Summary
हम अनुक्रमिक बाध्यकारी और फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के क्षीणन का उपयोग करते हुए एकल अणु सटीकता पर विषम नैनो-संरचनाओं के भीतर छवि के कई अणुओं को प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए विषम सेलुलर संरचनाओं को इमेजिंग अपर्याप्त स्थानीयकरण परिशुद्धता और बहुसंकेतन क्षमता द्वारा बाधित किया गया है। फ्लोरोसेंट नैनो-डायमंड फेड्यूशियल मार्कर का उपयोग करके, हम एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी में उच्च सटीकता प्राप्त करने के लिए आवश्यक बहाव सुधार और संरेखण प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, एक नई मल्टीप्लेज़िंग रणनीति, मैडमस्टोरम, को वर्णित किया गया है जिसमें एक ही सेल में कई अणुओं को लक्षित किया जाता है ताकि अनुक्रमिक बाध्यकारी और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के क्षीणन का उपयोग किया जा सके। मैथमस्टोरम को एक सक्रिय टी सेल पर प्रदर्शित किया जाता है जिससे टी-सेल रिसेप्टर माइक्रोकोल्स्टर नामक एक झिल्ली-बाध्य, बहु-प्रोटीन संरचना के भीतर विभिन्न घटकों के स्थानों की कल्पना की जाती है। इसके अतिरिक्त, मल्टी-प्रोटीन संरचनाओं के विज़ुअलाइजेशन के लिए सामान्य उपकरण के रूप में मदस्टोरम के आवेदन पर चर्चा की जाती है।
Introduction
प्रकाश माइक्रोस्कोपी (~ 200 एनएम) की विवर्तन सीमा को दूर करने के लिए सुपर-रिज़ोल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों की एक किस्म विकसित की गई है। इनमें से एक एकल तकनीक है, जिसे एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) कहा जाता है, जिसमें फोटो-सक्रियण स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) और स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टोर्म) शामिल हैं। एसएमएलएम तकनीकों फ्लोराफोर्स के उपयोग में हिस्सा लेती हैं जो कि (फ्लोरोसेंट) और ऑफ (अंधेरे / फोटो-स्विचेटेड) राज्यों के बीच स्विच की जा सकती हैं, जो एकल अणुओं 1 , 2 , 3 से प्रतिदीप्ति के अनुक्रमिक स्थानीयकरण की अनुमति देता है।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंजक और सूक्ष्मदर्शी के साथ इसकी संगतता के कारण, सीधी STORM (डीएसटीओआरएम) एक व्यापक रूप से अपनाया गया एसएमएलएम तकनीक 4 बन गया है। डीएसटीओआरएम नियमित रूप से ~ 10 एनएम स्थानीयकरण परिशुद्धता प्राप्त कर सकता है, जिसे अंतर के केंद्र की गणना में अनिश्चितता के रूप में परिभाषित किया गया हैआयन-सीमित बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) हालांकि, उच्च परिशुद्धता के बावजूद स्थानीयकरण एल्गोरिदम 5 , 6 , 7 का उपयोग करते हुए , कई मुद्दों के द्वारा एकल अणुओं की वास्तविक स्थिति के सटीक निर्धारण को बाधित किया गया है। सबसे पहले, छवि अधिग्रहण के दौरान माइक्रोस्कोप मंच के यांत्रिक आंदोलन स्थानीयकरण परिशुद्धता के लिए महत्वपूर्ण अनिश्चितता कहते हैं। चूंकि एसएमएलएम छवियां हज़ारों समय-सीमाबद्ध फ्रेमों पर प्राप्त होती हैं, सूक्ष्मदर्शी चरण के नैनो पैमाने पर आंदोलनों अंतिम सुपर-रिजोल्यूशन 8 छवि की सटीकता को काफी समझौता कर सकती हैं। इमेज अधिग्रहण के दौरान मंच आंदोलन के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, स्टेज ड्राफ्ट का आमतौर पर प्रतिबिंब-आधारित फिटिंग का चित्र खुद से (क्रॉस कॉरलेशन) या फेड्यूशियल मार्करों (फ़िड्यूअल सुधार) 1 , 9 के अनुक्रमिक स्थानीयकरण से अनुमान लगाया गया है। Howevएर, इन तरीकों से प्रत्येक छवि स्टैक के लिए कई मापदंडों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, और मैकेनिकल कंपन जैसे कम समय के स्तर पर चरण आंदोलनों के लिए खाता नहीं लगा सकता है। सोना नैनो कण और बहु रंग के फ्लोरोसेंट मोती एसएमएलएम में एफिड्यूशियल मार्कर के रूप में उपयोग किए गए हैं, लेकिन वे फोटो-स्थिर नहीं हैं, और नाइट्रोजन रिक्ति-केंद्र फ्लोरोसेंट नैनो-हीरे (एफडीएस) की तुलना में बहाव सुधार के बाद काफी कम सटीक परिणाम हैं मैडमस्टोर 10 में
विवर्तन सीमा के अलावा, हल्के माइक्रोस्कोपी को वर्णक्रमीय सीमाओं के द्वारा प्रतिबंधित किया जाता है। कई लक्ष्यों के साथ-साथ विज़न को फ्लोरोसेंट जांच की आवश्यकता होती है, गैर-अतिव्यापी वर्णक्रमीय प्रोफाइल, आम तौर पर प्रतिदीप्ति-आधारित प्रकाश माइक्रोस्कोपी को 6 रंगों और एसएमएलएम को 2-3 रंगों 4 , 11 , 12 पर सीमित करता है। इसके अलावा, गैर-रैखिक रंगीन विपथन बहुरंगा छवियों के misalignment का कारण बनता है, डब्ल्यूइस के लिए बहु-रंगीन Fiducial मार्करों 8 , 13 का उपयोग करते हुए व्यापक संरेखण प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। इन सीमाओं पर काबू पाने के लिए, पिछले अध्ययनों में दोहराव वाले फोटोबलीचिंग या अनुक्रमिक रूप से बाध्य फ्लोरोफोर्स 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 1 9 की रासायनिक शमन का उपयोग करते हुए कई लक्ष्य बनाए गए हैं। हालांकि ये पद्धति माइक्रोस्कोपी की वर्णक्रमीय सीमाओं को दूर कर सकती हैं, प्रतिदीप्ति विरंजन को विषाक्त प्रक्रिया 20 माना जाता है, और लंबे समय तक विरंजन या शमन से अवांछित दुष्प्रभाव हो सकते हैं जैसे क्रॉस्लिंकिंग का नुकसान। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट जांच का संग्रह नमूना में बाध्यकारी साइटों के अवरोधन को रोक सकता है, बड़े पैमाने पर मल्टीप्लेक्सिंग और एपोटॉप के मजबूत लक्ष्य को रोक सकता है। इस तरह के कठोर हस्तक्षेप से बचने के लिए, हाल ही में एसट्यूडीआई ने मल्टीप्लेक्सिंग को स्टेचस्टिक एक्सचेंज का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से प्रोटीन टुकड़ों को फैलाना 21 जबकि इस पद्धति से सेलुलर संरचनाओं के घने लेबलिंग की अनुमति होती है, पेप्टाइड के टुकड़े को अलग करने के लिए इसे व्यापक जैव रासायनिक तैयारी की आवश्यकता होती है, एकल अणु स्थितियों का पता नहीं लगा सकता है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांचों का उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर मल्टीप्लेक्सिंग की आसानी से सुविधा नहीं देता है। हम एक विस्तृत विडियो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो मृदुप्लेकृत, एंटीबॉडी आकार-सीमित डीएसटीओआरएम (मैडमस्टोरएम) इमेजिंग के लिए अनुक्रमिक बंधन और फ्लोरोसेंटली एंटीबॉडी के क्षीणन का वर्णन करते हैं, और सटीक बहाव सुधार और संरेखण प्राप्त करने के लिए फ्लोरोसेंट नैनो हीरे का उपयोग करते हैं।
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Protocol
सावधानी: कृपया उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (एमएसडीएस) से परामर्श लें। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त कई रसायनों विषाक्त और कार्सिनोजेनिक हैं। इंजीनियरिंग नियंत्रण (फ्यूम हुड, ग्लोवबॉक्स) और व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई वाली पैंट, बंद-पैर के जूते) के उपयोग सहित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय कृपया सभी उपयुक्त सुरक्षा पद्धतियों का उपयोग करें।
1. सक्रिय टी कोशिकाओं के मल्टीप्लेक्स इमेजिंग
- एलेक्सा 647 एंटीबॉडी लेबलिंग किट का उपयोग करके एलेक्सा -647 (ए 647) डाई के साथ सीधे एंटीबॉडी संयुग्मित करें। निर्माता द्वारा प्रदत्त लेबलिंग प्रोटोकॉल का पालन करें।
नोट: एंटीबॉडी लेबलिंग दक्षता बढ़ाने के लिए इस चरण से पहले 1x पीबीएस में एंटीबॉडी समाधान का डायलिसिस अनुशंसित है। - 5 मिनट के लिए 20,800 आरसीएफ पर एंटीबॉडी लेबल करें और एकत्रित एंटीबॉडी को हटाने के लिए सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें।
- फ्लोरोसेंट नैनो-हीरा-लेपित कवर लिप्स की तैयारी
- 1 एक्स पीबीएस में 100 एनएम एफडीएस के कमजोर पड़ने को तैयार करें। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त एफडीएस चरण 1.2.7 (हम निर्माता द्वारा प्रदान किए गए एफडीएस के 1: 200 कमजोर पड़ने का उपयोग कर रहे हैं) में देखने के प्रत्येक क्षेत्र को देखते हैं।
- भंवर 1 मिनट के लिए पतला FNDs
- एक उच्च-शक्ति सेटिंग पर 30 एस के लिए एफएनडी सतह पर तैरनेवाला ध्वनि करें।
- कमरे के अस्थायी समय में 30 मिनट के लिए पीएलएल-लेपित 8-अच्छी तरह से कवरलीप कक्ष में sonicated FND सतह पर तैरनेवाला सेते हैं।
- 1x पीबीएस के साथ 5x धोएं और टीआरएफ माइक्रोस्कोप पर 647 एनएम लेजर उत्तेजना का उपयोग करते हुए एफडीडी लेपित चैम्बर की कल्पना करें। आदर्श रूप से, चरण 1 में 1.2 एफडी के उचित कमजोर पड़ने के कारण 4-10 व्यक्तिगत एफडीएस दृश्यमान होना चाहिए (हम 25 x 60 x 61 μm फ़ील्ड देखने के लिए 256 एक्स 256 कैमरा पिक्सेल सेटिंग के साथ 100 एक्स उद्देश्य का प्रयोग कर रहे हैं) पर साथइमेजिंग फील्ड के प्रत्येक क्वाड्रंट में कम से कम एक एफडीआर मौजूद है। अगर एफडीएस क्लस्टर होने लगते हैं ( यानी एफडीएस के आस-पास एफडीएस की तुलना में काफी अधिक संकेत और 200 एनएम से बड़ा प्वाइंट स्प्रेड फ़ंक्शन होता है), 1 मिनट के लिए 6,800 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र एफडीएस, और एफडीएन तैरनेवाला का उपयोग करते हुए कोटिंग प्रक्रिया को दोहराएं।
- प्रत्येक कुएं में 250 μl विरोधी सीडी 3 एंटीबॉडी (10 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें और 1 घंटा 37 डिग्री सेल्सियस पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर लें।
- समाधान निकालें और 30 सेकंड के लिए 1x पीबीएस जोड़ें इस वॉश चरण को 5 बार दोहराएं (5x धो लें)
- 800 मिनट के लिए आरकेएफ में जर्कट टी कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर स्पिन करें और 300 μl 1x एचबीएस समाधान में रिसासपेंड करें। जर्कट टी कोशिकाओं को कताई से पहले 0.5-1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में होना चाहिए। 1x एचबीएस समाधान में हेप्से बफर खारा शामिल है जो पहले से 22 वर्णित है जैसे 1% गोजातीय सीरम एल्बिन
- 150 μL जोड़ेंप्रत्येक कुएं में 1x एचबीएस समाधान का और 37 मिनट से 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- प्रत्येक अच्छी तरह से 50 μL रिसाजंड जर्कट टी कोशिकाओं को जोड़ें और 37 मिनट पर 3 मिनट के लिए सेते रहें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से 300 μL का 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेवन करें।
- 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें
- कक्ष अस्थायी पर 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटॉन-एक्स समाधान के 250 μL जोड़कर कोशिकाओं को स्थिर करें।
- 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें
- कमरे में अस्थायी 30 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 1x पीबीएस में 250 μL 1% मछली जिलेटिन समाधान जोड़ें।
- 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें
- कक्ष अस्थायी पर 1 घंटा के लिए तय कोशिकाओं के लिए 0.1-0.5 μg / एमएल पर लेबल एंटीबॉडी के 200 μL जोड़ें।
- 1x पीबीएस के साथ 5x धो लें
- 1 एमएल स्टोरम बफर को जोड़ें और हवा के संपर्क को सीमित करने के लिए एक गिलास कसलीप के साथ चैम्बर को कवर करें। STORM बफर को पहले 10 वर्णित किया गया है हम मा की सलाह देते हैंइमेजिंग के प्रत्येक दौर के लिए राजा के नए स्टोयर बफर और प्रेफिटेट्स को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 20800 आरसीएफ पर स्टोर्म बफर कताई।
- टीआरएफएफ मोड में कम 647 एनएम लेजर शक्ति का उपयोग करना, दृश्य के क्षेत्र में कम से कम 3 एफएडी के साथ दाग वाले सेल की स्थिति जानें। एफडीएस को खोजने में सहायता के लिए, 568 एनएम लेजर के साथ सहवर्ती उत्तेजना का उपयोग एफडीएन सिग्नल की चमक बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।
नोट: अनुभाग 2.1 में वर्णित औसत फ्यूडियल सुधार का प्रदर्शन, अधिक एफडीएस को शामिल करने में सुधार करता है। - 647 एनएम लेजर शक्ति बढ़ाएं और चित्र प्राप्त करें हम आमतौर पर 200 एमएस एक्सपोजर, 125 एमडब्ल्यू 647 एनएम लेजर, 100 एक्स टीआईआरएफ ऑब्जेक्ट लेंस (1.4 9 एनए), 100 एक्स ईएम गेन (5 मेगाहर्ट्ज में 16 बिट, रूपांतरण लाभ 1) पर 10,000 फ़्रेम प्राप्त करते हैं। हमारे इमेजिंग सेटअप का विवरण पहले 10 में वर्णित किया गया है
- 1x टीबीएस के साथ 5x धो लें
- 1 मिली ओ जोड़ेंएफ एल्यूशन बफर (3.5 एम एमजीसीएल 2 , 20 मिमी पाइप, 0.1% ट्विल -20, पीएच 6.5) और 1 मिनट के लिए कमरे के अस्थायी रूप से सेते हैं।
- लुभाने को 3 बार दोहराएं (सटीक क्षीणन की स्थिति और सिग्नल को हटाने के लिए आवश्यक एल्युशन रिन्स की संख्या प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए जांच की जानी चाहिए)।
- 1x टीबीएस के साथ 3x धो लें और 1 एमएल 1x पीबीएस जोड़ें।
- Photobleach 605 एनएम लेजर के साथ उच्च शक्ति (125 मेगावाट) पर 647 एनएम लेजर का उपयोग करके 2-5 एमडब्ल्यू पर फोटो सक्रिय करने के लिए अंधेरे राज्य में ए 647 रंजक। जब तक गैर-एल्यूटेड एंटीबॉडी से शेष सिग्नल फोटोब्लैच किया गया हो, तब तक प्रतीक्षा करें। आमतौर पर यह 2-5 एस लेजर एक्सपोजर लेता है। 1.3.5 में एसओटीएम सेटिंग्स का इस्तेमाल करते हुए नमूना चित्र (~ 100 फ़्रेम) प्राप्त करना और संकेत हटाने की पुष्टि करने के लिए फोटोबलीचिंग की सिफारिश की गई है।
आम तौर पर हम इस पद्धति का उपयोग करते हुए 99.8% सिग्नल निकाल देते हैं। हम पहले से दिखाए गए अनुसार मैडस्टोरम में उपयोग किए जाने से पहले प्रत्येक एंटीबॉडी के एलायूट दक्षता का परीक्षण करने की सलाह देते हैं। - 15 मिनट के लिए 250 μL 4% पैराफॉर्मालाहैड जोड़ें यह जनसंपर्कघटनाएं सेल में निश्चित अणुओं के क्रॉस-लिंकिंग को उलटा देती हैं।
- 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें
- कई लक्ष्यों के अनुक्रमिक लेबलिंग के लिए 1.3.1-1.3.12 चरणों को दोहराएं। चित्रा 1 चित्रा 1 एक सक्रिय Jurkat टी सेल में एकाधिक अणुओं की एक समग्र छवि को प्रदर्शित करता है madstorm का उपयोग कर अधिग्रहण
2. मल्टीप्लेक्स छवि स्टैक के बहाव सुधार और संरेखण
- मैडस्टोरम छवि स्टैक का बहाव सुधार
- ImageJ का उपयोग करके छवियां खोलें ImageJ में खोलने से पहले हम छवि फ़ाइलों को एक TIFF प्रारूप में परिवर्तित करने की सलाह देते हैं। एकल एफडीएम का चयन करने के लिए आयत ROI का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि एफडीडी छवि स्टैक के हर फ्रेम में दिखाई देने के लिए समय चूक करें। थंडरस्टोरएम प्लगइन में एफडीआई को स्थानीय बनाने के लिए रन विश्लेषण का उपयोग करें। 2.1.5 में वर्णित औसत फ्यूडियल सुधार विधि के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक छवि फ्रेम में एक एकल एफडीडी स्थानीयकृत है ( यानी पहचान की चोटियों की संख्या ई होना चाहिएतख्ते की संख्या के लिए योग्य)
- अगर हर फ्रेम में एफडीडी की पहचान नहीं है, तो दूसरा एफडीएन चुनें। यदि एक से अधिक चोटियों को एक ही फ्रेम में स्थित किया गया है, तो पिछली चोटियों से सबसे अधिक भटकने वाले शिखर को हटा दें।
- छवि स्टैक में प्रत्येक एफडीडी के लिए 2.1.2 को दोहराएं। ध्यान रखें कि कुछ एफडीडी को बहाव सुधार प्रक्रिया में शामिल नहीं किया जाना चाहिए ताकि वे चरण 2.1.7 में बताए अनुसार बहाली सुधार परिशुद्धता के लिए एक स्वतंत्र गेज के रूप में काम कर सकें।
- तेजी से, कम सटीक बहाव सुधार के लिए, या तो क्रॉस सहसंबंध या Fiducial सुधार एल्गोरिदम का उपयोग थर्डस्टोरएम में शामिल है ताकि FND चित्रों को ठीक किया जा सके। आमतौर पर, हम 100 पारितोषिक, 5 बढ़ाई, और 0.1 पारस्परिक संबंध के लिए 0.1 प्रक्षेपवक्रय चौरसाई कारक का उपयोग करते हैं और 10 अधिकतम दूरी, 0.1 मिनट की मार्कर दृश्यता अनुपात, और 0.01 फ्रिडियल सुधार के लिए प्रक्षेपवक्रय चौरसाई फैक्टर का उपयोग करते हैं। क्रॉस कॉरलेशन और फ़िड्यूअल सुधार से सुधार फ़ाइल उत्पन्न होगी जो कि बहाव सुधार परिशुद्धता का परीक्षण करने के लिए अन्य एफडीएस पर लागू की जा सकती है।
- अधिक कठोर, अधिक सटीक बहाव सुधार के लिए, पहले से बताए गए अनुसार औसत फ्यूडियल सुधार (एएफसी) एल्गोरिथम का उपयोग करें इस प्रक्रिया को पैरामीटर के अनुकूलन की आवश्यकता नहीं है और SMLM स्थानीयकरण एल्गोरिदम द्वारा अनुमानित तुलना में उच्च स्थानीयकरण सटीकता पैदावार की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, औसत बहाव सुधार के लिए कम से कम 4 एफडीएस की आवश्यकता होती है और एफडीएस के लिए छवि स्टैक के हर फ्रेम में स्थानीयकृत होना चाहिए। एएफसी की बहाली सुधार अधिक एफडीएस को शामिल करने के साथ बेहतर प्रदर्शन करती है क्योंकि बड़ी संख्या में स्थानीय एफडीएस एक दिए गए फ्रेम में आउटएयर पीक के विकृत प्रभाव को कम कर देगी।
- थ्रेडरस्टोरम का इस्तेमाल करते हुए छवि स्टैक के भीतर सभी बिंदु प्रसार कार्यों को स्थानीयकरण करें जैसा कि पहले से वर्णित है 10 हम आम तौर पर 100 एनएम के पिक्सेल आकार, 4.28 के ए / डी की गणना के अनुसार फोटोएक्लटरन, 100 के आधार स्तर ए / डी की गणना, 100 का ईएम लाभ, पीएसएफ: एकीकृत गाऊसी स्थानीयकरण, 5 पिक्सेल फिटिंग त्रिज्या, अधिकतम संभावना फिटिंग विधि और 1.3 पिक्सेल प्रारंभिक सिग्मा
- संपूर्ण छवि स्टैक से एफडीएस से स्थानांतरित करने के लिए बहाव सुधार कारक को लागू करें। उचित बहाव सुधार ( चित्रा 2 ) सुनिश्चित करने के लिए अंतिम छवि का निरीक्षण करें। परिणामी ड्रॉफ्ट सुधार कारक को स्वतंत्र रूप से एफडीएस पर परीक्षण किया जाना चाहिए, जो कि एएफसी प्रक्रिया में शामिल नहीं है, ताकि ड्रॉफ्ट सुधार परिशुद्धता के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सके। बहाव-सही, स्वतंत्र एफडीएस की सटीकता 2.1.6 चरण में उपयोग किए गए स्थानीयकरण एल्गोरिथ्म से गणना की गई औसत सटीकता / अनिश्चितता मूल्य के करीब होना चाहिए।
- अनुक्रमिक लेबल वाले एंटीबॉडी के मैडमस्टाम छवि स्टैक के लिए 2.1.1-2.1.7 के चरण दोहराएं। ध्यान रखें कि प्रत्येक मैडमस्टार्म छवि स्टैक में एफडीएस के एक ही सेट को स्थानीयकरण निम्न संरेखण प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है।
- मैडस्टोरम छवियों का संरेखण
- प्रत्येक मैडमस्टार्म छवि में फिक्स्ड फिक्स्ड फिक्स्ड के केंद्र की स्थिति की गणना करें। ऐसा करने के लिए, मतलब एक्स और वाई अक्ष पोप्रत्येक स्थानीयकृत एफडीडी के लिए शयन, और प्रत्येक मदस्टोरम छवि में सभी एफडीएस के माध्य x और y पदों का औसत। इस चरण के लिए विस्तृत एल्गोरिथ्म को पहले 10 में वर्णित किया गया है। FND Fiducial मार्करों के centroid पदों का उपयोग कर अनुक्रमिक madstorm छवियों को संरेखित करें। संरेखण करने के लिए, दो स्थानीय मैडस्टोरम छवियों के बीच ऑफसेट की गणना करें, पहले से दूसरे मदस्टोरम छवि में एफडीएस की केंद्रक स्थिति को घटाकर। फिर दूसरी मैडस्टोरम छवि में सभी स्थानीयकरणों से ऑफ़सेट राशि घटाना।
- हम एक संदर्भ छवि के रूप में पहली मदस्टोरम छवि का उपयोग करने की सलाह देते हैं और पहले और तीसरे, प्रथम और चौथे, आदि के बीच इस संरेखण चरण को दोहराते हैं। संरेखण प्रक्रिया में शामिल नहीं होने वाले FND के बीच की ऑफसेट को मापकर संरेखण सटीकता का परीक्षण करें। बड़े ऑफसेट्स से संकेत मिलता है कि अनुक्रमिक पागलों की छवियों के केंद्र की स्थिति की गणना करते समय एफडीएस के विभिन्न सेटों का उपयोग किया गया था।
- यदि हां, तो 2.2.1-2.2.2 कदमएलडी को संरेखण करने के लिए एफडीएस के समान सेट का इस्तेमाल दोहराया जा सकता है।
नोट: एएसी बहाव सुधार और संरेखण प्रक्रिया दोनों के लिए कस्टम कोड प्रदान किए गए हैं।
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Representative Results
एक सक्रिय जर्कट टी सेल ( चित्रा 1 , आंकड़ा संरेखण की जाँच करें) में माइक्रोकॉल्स्टर्स और अन्य संरचनाओं की मल्टीप्लेक्सेड मदस्टोरम छवि का उत्पादन करने के लिए अनुक्रमिक क्षीणन और धुंधला विधि का उपयोग किया गया था। प्रत्येक छद्म रंग की छवि 1.1.1 से 1.3.13 के चरण में हासिल की गई एक राक्षसी मैडमस्टार्म इमेजिंग का प्रतिनिधित्व करती है। जैसा कि पहले 10 वर्णित है, मल्टिप्लेक्क्ड लक्ष्य के बीच क्रोसस्टल से बचने के लिए पिछले, गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी से अवशिष्ट सिग्नल के लिए दृश्य के क्षेत्र की निगरानी की जानी चाहिए। इसके अलावा, चूंकि एंटीबॉडी में अलौकिक दक्षता भिन्न हो सकती है, अनुक्रमिक बहुसंकेतन के क्रम को सबसे अच्छे से सबसे खराब लुप्त हो जाना एंटीबॉडी से व्यवस्थित किया जाना चाहिए ताकि एपोटॉप के अवरोधन को कम किया जा सके। 1 चित्रा में वर्णित के रूप में एएफसी और एफडीडी एफिड्यूशियल मार्करों का उपयोग करके बहाव और संरेखण के लिए चित्रा 1 में अंतिम मैडमस्टॉर्म छवि को सही किया गया है।
चित्रा 2 ए , 2 बी ) और एक सक्रिय जर्कट टी सेल ( चित्रा 2 सी , 2 डी ) से स्थानीयकरण पर एएफसी करने के लिए किया गया था। दिए गए एल्गोरिदम का इस्तेमाल करते हुए चरण 2.1.1-2.1.8 में वर्णित अनुसार एएफसी बहाव सुधार किया गया था। सबसे पहले, बहाव सुधार के बाद छवि का दृश्य निरीक्षण ( छवि 2 सी ) को बहाल सुधार एल्गोरिदम के उचित अनुप्रयोग को सुनिश्चित करने के लिए अनुशंसित है। दूसरा, एएफसी द्वारा प्राप्त परिशुद्धता की पुष्टि करने के लिए दोनों एक्स और वाई अक्ष में स्थानीयकरण के मानक विचलन को मापने की सिफारिश की गई है। जैसा कि पहले 10 की सूचना दी, एएफसी आम तौर पर विभिन्न स्थानीयकरण एल्गोरिदम द्वारा अपेक्षित तुलना में बेहतर परिशुद्धता पैदा करता है।
चित्रा 1: ( ए बी ) ए स्केल बार = 500 एनएम में बॉक्सिंग क्षेत्र की विस्तारित छवि इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: एक एफडीएम की एसएमएलएम छवि 30,000 छवि फ़्रेमों में स्थानीयकृत ( ए ) से पहले और ( बी ) औसत फ्यूडियल सुधार के साथ बहाव सुधार के बाद स्केल बार = 20 एनएम (ए और बी) एक सक्रिय जर्कट टी सेल की एसएमएलएम छवि सना हुआ वाईवें विरोधी phosphorylated SLP76 (Y128) एंटीबॉडी और FND fiducial मार्करों ( सी ) पहले और ( डी ) औसत सुधार के साथ बहाव के सुधार के बाद स्केल बार = 2 सुक्ष्ममापी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
मैडस्टोरम में अनुक्रमिक बहुसंकेतन, बहाव सुधार, और संरेखण प्रक्रिया कोशिकाओं में हीटरोजीनस संरचनाओं के सटीक, अत्यधिक मल्टीप्लेक्स दृश्य की अनुमति देते हैं। 10 इसके अलावा, मैडमस्टोर रंगीन अवरोधन और उप-इष्टतम फोटोविचिंग / गैर-दूरदराज के लाल रंगों 9 , 12 के उत्सर्जन गुणों जैसे बहु रंग की तारों की सीमाओं से बचा जाता है। चूंकि उपार्जन चरण में क्रमिक रूप से बाउंड एंटीबॉडीज से सीढ़ी के हस्तक्षेप में काफी कमी आती है, मैडमस्टोरएम का उपयोग 9-10 , 15 , 21 की पिछली तकनीकों द्वारा प्राप्त मल्टीप्लेक्स इमेजिंग के 6-10 दौर से परे कोशिका के नमूनों के दोहराए इमेजिंग करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, अनुक्रमिक क्षीणन और धुंधला हो जाना कदम एसएमएलएम तक ही सीमित नहीं हैं और अन्य इमेजिंग तकनीकों जैसे कि कन्फोकल माइक्रोस्कोपी, सिम और दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, उस पागल को दियाटोम एक अनुक्रमिक प्रतिरक्षा तकनीक है, यह तकनीक प्रत्येक लक्षित अणु के लिए एंटीबॉडी की उपलब्धता के द्वारा सीमित है। प्रत्येक एंटीबॉडी को सावधानीपूर्वक जांचनी चाहिए ताकि विशिष्टता सुनिश्चित हो सके, दक्षता लेबलिंग और अलौकिक क्षमता हो सके।
मदस्टोरम के लिए अधिग्रहण की सेटिंग्स को व्यक्तिगत फोटोविचिंग इवेंट की पहचान को अधिकतम करने के लिए चुना गया था, जिससे हमें 2.5 एनएम औसत स्थानीयकरण सटीक प्राप्त करने की इजाजत मिल सके। हालांकि, उच्च परिशुद्धता समय की व्यय पर आती है, जिसमें पहले से 10 के रूप में चर्चा की गई प्रत्येक मैडोस्टर एम इमेजिंग के लिए ~ 3 एच की आवश्यकता होती है निचला स्थानीकरण परिशुद्धता (5-10 एनएम) में तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए, एक छोटा जोखिम समय और उच्च ईएम लाभ की सिफारिश की जाती है ( जैसे 20 एमएस एक्सपोजर, 300 एक्स ईएम लाभ, 17 मेगाहर्ट्ज पर 16 बिट, रूपांतरण लाभ 3)। इसके अलावा, मल्टीप्लेक्सिंग के पैमाने को बढ़ाने के लिए मस्तसर एमेजिंग के प्रत्येक दौर के लिए मल्टी-रंग इमेजिंग ( जैसे एटो -488, एलेक्सा -568 और एलेक्सा -647 एनएम) किया जा सकता है, हालांकि वाईरंगीन विपथन के कारण संरेखण सटीकता में कमी।
हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सफलतापूर्वक 25 राउंड मैडमस्टार्म इमेजिंग का प्रदर्शन किया है। चूंकि सूक्ष्मदर्शी चरण पर स्थित कवरलीप कक्ष के साथ पूरी प्रक्रिया की जाती है, उसी स्थिति में कंसलिप कक्ष को सुरक्षित करना महत्वपूर्ण है। ऐसा करने के लिए ऑटो फोकस मोड का उपयोग करें और माइक्रो क्लॉम्प का उपयोग करके माइक्रोस्कोप मंच पर कक्ष को माउंट करें। यदि महत्वपूर्ण चरण के बहाव आ गया है, तो सेल नमूना को पुनः केन्द्रित करने के लिए FND Fiducial मार्करों के ज्ञात पदों का उपयोग करें।
गठबंधन मैडस्टोरम छवियों के एक साथ दृश्यता चुनौतीपूर्ण हो सकता है एक साथ 7 या कम मैडमस्ट्रीम छवियों को देखने के लिए, एक छद्म रंगीन कम्पोजिट छवि बनाने के लिए ImageJ में रंग / मर्ज चैनल का उपयोग करें। 8 या अधिक चित्रों के लिए, मदस्टोर्म की छवियों को अलग-अलग समूहों में कैटलॉग करने, प्रत्येक समूह को एक समग्र छवि में विलय करने और प्रत्येक संमिश्र छवि पर एक एकल LUT रंग लागू करने की सलाह दी जाती है।
10 अंत में, एनवी के लिए - रिक्ति एफडीएस के लिए, स्थैतिक चुंबकीय क्षेत्र 23 के प्रयोग से उत्सर्जन की तीव्रता को 50% तक कम किया जा सकता है। तीव्रता में कमी लगभग 500 गॉस तक रैखिक होती है, जिस पर ईएफएफसीटी संतृप्त व्यवहार में, देखने के क्षेत्र में हीरे की तीव्रता, शीर्ष से सूक्ष्मदर्शी स्लाइड के करीब एक स्थायी चुंबक लाकर, वांछित डिग्री तक कम हो सकती है।
अन्त में, हमने एटिबॉडी बफर को टी सेल माइक्रोकल्स्टर के आणविक घटकों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया। मैडस्टोरम केवल टीसीआर माइक्रो कंप्यूटर से ही सीमित नहीं है, हालांकि, इस तकनीक 10 का उपयोग करके माइक्रोोट्यूब्यूल्स, मितोचोनड्रिया, एफ-एक्टिन, वीमेंटिन और अन्य आणविक संरचनाओं को चित्रित किया गया है। अन्य सेलुलर डिब्बों को लक्षित करने वाले एंटीबॉडीज़ के लिए, उच्च तापमान, निचले पीएच और अलौकिक बफर के लंबे समय तक ऊष्मायन जैसे एपिटो बाइंडिंग को बाधित करने के लिए अतिरिक्त कदमों की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, अल्यूशन बफर गैर-आयनिक संपर्कों के विघटन को रोकने के लिए संवेदनशील झिल्ली संरचनाओं को लक्षित करने के लिए ट्विन -20 के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है। हम भविष्य के प्रयोगों में देखते हैं कि अलौकिक बफर संरचना व्यक्तिगत एंटीबॉडीज के लिए तैयार की जाएगीओ elution दक्षता और नमूना संरक्षण का अनुकूलन। इसके अलावा, सक्रिय टी कोशिकाओं में आवेदन से परे, मैडमस्टॉर्म अन्य प्रणालियों के साथ व्यावहारिक हो सकता है जिसमें इन विट्रो आणविक परिसरों, विभिन्न सेल प्रकार और टिशू वर्ग शामिल हैं। मैडस्टोरम प्रोटोकॉल के विभिन्न मापदंडों, जैसे निर्धारण, permeabilization, एंटीबॉडी धुंधला हो जाना, और अल्यूशन बफर संरचना प्रत्येक लक्षित सिस्टम के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी।
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Disclosures
हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
हम STORM माइक्रोस्कोप तक पहुंच के लिए Xufeng वू धन्यवाद इस शोध को नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (एनसीआई) के कैंसर अनुसंधान केंद्र और राष्ट्रीय हार्ट फेफड़े और रक्त संस्थान (एनएचएलबीआई) के अंदरूनी अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
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