Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ячеечная модель культуры сопротивления артерий

Published: September 8, 2017 doi: 10.3791/55992
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 3, 1,2
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

Summary

Описан ячеечная модель культуры сопротивления артерий, позволяя для рассечения сигнальные пути в эндотелия, гладких мышц, или между эндотелия и гладкой мускулатуры (myoendothelial-Джанкшн). Избирательное применение агонистов или белка изоляции, электронной микроскопии, иммунофлюоресценции могут быть использованы с помощью этой модели культуры клеток.

Abstract

Myoendothelial соединения (меж), уникальный сигнализации microdomain в артериях сопротивления малого диаметра, экспонаты локализации специфических белков и сигнальных процессов, которые можно контролировать тонус сосудов и кровяного давления. Как это проекция либо из клеток эндотелия и гладкой мускулатуры и из-за его небольшой размер (в среднем, площадь ~ 1 мкм2), меж трудно изучать в изоляции. Однако мы разработали модель культуры клеток называется Сопредседатель культуры клеток сосудистой (VCCC), которая позволяет в vitro меж формирования, эндотелиальных клеток поляризации и рассечение сигнализации белков и процессов в стенке сосудистого сопротивления артерии. VCCC имеет множество приложений и могут быть адаптированы с учетом различных типов клеток. Модель состоит из двух типов клеток, выращиваемых на противоположных сторонах фильтра с 0,4 мкм поры, в которые в пробирке MEJs могут образовывать. Здесь мы опишем, как для создания VCCC через покрытие клеток и изоляции эндотелия, меж и гладких мышц фракции, которые затем могут быть использованы для изоляции белка или деятельность анализов. Фильтр с нетронутым клеток слои могут устанавливаться, встраиваемых и секционного для immunofluorescent анализа. Важно отметить, что многие из открытий от этой модели были подтверждены с помощью нетронутыми сопротивления артерий, подчеркивая ее физиологической значимости.

Introduction

В артериях сопротивления малого диаметра тонкой внутренней упругой пластинки (IEL) отделяет эндотелия (ЕК) и гладкомышечные клетки (SMC). Клетки могут проекта через отверстия в этом эластичной матрице и устанавливают прямые соединения цитоплазматических через разрыв соединения каналы1,2. Эта уникальная структура называется перекрестка myoendothelial (меж). МЕЖ-это небольшой (примерно 0,5 мкм x 0,5 мкм, в зависимости от сосудистого русла), сотовой проекция состоит преимущественно из эндотелиальных клеток, но могут происходить из гладких мышц, а также3,4. Ряд исследователей продемонстрировали огромную сложность сигнальной сети, которые происходят выборочно на меж, делает его особенно важное место для содействия двунаправленной передачи сигналов между эндотелия и гладкой мускулатуры5 ,6,,78,9,10.

Однако механистических рассечение сигнальных путей на меж трудно в артерии, нетронутыми. Потому что меж проекцию сотовый, это не возможно в настоящее время изолировать в vivo меж от сосудистой стенки. По этой причине была разработана модель VCCC1 . Важно отметить, что VCCC реплицирует физиологических эндотелиальной морфология11 и поляризации сигнализации между апикальной и меж части клетки12. Именно эта уникальная модель, которая облегчает открытие, альфа-гемоглобина в эндотелиальных клеток, поляризованных меж. Это в отличие от условно культивировали эндотелиальных клеток, которые не выражают альфа-гемоглобин13. Для исследователей, заинтересованных в микрососудистой эндотелия она может быть более целесообразно использовать эндотелиальных клеток, которые были культивировали в VCCC, особенно если цель состоит в том, чтобы вскрыть сигнальных путей, которые происходят в артериях сопротивления малого диаметра.

Использование прочные пластиковые вставки, содержащий фильтр с малого диаметра поры (0,4 мкм в диаметре) для совместного культуры двух типов различных клеток предотвращает клетки мигрируют между слоями. Это приводит к 10 мкм расстояние между клетками, которые значительно больше, чем в естественных условиях, но по-прежнему реплицирует многие из характеристик в vivo MEJs, включая локализация протеина и второй messenger сигнализации1 , 14. Кроме того, VCCC позволяет для ориентации клетки сигнализации через добавлением агонистов или антагонист конкретных клеточных отделения для конкретного типа. Например загрузка ЕК с BAPTA-AM в хелатной кальция и стимулирования РРХВ фенилэфрин14. В отличие от других описаний Сопредседатель культура модели15,16,,1718,19,20,21это обеспечивает Инструкция по изоляции отдельных фракций для мРНК и белков, включая собственный меж фракция в поры фильтра. Добавление этой методики VCCC позволяет для расследования конкретных изменений в мРНК локализации или транскрипции22, фосфорилирование белков12,23и активность белка12. Этой статье будет описано нанесение EC верхней части фильтра и SMC на дне, хотя возможна культура типы двух клеток в разных конформации11,18,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. покрытие клетки для VCCC

  1. культуры большой 225 см 2 фляги EC и SMC в стерильных условиях при 37 ° C, до 70-90% притока. Убедитесь, что используются более ЕС чем SMC; При использовании первичного человека EC и SMC, обычно 3 больших колбы ЕС с 1 большой эликсир SMC.
    1. Использовать первичные элементы на более низких проходы и не используйте мимо прохода 10. Выберите носитель культуры, основанные на клетки быть совместно культивируемых. Для первичного человека коронарной артерии EC используйте EBM-2 EC базальной СМИ с факторами роста EGM2 МВ. Для первичного человека коронарного SMC используйте SmBM SMC базальную СМИ с факторами роста SmGM-2. До использования с культивируемых клеток, добавить факторы роста в СМИ.
  2. Строительство 1 день VCCC: спрей Петри большой (150 мм) и крышки с дезинфицирующим средством (например, Cavicide) и вытереть бумажным полотенцем или безворсовой салфетки. Затем спрей Петри с 70% этанола (EtOH) и поместите их в вытяжку воздуха сухой.
  3. Открытие плиты пластины фильтра (см. Таблицу материалов) в стерильных условиях и пальто SMC сторону (дно фильтра) вставки с фибронектин решения. Сохраняя Вставка в предоставленной пластина 6-Ну, накапайте раствор фибронектин через сторону щели в нижней части плиты, убедившись, что нижней половины фильтра охватывает (не более 1 мл).
  4. После 30 мин лечения фибронектин раствором при комнатной температуре в капюшоне культуры клеток, возьмите вставок из плиты, вакуумные любое избыточное решение и инвертировать, поместив в нижней половине чистого Петри. Отложите в сторону. Будьте уверены, чтобы не мешать вставки мембраны фильтра при аспирации излишки раствора; этого можно избежать, нежно наклона пластины и вакуумировать решение у края вставки.
  5. Trypsinize 225 см 2 настой SMC с 3 мл раствора подогретым 2 X трипсина-ЭДТА, и после того, как клетки сняты с плиты, добавить 9 мл SMC СМИ для нейтрализации трипсина (3:1, СМИ: трипсин). Трансфер в конической трубки, смесь хорошо и пипетки 10 мкл на Горяева для определения количества клеток.
    1. Подсчитать количество ячеек в 5 x 5 коробок (т.е., 18), умножьте это на 10 000, чтобы получить количество клеток в 1 мл (180 000 человек). Затем умножьте на 12 мл (общий объем суспензии клеток, 2,16 млн SMC). Убедитесь, что есть достаточно SMC пластины желаемое количество скважин.
      Примечание: например, 1 также должны иметь 75.000 SMC и таким образом 18 скважин бы 1,35 млн всего SMC. Деление клетки 1,35 млн, необходимых 180 000 клеток в 1 мл, и это приводит в 7,5 мл суспензии клеток, которые будут необходимы для покрытия. Затем вычислите окончательный объем необходимых (18 скважин x 750 мкл = 13,5 мл). Таким образом, принять 7,5 мл суспензии клеток, доводят объем до 13,5 мл с подогретым SMC СМИ и перемешать хорошо.
  6. Плиты 750 мкл суспензии клеток, содержащих около 75000 SMC на нижней стороне каждого фильтра, стараясь не разлива любой из средств массовой информации и мобильные решения. Установите крышку на верхней и тщательно передачи Петри с вставками в инкубаторе при 37 ° C ночь.
    Примечание: Плотность оптимального клеток для других типов клеток нужно будет определяться эпирически.
  7. На 2 день, заполнить чистой 6-ну блюда с 2 мл свежего, подогретым SMC и средств массовой информации. Выньте пластины из инкубатора. Возьмите вставок, по одному и удалите СМИ, всасывания, затем место в 6-ну блюдо с SMC СМИ.
  8. Пальто противоположной стороне фильтра (EC стороне) с 1 мл 0,5% раствора говядину желатин для по крайней мере 30 минут при 37 ° с.
  9. Trypsinize flask(s) 2 225 см ЕС с 3 мл подогретым 2 X трипсина-ЭДТА (10 x, разбавленных в стерильных Дульбекко ' s PBS) раствор с нежный стук Фляга для того, чтобы поднять клетки от пластину.
    Примечание: Это может быть необходимо поместить флакон обратно в инкубатор при 37 ° C для 1-3 мин.
    1. Раз клетки снять пластину, добавить 9 мл EC СМИ для нейтрализации трипсина (3:1). Трансфер в конической трубки, бассейн вместе, смесь хорошо и пипетки 10 мкл на Горяева для определения количества клеток.
      1. Подсчитать количество ячеек в 5 x 5 коробок (т.е., 60), умножьте это на 10 000, чтобы получить количество клеток в 1 мл (600 000). Затем умножьте на 12 мл (общий объем суспензии клеток, EC 7,2 млн). Убедитесь, что есть достаточно ЕС для пластины желаемое количество скважин.
        Примечание: Примерно 360 000 ЕС требуются в колодец. Например 18 скважин требуют ЕС 6,48 млн. Деление клетки 6,48 млн, необходимых 600.000 ЕС на 1 мл, и это приводит в 10,8 мл суспензии клеток, которые будут необходимы для покрытия. Затем вычислите окончательный объем необходимых (18 скважин x 1 = 18 мл). Таким образом, принимают 10,8 мл суспензии клеток, доводят объем до 18 мл с предварительно разогретую EC СМИ и нежно ресуспензируйте.
  10. Пластина 1 мл 360000 ЕС на верхней стороне каждого вставка фильтра. Пусть клетки инкубировать спокойно при 37 ° C в течение 24 ч. заменить средство на 4 день. Урожай на день 5.

2. Заготовка фракций от VCCC

  1. выполнения изоляции в комнате 4 ° C и сохранить все документы на МКО.
  2. Имейте в виду количество отдельных вставок изоляции и добавить буфера lysis 50 мл трубки помечены меж (для изолированных фильтров). Пометьте два блюда 10 мм; один для ЕС и один для SMC.
  3. Настройка рекомендуется объем буфера lysis в зависимости от как концентрированный lysate необходимо; 15 вставляет, 500 мкл буфера lysis для меж трубки и 250 мкл на Петри блюдо.
  4. Работы с одним 6-ну пластины вставок в то время. Всасывания от среднего в капот культуры клеток, а затем транспорта в холодную комнату на льду
    Примечание: Приведенные ниже инструкции являются 1 Вставьте изоляции.
  5. Пипетки 10 мкл ПБС на стороне SMC вставки.
  6. Используйте ячейку стеклоподъёмника Наскребать вниз клетки в один конец вставки и передача клетки от стеклоподъёмника SMC Петри блюдо, которое имеет литического буфера в него.
  7. После того, как клетки стеклоподъёмника коснулась литического буфера в блюдо, не позволяют ему коснуться вставка фильтра до тех пор, пока она была полностью уничтожена и сушеная на бумажные полотенца. Повторите соскоб SMC фильтр по крайней мере один-два раза полностью удалить оставшиеся ячейки мусор SMC.
  8. Превратить Вставка течение и пипетки 10 мкл ПБС в стороне верхней/EC вставка фильтра. Повторите шаги 2.6 и 2.7 с скребок клетки и EC Петри.
  9. Собирать оставшиеся ячейки и PBS шлама со стороны ЕС фильтра с пипеткой и передачи EC Петри с буфера lysis. Будьте очень внимательны в соскоб клеток с обеих сторон фильтра, чтобы оставить минимальное загрязнение EC/SMC в меж дроби.
  10. Осторожно использовать скальпель вырезать фильтр с пластиковым вкладышем. Сделать это путем резки 70-80% от пластиковых и использовать пинцет, чтобы вытащить фильтр полностью от пластиковые вставки структуры. Установите фильтр в 50 мл Конические трубки помечены меж буфера lysis и обеспечить его сидит литического буфера и остается влажной.
  11. , Повторите изоляции, в группах по 6, пока не будут обработаны все вставок.
  12. Убедитесь, что различные группы хранятся в отдельных труб и блюда.
  13. Vortex 50 мл меж Конические трубки на полную силу для 15 s или пока хорошо не смешано. Удалите фильтры из меж конические с щипцами, перетаскивая их вдоль боковых стен трубки, чтобы оставить максимальное количество белков и жидкости в трубе. После этой точки, сбросить фильтры.
    14. Делать
  14. после того, как все фильтры были удалены из меж Конические трубки, Быстрый спин (10-15 s на Макс скорость ~ 16000 x g) в центрифуге тянуть все жидкости и белки в нижней части трубки. Передача содержимого меж трубки и ЕС и SMC Петри блюд в отдельный, меньшие пробирок.
  15. Дополнительно: Sonicate содержимое трубки меж/SMC/EC параметр 4 для трех 10 s импульсов на льду или гомогенизации аккуратно от руки.
  16. Центрифуг на Макс скорость (~ 16 000 x g) 15 мин на 4 ° C. Накапайте из супернатант и пробирного lysate для содержания белка, с помощью метода пробирного bicinchoninic.

3. Заготовки VCCC En Face иммунофлюоресценции

  1. на день 5 из VCCC инкубации, снимите вставки из инкубатора. Работая в капот культуры клеток, всасывания у SMC СМИ от каждого из нижней скважины вставить фильтр и промойте два раза с ПБС. Повторите с ЕС стороной.
  2. Ведение вставки, неповрежденным и в пластине, добавьте параформальдегида 4% (PFA) для 10-20 мин в комнате душевой 4 ° C на нежный шейкер. Вымойте обе стороны вставка фильтра с ПБС 5 минут и повторить два раза.
    Предупреждение: PFA токсичных и должны быть тщательно обработаны.
  3. Выполнения блокировки, первичных и вторичных инкубаций антитела в пластине, обеспечивая, что обе стороны фильтра хранятся в антитела + преграждая разрешение (9 мл PBS, 25 мкл Тритон X100, 50 мг альбумина bovine сыворотки, 500 мкл нормальной сыворотки)
  4. Установить фильтр на слайде, вырезать фильтр из пластиковые вставки с помощью скальпеля монтируется на ручку и место на слайде микроскопа с монтажа среднего.

4. Заготовки VCCC для поперечной иммунофлюоресценции

  1. на день 5 из VCCC инкубации, снимите вставки из инкубатора. Всасывания у средств массовой информации с обеих сторон вставка фильтра в капюшоне культуры клеток и промойте каждой стороне фильтра два раза с ПБС.
  2. Ведение вставки нетронутыми и в пластине 6-хорошо, добавить 4% PFA и инкубировать на ночь в комнате душевой 4 ° C на нежный шейкер и.
    Предупреждение: PFA токсичных и должны быть тщательно обработаны.

5. Встраивание VCCC для поперечной иммунофлюоресценции

  1. после фильтра вставки были исправлены примерно за 24 ч в 4% PFA, передачи до 70% EtOH для по крайней мере 24 часа, но до нескольких недель.
  2. Процесс фильтры на long (с ночлегом) работать на процессоре автоматизированной ткани. Использовать программу следующим образом: 70% парафина EtOH для 30 мин, 85% EtOH 30 мин, 95% EtOH 30 мин, 100% EtOH 30 мин, 100% EtOH 45 мин, 100% EtOH 45 мин, ксилол 30 мин, ксилол 30 мин, ксилол 45 мин, 60 ° C 30 мин, 60 ° C парафин 30 мин , 60 ° C парафин 45 мин
  3. После обработки, передачи собранного фильтры для внедрения станции в жидкий парафин, сохраняя фильтр в кассету.
  4. Удалить фильтр из кассеты, тщательно с использованием щипцов провести его только на краю. С ножницами, вырезать фильтр в два раза образуя два полукруг формы половинок. Положите 2 половин на холодную тарелку части внедрения станции просто долго достаточно, чтобы заполнить встраивание формы с жидким парафином.
  5. Раз наполнен жидкий парафин, очень кратко touch внедрения плесень холодной пластины, а затем вставлять каждой половины фильтра на встраивание формы (сократить стороны), это гарантирует, что при резании, один будет резки от центра к краю фильтра .
  6. Во время внедрения, используйте щипцы провести фильтр для предотвращения половинки от попадания в друг друга, до тех пор, пока достаточно прохладно для них самостоятельные парафина. Переместите вложения плесень холодной пластины до тех пор, пока полностью затвердевшим.
    Примечание: Охлаждение блоков на лотках льда помогает предотвратить морщинистой секций.

6. Секционирование и окрашивание VCCC для поперечной иммунофлюоресценции

  1. для блоков парафина секционирование и слайд монтажа: вырезать 5 мкм секций, поместить эти разделы в ванну воды 42 ° C и забрать разделы, используя положительно заряженные слайды. Сохраните слайды на ночь в 42 ° C духовке сушиться.
  2. Перед началом регидратации шаги, выпекать слайды при температуре 60 ° C для плавления парафина и помочь присоединиться VCCC разделы к слайду. Прохладный кратко, то увлажняет слайды через два изменения ксилол, 100% EtOH, 95% EtOH, одно изменение 70% EtOH и два изменения в дистиллированной воде.
  3. Избежать методы извлечения антигена, включающие микроволновой печи или отопления как разделы могут упасть слайд.
  4. Выполнение стандартной блокировки за 1 ч при комнатной температуре, затем ночи инкубации с основного антитела на 4 ° C, следуют мытья шаги и вторичные антитела за 1 ч при комнатной температуре. Крепление с монтажа СМИ и coverslip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Вставки фильтр, используемый для VCCC имеют небольшие, 0,4 мкм отверстия. Рисунок 1A, en лицо зрения врезные фильтра VCCC, показывает поры, в которых могут образовываться меж в пробирке. Схема изображает гладкомышечные клетки, покрытие на нижней стороне фильтра один день до эндотелиальные клетки покрыты с противоположной стороны (рис. 1B). После того, как клетки покрыты, EC, меж и SMC фракций могут быть изолированные три дня спустя. Пример этого показан на рисунке 2A, где ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1) весьма выражается в меж фракции по отношению к остальной части ЕС, в которой рассматривается также в vivo MEJs25. Эти данные свидетельствуют о полезности VCCC в перечислении стены нетронутыми артериол кровеносного сосуда.

Далее показана VCCC иммунофлюоресценции и электронной микроскопии. VCCC остается нетронутым и фиксированными с PFA для поперечной иммунофлюоресценции. На рисунке 3A показывает гладких мышц конкретных альфа-1 адренергические рецепторы и эндотелиальных конкретных Брадикинин рецептора. Фаллоидин окрашивание F-актина показывает актина мостов в меж (белая стрелка) между двумя ячейками, которые воспроизводит выражение, видели в неповрежденной артерии26. В рисунок 3Bпродемонстрировал сечение VCCC как осмотрено просвечивающей электронной микроскопии, который отрисовывается в 3D в рисунке 3 c. Эти виды VCCC продемонстрировать способность конкретно локализовать белки, рецепторы и ультраструктура в пробирке MEJs.

Figure 1
Рисунок 1: покрытие сосудистой клеточной культуры сотрудничества (VCCC). (A) En лицо свет Микрофотография поры в вставка фильтра. Черные стрелки обозначают отдельные отверстия. (B) схема покрытия VCCC. День 1 показывает инверсии вкладыш фильтра и покрытие SMC на дне. На 2 день ЕК покрытием на противоположной стороне фильтра и VCCC остается в этой конформации в пластине 6-Ну до сбора урожая. Белые стрелки указывают на стороне фильтра, где клетки покрыты и будет расти. Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: обогащение белком в меж. (A) иммуно передачи изображения микроскопа мыши артерии с выражением альфа-глобина на меж (золотые бусины, которые отображаются в виде черных точек). (B) Западная помарка показаны ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1), что выражение обогащается в меж фракции по сравнению с ЕС или SMC фракций. Пластиковый ЕС указывает EC, выращенных на пластиковые блюдо, которые не образуют меж. Шкалы бар = 1 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: поперечной иммунофлюоресценции и электронной микроскопии в поперечном разделах VCCC. (A) окрашивания для гладких мышц и эндотелиальных специфических белков. F-актина пятнать это типы клеток и в пробирке меж (белая стрелка). Пример электронной микроскопии, используется для изучения Ультраструктура в пробирке MEJs в 2D (B) и (C). 3D Шкалы бар = 10 мкм (A); 2.5 мкм (B); и примерно 2,5 мкм вертикальных и 0,5 мкм горизонтальной (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

VCCC имеет ряд преимуществ с точки зрения изложив MEJs в пробирке, но есть точки обсуждения, при определении, если VCCC может использоваться для конкретного приложения. Например если различных типов клеток, которые будут использоваться с этой моделью, он будет нужно быть оптимизированы. Мы использовали первичной клетки человека, но это можно изолировать клетки из бычьего аорты24, или wildtype или нокаут мышей и использовать их в1,VCCC,5,,14.

При использовании VCCC для изоляции меж, наиболее важный способ мастер является тщательная зачистка фильтр, чтобы гарантировать, что чистота меж дроби не изменено избыток клетками эндотелия и гладкой мускулатуры. Мы показали через западный blotting, что альфа-гемоглобина является лучшим маркер «чистого» меж изоляции13, как она должна быть сильно выражена в меж фракция против фракция эндотелиальных клеток. Другой является PAI-1, который регулирует формирование меж (рис. 2)25. Мы считаем, что это может быть особенно хорошо маркеры для надежной изоляции меж. Для дополнительной уверенности в технике урожая фильтры могут после соскабливания для урожая и витражи для EC/SMC маркеры25.

Imaging выражение протеина в VCCC может выполняться двумя способами: en лицо (рис. 1A) или поперечной (рис. 3). Обоих препаратов позволяют для визуализации белков внутри отверстия фильтра с двух разных точек зрения. En лицом техника включает артерий, которые разрезали продольно и затем закреплена, плоские, с ЕК вверх, визуализировать EC монослоя и отверстия в IEL, единственное место, где могут образовываться меж. Флуоресцентного сигнала внутри отверстия IEL указывает локализация белка в течение10,меж27. Этот же принцип может переводиться на VCCC изображения EC монослоя сверху, без необходимости вставлять его в парафин или сделать секций. Поперечной метод является, но сложнее освоить важно для визуализации различных белков в ЕС против монослои SMC (рис. 3).

Потенциальным ограничением является отсутствие потока или растягивать в системе, но это можно добавить поток в16,совместное культуры клеток эндотелия гладких мышц19. Похоже, что статические условия по-прежнему позволяют физиологически точной белков и активации, поэтому он может быть, что контакт heterocellular является наиболее важным фактором в рассечение меж сигнальные пути.

Есть несколько приложений этот метод за сопротивление артерии сигнализации как VCCC не обязательно ограничиваются типы определенных клеток. Другие модели совместного культуры использовали нарост эндотелиальных клеток и остеобластов17, или образцу гематоэнцефалический барьер с эндотелиальных и перицит/экзоцитоз совместно культур21. Метастазирования опухолевых клеток через эндотелий также могут быть количественно с помощью этой модели21. Это также возможно вырастить клетки на фильтр и культуре другой ячейке введите в нижней части 6-ну блюдо для тестирования паракринными сигнализации, или расти эндотелиальных клеток в верхней части мембраны взглянуть на поляризации клеток (наши Неопубликованные наблюдения). Лейкоциты или других циркулирующих клеток могут быть добавлены к средствам ЕС и адгезии клеток может быть количественных12. Кроме того VCCC может использоваться для изучения патологии таких гладких мышц миграции24 и распространения в ответ на эндотелиальных травмы15,18.

В заключение мы представили метод для изоляции меж в пробирке клеток культуры системы, которая позволяет для расследования сигнализации процессов между двумя типами спаренных клеток. Важно отметить, что система совместного культуры не ограничивается изучением меж и может быть ценной для ответа на ряд вопросов, особенно связанных с heterocellular коммуникации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана национальной сердца, легких и крови Институт предоставляет лектор стипендий 14PRE20420024 R01088554, T32HL007284 и Американской ассоциации сердца. Мы особенно благодарим Санкт Джуд сотовой Imaging общих исследований ядро, включая Рэндалл Уэйкфилд и Линда Хорнер для изображений, электронной микроскопии, Адам Straub для помощи с изображениями представитель иммунофлюоресценции и Pooneh Багер для нее ценную информацию о протоколе рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert Corning 3450 This is one 6 well plate of inserts
225 cm flask Corning 431082
6 well plates (without filter inserts) Corning 3506
Primary human coronary artery endothelial cells Lonza CC-2585
Primary human coronary artery smooth muscle cells Lonza CC-2583
EBM-2 EC Basal media Lonza CC-3156
EC growth factors (EGM2 MV Single quots) Lonza CC-4147 Add to basal media before use
SmBM SMC basal media Lonza CC-3181
SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) Lonza CC-4149 Add to basal media before use
0.5% Trypsin-EDTA 10X Gibco 15400-054 Dilute to 2X with sterile dPBS
Hemocytometer VWR 15170-208
large petri dishes for SMC Plating (150mm) Corning 353025
Bovine gelatin Sigma G-9382
Human fibronectin Corning 356008 5µg/ml of fibronectin and store at -20
10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) Gibco 14065-056 Dilute to 1x with sterile water
10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) Gibco 14200-075 Dilute to 1x with sterile water
Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle Amazon MDS15210
Forceps Fisher 17-467-201
Cell lifter Corning 3008
Cell scraper BD Falcon 353085
50 mL conical tube Corning 352070
10 mm petri dishes Falcon 35-1008
Rneasy mini kit Qiagen 74104
RNA lysis reagent Qiagen 79306
Paraformaldehyde Sigma 158127 Make 4% solution with dPBS
70% ethanol Fisher 04-355-305
Cavicide disinfectant Fisher 131000
RIPA protein lysis buffer Sigma R0278
Sonic dismembranator Fisher Model 50
1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry Gibco 10010023 does not need to be sterile
Name Company Catalog Number Comments
Embedding/Sectioning/Staining
Paraffin Fisher P31-500
Automated tissue processer Excelsior ES
Embedding station + cold plate Leica HistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade VWR 25608-961 or 25608-964
Microscope slides Thermo Fisher 22-230-900
Coverslips Thermo Fisher 12-548-5E
Prolong Gold mounting medium Thermo Fisher P36931
Name Company Catalog Number Comments
Other Solutions **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells
Sterile dPBS Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter).
Final concentration: 1X
sterile HBSS Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter).
Final concentration: 1X
Fibronectin stock solution Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed
Final concentration: 100µg/mL
Fibronectin to coat SMC side of VCCC thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL.
Final concentration: 5µg/mL
2x Trypsin EDTA solution Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) .
Final concentration: 2X
Blocking/antibody solution (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum)
Bovine gelatin to coat EC VCCC Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions.
Final concentration: 0.50%
1x PBS for harvesting cells does not need to be sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
  2. Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
  3. Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
  4. Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
  5. Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
  6. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
  7. Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
  8. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
  9. Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
  10. Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
  11. Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
  12. Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
  13. Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
  14. Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
  15. Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
  16. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
  17. Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
  18. Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
  19. Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
  20. van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
  21. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  22. Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
  23. Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
  24. Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
  25. Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
  26. Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
  27. Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).

Tags

Медицина выпуск 127 эндотелиальных клеток гладких мышечных клеток heterocellular коммуникации клетки полярности разрыв соединения сотовой прогнозы внеклеточного матрикса Сопредседатель культура
Ячеечная модель культуры сопротивления артерий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biwer, L. A., Lechauve, C.,… More

Biwer, L. A., Lechauve, C., Vanhoose, S., Weiss, M. J., Isakson, B. E. A Cell Culture Model of Resistance Arteries . J. Vis. Exp. (127), e55992, doi:10.3791/55992 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter