抵抗血管の細胞培養モデルを説明することで、シグナル伝達経路の内皮細胞、平滑筋や内皮細胞と平滑筋 (myoendothelial ジャンクション) 間の解剖を可能にします。アゴニストまたは蛋白質の隔離、電子顕微鏡、蛍光抗体の選択的なアプリケーションは、この細胞培養モデルを使用して利用できます。
Myoendothelial ジャンクション (MEJ) 小径抵抗血管でユニークなシグナリングの創製は、血管緊張や血圧を制御することができますシグナリング プロセス特定の蛋白質の局在を展示します。内皮細胞や平滑筋細胞からの投影は、その小型のためサイズ (〜 1 μ m2の面積平均)、上、MEJ と単独で勉強することは困難です。ただし、我々 は MEJ 形成体外、内皮細胞の極性形成とシグナル伝達タンパク質と抵抗の血管壁内のプロセスの郭清では、血管細胞共培養 (VCCC) と呼ばれる細胞培養モデルを開発しました。動脈。VCCC 多数のアプリケーションには、異なる種類の細胞に合わせて適応することができます。モデルは、0.4 μ m 孔体外でMEJs することができますフォームをフィルターの両側に成長して 2 種類の細胞で構成されています。ここでセルのめっきと内皮細胞の分離を介して VCCC を作成する方法について述べる MEJ、および蛋白質の隔離や活動のため使用することができます平滑筋分数の試金。埋め込み、および免疫蛍光分析用断面、そのまま細胞層でフィルターを固定できます。重要なは、このモデルからの発見の多くは生理学的な関連性を強調し、そのまま抵抗動脈を使用して確認されています。
小径抵抗血管の薄い内弾性板 (IEL) は、内皮細胞 (EC) と平滑筋細胞 (SMC) を分離します。セルはこの弾性マトリックスの穴を介して投影し、ギャップ結合チャネル1,2経由でダイレクトに細胞質接続できます。このユニークな構造は、myoendothelial のジャンクション (MEJ) と呼ばれます。MEJ です小 (血管床によって、0.5 μ m x 約 0.5 μ m)、細胞突起主に内皮細胞から成る3,4同様の平滑筋から発生させてよい。調査官の数はシグナル伝達 MEJ、内皮細胞と平滑筋5 間双方向のシグナル化を促進するため特に重要な場所、それはレンダリングに選択的に発生するネットワークの巨大な複雑さを示しています。 ,6,7,8,9,10。
ただし、そのまま動脈、MEJ のシグナル伝達経路の機構的郭清はむずかしい。MEJ から細胞の投影こそ体内MEJ 血管壁から分離することは現在はないです。このため、VCCC モデル1が開発されました。重要なは、VCCC 複製生理的血管内皮形態11 ・頂間の信号の偏波とセル12MEJ 部分。アルファのヘモグロビンは、血管内皮細胞、MEJ に偏光の発見を容易にするこのユニークなモデルだった。これはアルファのヘモグロビン13を表現しない従来培養内皮細胞とは対照的です。微小血管内皮細胞に興味がある研究者は、特に小径抵抗血管で発生するシグナル伝達経路を分析することが目的の場合、VCCC で培養した血管内皮細胞を使用するより適切な場合があります。
2 つ共培養細胞型に小径孔 (直径 0.4 μ m) を持つフィルターを含む頑丈なプラスチック製の挿入を使用すると、セルで層間の移行できなくなります。それはin vivoよりはるかに時間がまだ MEJs、蛋白質のローカリゼーション、シグナルの1二次メッセンジャーなどの生体内の特性の多くを複製セル間の 10 μ m 間隔の結果します。,14します。 さらに、、VCCC セル アゴニストまたは特定の細胞内コンパートメントに拮抗薬の追加を介して信号の種類に固有のターゲットにできます。たとえば、カルシウムをキレート化するためこれら AM で EC を読み込みとフェニレフリン14SMC を刺激します。これにより、共培養モデル15,16,17,18,19,20,21の他の記述と対照をなしてmRNA および蛋白質、分数を含む、異なる MEJ フィルター孔内の異なる画分を分離することについて説明します。この手法、VCCC を添加できます蛋白質活動12蛋白質のリン酸化の12,23, や転写22mRNA の局在の変化の具体的な調査。異なる立体構造11,18,242 つの細胞の種類の培養が可能だが、底部には、フィルターと SMC の上に EC のめっきが、この資料に記載されます。
VCCC は MEJsの in vitro、さたの面で利点の数が特定のアプリケーションのため、VCCC を利用できるかどうかを決定する際の議論のポイントがあります。たとえば、異なる種類の細胞をこのモデルで使用される場合は、最適化するそれ必要があります。ひと初代細胞を用いてウシ大動脈24、または野生型やノックアウト マウスから細胞を分離し、VCCC1,</…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、各国用の中心によって支えられた、肺、血液研究所 R01088554、T32HL007284、アメリカの心臓協会の交わりを経て 14PRE20420024 を付与します。我々 は特に、聖ジュード細胞イメージング共有研究コア、ランドール ウェイク フィールドと電子顕微鏡画像のリンダ ・ ホーナー、アダム ストラウブについては代表的な蛍光画像彼女の地下鉄 Bagher などを感謝します。原稿プロトコルに関する貴重なフィードバック。
24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
225cm2 flask | Corning | 431082 | |
6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
50mL conical tube | Corning | 352070 | |
10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Embedding/Sectioning/Staining | |||
Paraffin | Fisher | P31-500 | |
Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
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sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
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Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
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Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
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2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
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Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
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1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |