Summary
Vi demonstrerer en metode til at vise flere molekyler inden for heterogene nanostrukturer ved nøjagtighed af enkeltmolekyler ved hjælp af sekventiel binding og eluering af fluorescensmærkede antistoffer.
Abstract
Imaging heterogene cellulære strukturer ved anvendelse af enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi er blevet forhindret af utilstrækkelig lokalisering præcision og multiplexing evne. Ved hjælp af fluorescerende nano-diamant fiducial markører beskriver vi driftskorrektions- og justeringsprocedurerne, der kræves for at opnå høj præcision i enkeltmolekyle lokaliseringsmikroskopi. Derudover er der beskrevet en ny multiplexeringsstrategi, madSTORM, hvori flere molekyler er målrettet i den samme celle ved anvendelse af sekventiel binding og eluering af fluorescerende antistoffer. MadSTORM er demonstreret på en aktiveret T-celle for at visualisere placeringen af forskellige komponenter i en membranbundet, multi-proteinstruktur kaldet T-cellereceptor-mikroklassen. Derudover er anvendelsen af madSTORM som et generelt værktøj til visualisering af multi-proteinstrukturer diskuteret.
Introduction
En række superopløsningsmikroskopiteknikker er blevet udviklet til at overvinde diffraktionsgrænsen for lysmikroskopi (~ 200 nm). Blandt disse er en kategori af teknikker kaldet single molecule localization microscopy (SMLM), som omfatter fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM). SMLM teknikker deler i brugen af fluoroforer, der kan skiftes mellem på (fluorescerende) og off (mørke / foto-switchede) tilstande, hvilket muliggør sekventiel lokalisering af fluorescens fra enkeltmolekyler 1 , 2 , 3 .
På grund af dets kompatibilitet med kommercielt tilgængelige farvestoffer og mikroskoper er direkte STORM (dSTORM) blevet en almindeligt vedtaget SMLM-teknik 4 . DSTORM kan rutinemæssigt opnå ~ 10 nm lokaliseringspræcision, defineret som usikkerheden ved beregning af centrum for en diffraktionIonbegrænset punktspredningsfunktion (PSF). På trods af den høje præcision, der anslås ved hjælp af lokaliseringsalgoritmerne 5 , 6 , 7 , er nøjagtig bestemmelse af den faktiske placering af enkeltmolekyler blevet hæmmet af en række problemer. For det første tilføjer mekanisk bevægelse af mikroskopfasen under billedopsamling betydelig usikkerhed omkring lokaliseringspræcision. Da SMLM-billeder opnås over tusindvis af tidsrammer, kan nano-skala bevægelser i mikroskopetrinnet betydeligt kompromittere præcisionen af det endelige superopløsningsbillede 8 . For at kompensere for trinbevægelse under billedkøb, estimeres scenydrift almindeligvis fra regressionsbaseret montering af in-situ lokaliseringer fra selve billedet (krydskorrelation) eller sekventielle lokaliseringer fra fiducial-markører (fiducial-korrektion) 1 , 9 . HowevEr, disse metoder kræver optimering af flere parametre for hver billedstabel og kan ikke tage højde for scenebevægelser på kort tidskalaer som mekanisk vibration. Guldnano-partikler og flerfarvede fluorescerende perler er blevet anvendt som fiducial markører i SMLM, men de er ikke fotostabile og resulterer i signifikant lavere præcision efter driftskorrektion end nitrogen fluorescerende nanodiamanter (FND'er) I madSTORM 10 .
Ud over diffraktionsgrænsen er lysmikroskopi yderligere begrænset af spektrale grænser. Samtidig visualisering af flere mål kræver fluorescerende sonder med ikke-overlappende spektrale profiler, der generelt begrænser fluorescensbaseret lysmikroskopi til 6 farver og SMLM til 2-3 farver 4 , 11 , 12 . Desuden forårsager ikke-lineær kromatisk afvigelse forskydning af flerfarvede billeder, wDer kræver omfattende justeringsprocedurer ved brug af flerfarvede fiducial markører 8 , 13 . For at overvinde disse grænser har tidligere undersøgelser afbildet flere mål ved anvendelse af gentagen fotoblegning eller kemisk quenching af sekventielt bundne fluoroforer 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Selvom disse fremgangsmåder kan overvinde mikroskopiens spektrale grænser, er fluorescensblegning kendt for at være en toksisk proces 20 , og langvarig blegning eller slukning kan forårsage uønskede bivirkninger såsom tab af tværbinding. Desuden kan akkumuleringen af fluorescerende prober føre til sterisk blokering af bindingssteder i prøven, hvilket forhindrer storskala multiplexering og robust målretning af epitoper. For at undgå sådan sterisk indblanding er en nylig sTudy opnået multipleksering ved anvendelse af stokastisk udveksling af frit diffunderende proteinfragmenter 21 . Mens denne metode tillader tæt mærkning af cellulære strukturer, kræver det omfattende biokemisk præparation til isolering af peptidfragmenter, kan ikke lokalisere enkeltmolekylpositioner og letter ikke let ved hjælp af storskala multiplexering ved anvendelse af kommercielt tilgængelige prober. Vi præsenterer en detaljeret videoprotokol, der beskriver sekventiel binding og eluering af fluorescensantistoffer til multiplexeret, antistofstørrelsesbegrænset dSTORM (madSTORM) billedbehandling og anvendelse af fluorescerende nanodiamanter for at opnå præcis driftskorrektion og justering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Se venligst alle relevante sikkerhedsdatablade (MSDS) inden brug. Flere af de kemikalier, der anvendes i denne protokol, er toksiske og kræftfremkaldende. Brug venligst alle relevante sikkerhedsprincipper, når du udfører protokollen, herunder brug af tekniske kontroller (dampkåbe, handskerum) og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, lab coat, fuld længde bukser, lukkede sko).
1. Multiplexet billeddannelse af aktiverede T-celler
- Direkte konjugerede antistoffer med Alexa-647 (A647) farvestof ved brug af Alexa 647 antistof mærkning kit. Følg etiketteringsprotokollen fra producenten.
BEMÆRK: Dialyse af antistofopløsning i 1x PBS anbefales før dette trin for at øge effektiviteten af antistoffetiketter. - Spin-mærket antistoffer i 5 minutter ved 20.800 rcf og opsamler supernatant for at fjerne aggregerede antistoffer.
- Fremstilling af fluorescerende nano-diamantbelagte coverlips
- Forbered en fortynding af 100 nm FND'er i 1x PBS. Test forskellige fortyndinger for at sikre nok FND'er er synlige hvert synsfelt i trin 1.2.7 (vi bruger en 1: 200 fortynding af FND'er fra producenten).
- Vortex de fortyndede FND'er i 1 min.
- Sonikér FND-supernatanten i 30 s ved høj effekt.
- Inkuber den sonikerede FND-supernatant i et PLL-belagt 8-brønds dækkammer i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask 5x med 1x PBS og visualiser det FND-belagte kammer ved hjælp af 647 nm laser excitation på TIRF mikroskop. Ideelt set bør 4-10 individuelle FND'er være synlige i et synsfelt givet den relevante fortynding af FND'er i trin 1.2.2 (vi bruger et 100X objektiv med 256 x 256 kamera pixel indstilling for at give 61 x 61 μm synsfelt) Med atMindst én FND til stede i hver kvadrant af billedfeltet. Hvis FND'erne ser ud til at være grupperet ( dvs. FND'er med signifikant højere signal end omgivende FND'er og en punktspredningsfunktion større end 200 nm) centrifuger FND'er ved 6,800 rcf i 1 min og gentager coatingproceduren ved anvendelse af FND-supernatanten.
- Tilsæt 250 μl anti-CD3-antistof (10 μg / ml) i hver brønd og inkuber i 1 time ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C.
- Fjern opløsningen og tilsæt 1x PBS i 30 sek. Gentag dette vaske trin 5 gange (vask 5 gange).
- Spin 1 ml Jurkat T-celler ved 800 rcf i 6 minutter og resuspender i 300 μl 1x HBS opløsning. Jurkat T-celler bør ideelt set ligge i en koncentration på 0,5-1,0 x 10 6 celler / ml inden spinning. 1x HBS-opløsning består af HEPES-bufferopløsning med 1% bovint serumalbumin som beskrevet tidligere 22 .
- Tilsæt 150 μLAf 1x HBS opløsning i hver brønd og inkuber ved 37 ° C i 15 minutter.
- Tilsæt 50 μl resuspenderet Jurkat T-celler til hver brønd og inkuber i 3 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt 300 μl 4% paraformaldehyd til hver brønd og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Vask 3x med 1x PBS.
- Permeabiliser celler ved at tilsætte 250 μl 0,1% Triton-X opløsning i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vask 3x med 1x PBS.
- Tilsæt 250 μL 1% fiskgelatineopløsning i 1x PBS til hver brønd i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask 3x med 1x PBS.
- Tilsæt 200 μl mærket antistof ved 0,1-0,5 μg / ml til faste celler i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask 5x med 1x PBS.
- Tilsæt 1 ml STORM buffer og dækk kammeret med et glasdæksel for at begrænse udsættelse for luft. STORM-bufferen er blevet beskrevet tidligere 10 . Vi anbefaler maKonge, ny STORM-buffer for hver runde af billeddannelse og spinding af STORM-bufferen ved 20.800 rcf i 2 minutter for at fjerne bundfald.
- Ved brug af lav 647 nm laser effekt i TIRF-tilstand skal du lokalisere en farvet celle med mindst 3 FND'er i synsfeltet. For at hjælpe med at lokalisere FND'er kan samtidig excitation med 568 nm laser bruges til at forøge lysstyrken af FND-signalet.
BEMÆRK: Udførelsen af den gennemsnitlige fiducial korrektion beskrevet i afsnit 2.1 forbedrer med inddragelse af flere FND'er. - Forøg 647 nm laser strøm og erhverve billeder. Vi opnår typisk 10.000 rammer ved 200 ms eksponering, 125 mW 647 nm laser, 100X TIRF objektiv objektiv (1,49 NA), 100X EM gain (5 MHz ved 16 bit, konverteringsgevinst 1). Detaljer om vores billedopsætning er blevet beskrevet tidligere 10 .
- Vask 5x med 1x TBS.
- Tilsæt 1 ml oF-elueringsbuffer (3,5 M MgCl2, 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) og inkuberes ved stuetemperatur i 1 minut.
- Gentag eluering 3 gange. (Nøjagtige elueringsbetingelser og antallet af elueringsspyler, der er nødvendige for at fjerne signalet, skal kontrolleres for hvert anvendt antistof).
- Vask 3x med 1x TBS og tilsæt 1 ml 1x PBS.
- Photobleach ved hjælp af 647 nm laser ved høj effekt (125 mW) med 405 nm laser ved 2-5 mW til fotoaktivering af A647 farvestoffer i mørk tilstand. Vent, indtil alt resterende signal fra ikke-elueret antistof er photobleached. Det tager typisk 2-5 s laser eksponering. For at bekræfte fjernelse af signal anbefales det at indhente prøvebilleder (~ 100 billeder) ved hjælp af STORM-indstillingerne i 1.3.5 efter eluering og fotobleaching.
Vi fjerner typisk 99,8% af signalet ved hjælp af denne metode. Vi anbefaler at teste elueringseffektiviteten af hvert antistof før brug i madSTORM som vist tidligere 10 . - Tilsæt 250 μl 4% paraformaldehyd i 15 min. Dette prHændelser omvendt tværbinding af faste molekyler i cellen.
- Vask 3x med 1x PBS.
- Gentag trin 1.3.1-1.3.12 for sekventiel mærkning af flere mål. Figur 1 viser et sammensat billede af multiple molekyler i en aktiveret Jurkat T-celle erhvervet ved anvendelse af madSTORM.
2. Driftskorrektion og justering af multiplexerede billedstabler
- Driftskorrektion af madSTORM-billedstabler
- Åbn billeder ved hjælp af ImageJ. Vi anbefaler at konvertere billedfiler til et TIFF-format, før de åbnes i ImageJ. Brug rektangel ROI til at vælge en enkelt FND. Afspil tidsforskydningen for at sikre, at FND'en er synlig i hver ramme af billedstakken. Brug Kør Analyse i ThunderSTORM plugin til at lokalisere FND. For den gennemsnitlige fiducial korrektion metode beskrevet i 2.1.5 er det vigtigt, at en enkelt FND er lokaliseret i hver billedramme ( dvs. antallet af identificerede toppe skal være eKval til antallet af rammer).
- Hvis FND ikke er identificeret i hver ramme, skal du vælge en anden FND. Hvis flere toppe er placeret i en enkelt ramme, skal du fjerne toppen, der afviger mest fra tidligere toppe.
- Gentag 2.1.2 for hver FND i billedstakken. Husk på, at nogle FND'er ikke bør medtages i driftskorrektionsprocessen, så de kan fungere som en selvstændig måler til driftskorrektionspræcision som beskrevet i trin 2.1.7.
- For hurtigere, mindre præcis driftskorrektion skal du bruge enten krydskorrelations- eller fiducial-korrektionsalgoritmerne inkluderet i ThunderSTORM for at rette FND-billederne. Typisk bruger vi 100 bakker, 5 forstørrelser og 0,1 baneudjævningsfaktor for krydskorrelation og 10 maks. Afstand, 0,1 min markør synlighed og 0,01 baneudjævningsfaktor til fiducial korrektion. Korskorrelation og fiducial korrektion vil give en korrektionsfil, der kan anvendes til andre FND'er til at teste driftskorrektionsnøjagtigheden.
- For mere stringent, mere præcis driftskorrigering skal du bruge den gennemsnitlige fiducial korrektion (AFC) algoritme som beskrevet tidligere 10 . Denne proces kræver ikke optimering af parametre og giver højere lokaliseringspræcision end forudsagt af SMLM lokaliseringsalgoritmer. Den gennemsnitlige driftskorrektion kræver dog mindst 4 FND'er og for FND'erne skal lokaliseres i hver ramme af billedstakken. AFC-driftskorrektion virker bedre med inddragelse af flere FND'er, fordi et stort antal lokaliserede FND'er vil mindske forvridningseffekten af en outlier-top i en given ramme.
- Lokaliser alle punktspreadfunktioner i billedstakken ved hjælp af ThunderSTORM som beskrevet tidligere 10 . Vi bruger typisk pixelstørrelse på 100 nm, fotoelektroner pr. A / D-tal på 4,28, basisniveau A / D-tæller på 100, EM-gevinster på 100, PSF: Integreret Gauss-lokalisering, 5 pixel monteringstradius, maksimal sandsynlighedsfittingmetode og 1,3 Pixel initial sigma.
- Anvend den driftskorrektionsfaktor, der er erhvervet fra FND'er til lokaliseringer fra hele billedstakken. Visuelt inspicere det endelige billede for at sikre korrekt driftskorrektion ( Figur 2 ). Den resulterende driftskorrektionsfaktor skal testes uafhængigt af FND'er, der ikke er medtaget i AFC-proceduren, for at måle niveauet for driftskorrektionens præcision. Præcisionen af driftkorrigerede, uafhængige FND'er bør være tæt på den gennemsnitlige præcision / usikkerhedsværdi beregnet ud fra lokaliseringsalgoritmen anvendt i trin 2.1.6.
- Gentag trin 2.1.1-2.1.7 for madSTORM-billedstablerne af sekventielt mærkede antistoffer. Husk, at lokalisering af det samme sæt FND'er i hver madSTORM-billedstabel er afgørende for den følgende justeringsprocedure.
- Justering af madSTORM-billeder
- Beregn centrifugeringspositionen for de driftskorrigerede FND'er i hvert madSTORM-billede. For at gøre dette skal du finde den gennemsnitlige x- og y-akse poSitioner for hver lokaliseret FND, og gennemsnittet de gennemsnitlige x- og y-positioner for alle FND'er i hvert madSTORM-billede. Den detaljerede algoritme for dette trin er blevet beskrevet tidligere 10 . Juster sekventielle madSTORM-billeder ved hjælp af centroid-positionerne i FND fiducial markører. For at udføre justeringen skal du beregne forskydningen mellem to lokaliserede madSTORM-billeder ved at trække centroid-positionen af FND'er i det andet madSTORM-billede fra den første. Træk derefter forskydningsbeløbet fra alle lokaliseringer i det andet madSTORM-billede.
- Vi anbefaler at bruge det første madSTORM-billede som et referencebillede og gentage dette tilpasningstrin mellem første og tredje, første og fjerde osv. Test justeringspræcisionen ved at måle forskydningen mellem FND'er, der ikke er inkluderet i justeringsprocessen. Store forskydninger kan indikere, at forskellige sæt FND'er blev anvendt ved beregning af centroidpositionerne af sekventielle madSTORM-billeder.
- I så fald skal trin 2.2.1-2.2.2 shouLd gentages under anvendelse af samme sæt FND'er for at udføre justering.
BEMÆRK: Brugerdefinerede koder til både AFC-driftskorrektion og justeringsprocedurer leveres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den sekventielle eluerings- og farvningsfremgangsmåde blev anvendt til at fremstille det multipleksede madSTORM-billede af mikroklyngere og andre strukturer i en aktiveret Jurkat T-celle ( Figur 1 , kontrolfigurjusteringer). Hvert pseudo-farvet billede repræsenterer en runde madSTORM-billeddannelse erhvervet i trin 1.1.1 til 1.3.13. Som beskrevet tidligere 10 skal synsfeltet overvåges for restsignal fra tidligere, ikke-elueret antistof for at undgå krydsning mellem multiplexede mål. Da elueringseffektiviteten kan variere blandt antistoffer, bør rækkefølgen af sekventiel multiplexing arrangeres fra det bedste til det værste eluerende antistof for at minimere sterisk blokering af epitoper. Det endelige madSTORM-billede i figur 1 er korrigeret for drift og justering ved anvendelse af AFC og FND fiducial markører som beskrevet i afsnit 2.
Figur 2A , 2B ) og en aktiveret Jurkat T-celle ( Figur 2C , 2D ). AFC-driftskorrektionen blev udført som beskrevet i trin 2.1.1-2.1.8 ved anvendelse af de tilvejebragte algoritmer. For det første anbefales visuel inspektion af billedet efter driftskorrektion ( figur 2C ) at sikre korrekt anvendelse af driftskorrigeringsalgoritmen. For det andet anbefales at måle standardafvigelsen for lokaliseringer i både X- og Y-aksen for at bekræfte præcisionen opnået af AFC. Som rapporteret tidligere 10 giver AFC typisk bedre præcision end forventet af forskellige lokaliseringsalgoritmer.
Figur 1: ( A B ) Udvidet billede af boxed region i A. Skal bar = 500 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: SMLM billede af en enkelt FND lokaliseret i 30.000 billedrammer ( A ) før og ( B ) efter driftskorrektion med gennemsnitlig fiducial korrektion. Skalestænger = 20 nm (A og B). SMLM billede af en aktiveret Jurkat T celle farvet wiTh anti-phosphorylerede SLP76 (Y128) antistof og FND fiducial markører ( C ) før og ( D ) efter driftskorrektion med gennemsnitlig fiducial korrektion. Målestang = 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den sekventielle multiplexering, driftskorrektion og justeringsprocedurer i madSTORM tillader præcis, højmultiplexeret visualisering af heterogene strukturer i celler. 10 Derudover undgår madSTORM begrænsningerne i multi-farve STORM, såsom kromatisk aberration og suboptimale fotoswitching / emissionsegenskaber af ikke-farfarfarvestoffer 9 , 12 . Da elueringstrinnet signifikant reducerer sterisk interferens fra sekventielt bundne antistoffer, kan madSTORM anvendes til at udføre gentagen billeddannelse af celleprøver ud over 6-10 runder af multiplexeret billeddannelse opnået ved tidligere teknikker 9 , 15 , 21 . Desuden er de sekventielle eluerings- og farvningstrin ikke begrænset til SMLM og kan anvendes til andre billeddannelsesteknikker, såsom konfokal mikroskopi, SIM og to-foton mikroskopi. Men i betragtning af at madSTORM er en sekventiel immunfremmende teknik, denne teknik er begrænset af tilgængeligheden af antistoffer for hvert målrettet molekyle. Hvert antistof skal testes omhyggeligt for at sikre specificitet, mærkningseffektivitet og elueringsevne.
Opkøbsindstillingerne for madSTORM blev valgt for at maksimere detektion af individuelle fotoswitching-hændelser, hvilket giver os mulighed for at opnå 2,5 nm gennemsnitlig lokaliseringspræcision. Høj præcision kommer dog på bekostning af tid, hvilket kræver ~ 3 timer for hver runde af madSTORM-billeddannelse som diskuteret tidligere 10 . For hurtigere billedoptagelse ved lavere lokaliseringspræcision (5-10 nm) anbefales en kortere eksponeringstid og højere EM-forstærkning ( f.eks. 20 ms eksponering, 300 x EM gain, 17 MHz ved 16 bit, konverteringsgevinst 3). Desuden kan multi-farve billeddannelse ( f.eks. Atto-488, Alexa-568 og Alexa-647 nm) udføres for hver runde af madSTORM-billeddannelse for at forøge skalaen af multipleksering, omend wiTh et fald i justeringspræcision på grund af kromatisk afvigelse.
Vi har med succes udført op til 25 runder af madSTORM-billedbehandling ved hjælp af denne protokol. Da hele proceduren udføres med dækkammeret monteret på mikroskopetrinnet, er det vigtigt at sikre afdækningskammeret i samme position. For at gøre dette skal du bruge autofokustilstand og montere kammeret på mikroskopfasen ved hjælp af metalklemmer. Hvis der er sket signifikant stadiumdrift, skal du bruge kendte positioner af FND fiducial markører til at centrere celleprøven igen.
Samtidig visualisering af justerede madSTORM-billeder kan være udfordrende. For samtidig at se 7 eller færre madSTORM-billeder skal du bruge Color / Merge Channels i ImageJ til at oprette et pseudo-farvet kompositbillede. For 8 eller flere billeder er det tilrådeligt at kategorisere madSTORM-billederne i forskellige grupper, fusionere hver gruppe til et sammensat billede og anvende en enkelt LUT-farve på hvert sammensat billede.
10 . Endelig kan emissionsintensiteten for NV - ledige FND'er reduceres med op til ~ 50% in situ ved anvendelse af et statisk magnetfelt 23 . Faldet i intensitet er omtrent lige linjært op til ~ 500 Gauss, hvilket betyder effektenT mættede. I praksis kan intensiteten af diamanter i synsfeltet nedsættes til den ønskede grad ved at bringe en permanent magnet tættere på mikroskopglaset fra toppen.
Endelig optimerede vi elueringsbufferen til fjernelse af antistoffer rettet mod molekylkomponenterne i T-celle-mikroklassen. MadSTORM er ikke begrænset til TCR-mikrokluster, men som mikrotubuli, mitochondrier, F-actin, Vimentin og andre molekylære strukturer er blevet afbildet ved anvendelse af denne teknik 10 . For antistoffer rettet mod andre cellulære rum kan yderligere trin være nødvendige for at forstyrre epitopbinding, såsom højere temperatur, lavere pH og længere inkubering af elueringsbuffer. Omvendt kan elueringsbufferen anvendes uden Tween-20 til målfølsomme membranstrukturer, der forhindrer afbrydelse af ikke-ioniske interaktioner. Vi forudser i fremtidige eksperimenter, at elueringsbuffersammensætningen vil blive skræddersyet til individuelle antistoffer tO optimere elueringseffektivitet og prøveopbevaring Endvidere kan madSTORM ud over applikationen i aktiverede T-celler være mulig med andre systemer, herunder in vitro molekylære komplekser, forskellige celletyper og vævssektioner. Forskellige parametre af madSTORM-protokollen, såsom fiksering, permeabilisering, antistoffarvning og elueringsbuffersammensætning skal justeres for hvert målrettet system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Xufeng Wu for adgang til STORM-mikroskopet. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Programmet fra National Cancer Institute (NCI) Center for Cancer Research og National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
