포인트 확산 함수의 크기에 해당) 다음 임계값 강도에 따라 입자의 신호를 향상 시키기 위해 이미지 (스크립트 참조: spt2_SD_sandbox.m).
중심 할당
픽셀 수준의 공간 해상도를 분자 localizes만 이미지를 세그먼트. 훨씬 더 높은 정밀도로 분자를 지역화 하려면 위와 같이 방사형 대칭 슈퍼 해상도 알고리즘18 이미지 필터링을 사용 합니다. (이 분석 계산 기반 방법과 크게 2D 가우스 피팅 등 다른 인기 높은 정확도 방법과 비교해 계산 부담 감소 시킨다 (스크립트 참조: spt2_SD_sandbox.m).)
입자 추적:
그들은 프레임 간의 이동 시간을 통해 입자의 궤적을 추적, 우리는 다시 동일한 입자를 식별 해야 합니다. 우리는 궤적의 구성 요소를 시작, 깜박임, 및 종료 단계를 고려 하십시오. 우리는 현재 프레임 이전 프레임에 프레임 마다 허용 하는 최대 변위에 의해 나타나는 그 입자의 결합을 제한 합니다. 여러 연계 가능한 경우에서 Jonker Volgenant 알고리즘을 세계적으로 최적의 링크 세트를 사용 (스크립트 참조: traceTraj4_kx.3.m).
D1 추정:
궤도에서 D1 값을 추정, 우리 공 기반 견적 (CVE)19을 사용 합니다. 분석 계산을 바탕으로,이 방법은 계산 더 효율적 이며 통계적으로 다른 보다 엄격한 통용 평균 제곱된 변위의 회귀 같은 방법 (스크립트 참조: runspt5_SD.m).
궤적 필터링:
일부 궤도 표면 바인딩된 분자 결합 등의 아티팩트를 포함 하 고 제거 해야 합니다. 우리 DNA, dna, 궤적, triplet 연속 감지 위치 및 최소 확률 점수 (참조 Xiong 외11의 최소한의 최소한의 길이 가로 최대 변위를 병렬 최소 변위와 같은 여러 기능을 구현 정의 대 한) 그 궤적을 나타내는 분자 DNA에 확산 가능성이 최소한 편견된 집합을 필터링 할 수 있습니다 (스크립트 참조: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
광범위 한 연구소는 여기에 제시 된 작품의 측면을 포함 하는 파일 특허 응용 프로그램을 선택할 수 있습니다.
Acknowledgments
우리 초기 계측 설치 및 테스트에 대 한 토니 Kulesa, 로빈 캠프 및 Evangelos Gatzogiannis 감사합니다. 우리는 더 상당한 도움 작성 하 고 평가 하는 소프트웨어를 추적 하는 사용자 지정된 단일 입자에 대 한 토니 Kulesa을 감사 합니다. 이 작품 시작 자금과 경력 수상 버로우즈 Wellcome 재단에서 (PCB)에 과학적인 인터페이스에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
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