Summary
Demostramos un método para la imagen de múltiples moléculas dentro de nano-estructuras heterogéneas con una sola molécula exactitud utilizando secuencial vinculante y elución de fluorescently marcó anticuerpos.
Abstract
La creación de imágenes de estructuras celulares heterogéneas mediante la microscopía de localización de moléculas individuales se ha visto dificultada por la precisión de localización y la capacidad de multiplexación inadecuadas. Utilizando marcadores fiduciales fluorescentes de nano-diamante, describimos los procedimientos de corrección y alineación de deriva requeridos para obtener alta precisión en microscopía de localización de molécula única. Además, se describe una nueva estrategia de multiplexación, madSTORM, en la que se dirigen múltiples moléculas en la misma célula usando unión secuencial y elución de anticuerpos fluorescentes. MadSTORM se demuestra en una célula T activada para visualizar las ubicaciones de los diferentes componentes dentro de una membrana-bound, multi-proteína estructura llamada el microcluster de células T receptor. Además, se discute la aplicación de madSTORM como una herramienta general para la visualización de estructuras multi-proteína.
Introduction
Se han desarrollado una variedad de técnicas de microscopía de super resolución para superar el límite de difracción de la microscopía óptica (~ 200 nm). Entre éstas se encuentra una categoría de técnicas denominadas microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM) que incluye microscopía de localización por fotoactivación (PALM) y microscopía óptica de reconstrucción estocástica (STORM). Las técnicas SMLM comparten el uso de fluoróforos que pueden ser conmutados entre los estados (fluorescente) y apagado (oscuro / foto-conmutado), permitiendo la localización secuencial de la fluorescencia de las moléculas individuales 1 , 2 , 3 .
Debido a su compatibilidad con colorantes y microscopios comercialmente disponibles, STORM directa (dSTORM) se ha convertido en una técnica SMLM ampliamente adoptada 4 . DSTORM puede alcanzar rutinariamente una precisión de localización de ~ 10 nm, definida como la incertidumbre en el cálculo del centro de un difractoFunción de propagación de puntos limitados por iones (PSF). Sin embargo, a pesar de la alta precisión estimada utilizando los algoritmos de localización 5 , 6 , 7 , la determinación exacta de la ubicación real de las moléculas individuales se ha visto obstaculizada por una serie de cuestiones. En primer lugar, el movimiento mecánico de la etapa del microscopio durante la adquisición de imágenes añade una incertidumbre significativa a la precisión de localización. Como las imágenes SMLM se obtienen a lo largo de miles de marcos de lapso de tiempo, los movimientos a escala nanométrica de la etapa del microscopio pueden comprometer significativamente la precisión de la imagen de superresolución final 8 . Para compensar el movimiento de la etapa durante la adquisición de la imagen, la deriva de la etapa es comúnmente estimada a partir de la adaptación basada en regresión de localizaciones binned de la propia imagen (correlación cruzada) o localizaciones secuenciales de los marcadores fiduciales (corrección fiducial) 1 , 9 . Sin embargoEstos métodos requieren la optimización de múltiples parámetros para cada pila de imágenes y no pueden dar cuenta de movimientos de escenario a escalas de tiempo cortas tales como vibración mecánica. Las nanopartículas de oro y las bolas fluorescentes multicolores se han utilizado como marcadores fiduciales en SMLM, pero no son foto-estables y resultan en una precisión significativamente menor después de la corrección de la desviación que los nano-diamantes fluorescentes (FND) En madSTORM 10 .
Además del límite de difracción, la microscopía óptica está restringida además por límites espectrales. La visualización simultánea de objetivos múltiples requiere sondas fluorescentes con perfiles espectrales que no se superponen, restringiendo generalmente la microscopía de luz basada en fluorescencia a 6 colores y SMLM a 2-3 colores 4 , 11 , 12 . Además, la aberración cromática no lineal causa desalineación de las imágenes multicolor, wQue requieren amplios procedimientos de alineación utilizando marcadores fiduciales multicolor 8 , 13 . Para superar estos límites, los estudios previos han imaginado múltiples objetivos utilizando fotoblanqueo repetitivo o quimioterapia química de fluoróforos unidos secuencialmente 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Aunque estos métodos pueden superar los límites espectrales de la microscopia, el blanqueo por fluorescencia es conocido por ser un proceso tóxico 20 , y el blanqueo o apagado prolongado puede causar efectos secundarios no deseados tales como pérdida de reticulación. Además, la acumulación de sondas fluorescentes podría conducir al bloqueo estérico de sitios de unión en la muestra, impidiendo la multiplexación a gran escala y la focalización robusta de epítopos. Para evitar tal interferencia estérica, una recienteTudy logrado multiplexing utilizando intercambio estocástico de libremente difundir fragmentos de proteínas [ 21] . Mientras que este método permite el etiquetado denso de las estructuras celulares, requiere una preparación bioquímica extensa para aislar fragmentos peptídicos, no puede localizar posiciones de una sola molécula y no facilita fácilmente el multiplexado a gran escala usando sondas comercialmente disponibles. Presentamos un protocolo detallado de video que describe la unión secuencial y la elución de anticuerpos fluorescentes para la obtención de imágenes dSTORM (madSTORM) de tamaño limitado de anticuerpos, y el uso de nano-diamantes fluorescentes para lograr corrección y alineación precisa de la deriva.
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Protocol
Precaución: Antes de usar, consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) pertinentes. Varios de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y carcinógenos. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando realice el protocolo, incluyendo el uso de controles de ingeniería (campana extractora de humos, guantera) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados).
1. Imágenes multiplexadas de células T activadas
- Directamente conjugar los anticuerpos con Alexa-647 (A647) colorante utilizando el Alexa 647 kit de marcaje de anticuerpos. Siga el protocolo de etiquetado proporcionado por el fabricante.
NOTA: Se recomienda la diálisis de la solución de anticuerpo en 1x PBS antes de este paso para aumentar la eficacia del etiquetado del anticuerpo. - Girar los anticuerpos marcados durante 5 min a 20.800 rcf y recoger el sobrenadante para eliminar los anticuerpos agregados.
- Preparación de cubreobjetos fluorescentes recubiertos de nano-diamante
- Preparar una dilución de 100 nm FNDs en 1x PBS. Pruebe varias diluciones para asegurarse de que hay suficientes FNDs visibles en cada campo de visión en el paso 1.2.7 (estamos usando una dilución 1: 200 de FNDs proporcionada por el fabricante).
- Vórtice los FNDs diluidos durante 1 min.
- Sonicar el sobrenadante FND durante 30 s en un ajuste de alta potencia.
- Incubar el sobrenadante de FND sonicado en una cámara de cubreobjetos de 8 pocillos revestidos con PLL durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lavar 5 veces con 1x PBS y visualizar la cámara recubierta de FND usando una excitación con láser de 647 nm en el microscopio TIRF. Idealmente, 4-10 FNDs individuales deben ser visibles en un campo de vista dada la dilución apropiada de FNDs en la etapa 1.2.2 (estamos usando un objetivo 100X con 256 x 256 de configuración de píxeles de cámara para producir 61 x 61 μm de campo de visión) con enMenos un FND presente en cada cuadrante del campo de imagen. Si los FND parecen estar agrupados ( es decir, FNDs con señal significativamente más alta que los FNDs circundantes y una función de propagación de puntos mayor de 200 nm), centrifugar los FND a 6,800 rcf durante 1 min y repetir el procedimiento de revestimiento usando el sobrenadante FND.
- Añadir 250 μl de anticuerpo anti-CD3 (10 μg / ml) en cada pocillo e incubar durante 1 hora a 37 ° C, o durante la noche a 4 ° C.
- Retire la solución y agregue 1x PBS durante 30 s. Repita este paso de lavado 5 veces (lavado 5x).
- Hilar 1 ml de células Jurkat T a 800 rcf durante 6 min y resuspender en 300 μl de solución 1x HBS. Las células T de Jurkat deberían estar idealmente a una concentración de 0,5-1,0 x 106 células / ml antes del hilado. 1x solución HBS consiste en solución salina tampón HEPES con albúmina sérica bovina al 1% como se ha descrito anteriormente 22 .
- Añadir 150 μLDe una solución de HBS 1x en cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 15 min.
- Añadir 50 μL de células T Jurkat resuspendidas a cada pocillo e incubar durante 3 minutos a 37 ° C.
- Añadir 300 μL de Paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 ° C.
- Lavar 3 veces con 1x PBS.
- Permeabilizar las células mediante la adición de 250 μL de solución de Triton-X al 0,1% durante 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces con 1x PBS.
- Añadir 250 μl de solución de gelatina de pescado al 1% en 1x PBS a cada pocillo durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces con 1x PBS.
- Añadir 200 μl de anticuerpo marcado a 0,1-0,5 μg / mL a células fijas durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar 5 veces con 1x PBS.
- Añadir 1 ml de tampón STORM y cubrir la cámara con un cubreobjetos de vidrio para limitar la exposición al aire. El buffer de STORM se ha descrito previamente 10 . Recomendamos maRey nuevo STORM buffer para cada ronda de imágenes y girar el buffer STORM a 20.800 rcf durante 2 min para eliminar los precipitados.
- Usando baja potencia láser de 647 nm en el modo TIRF, ubique una célula manchada con al menos 3 FND en el campo de visión. Para facilitar la localización de FNDs, se puede utilizar la excitación concomitante con láser de 568 nm para aumentar el brillo de la señal FND.
NOTA: El rendimiento de la corrección fiducial promedio descrita en la sección 2.1 mejora con la inclusión de más FND. - Aumentar la potencia láser de 647 nm y adquirir imágenes. Normalmente adquirimos 10.000 fotogramas a una exposición de 200 ms, láser de 125 mW 647 nm, lentes objetivo 100X TIRF (1,49 NA), ganancia 100X EM (5 MHz a 16 bits, ganancia de conversión 1). Los detalles de nuestra configuración de imagen se han descrito anteriormente 10 .
- Lavar 5x con 1x TBS.
- Añadir 1 ml oF de tampón de elución (MgCl $ ₃ $ 3,5 M, PIPES 20 mM, Tween-20 al 0,1%, pH 6,5) e incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
- Repetir la elución 3 veces. (Deben determinarse las condiciones exactas de elución y el número de enjuagues de elución necesarios para eliminar la señal para cada anticuerpo utilizado).
- Lavar 3 veces con 1x TBS y añadir 1 ml de 1x PBS.
- Photobleach usando láser de 647 nm de alta potencia (125 mW) con láser de 405 nm a 2-5 mW para activar fotoactivamente los colorantes A647 en estado oscuro. Espere hasta que toda la señal restante de anticuerpo no eluido sea fotoblanqueada. Típicamente esto toma 2-5 s de la exposición del laser. Se recomienda adquirir imágenes de muestra (~ 100 fotogramas) utilizando la configuración STORM en 1.3.5 después de la elución y fotoblanqueo para confirmar la eliminación de la señal.
Normalmente eliminamos el 99,8% de la señal utilizando este método. Se recomienda probar la eficiencia de elución de cada anticuerpo antes de su uso en madSTORM como se muestra anteriormente [ 10] . - Añadir 250 mu l de paraformaldehído al 4% durante 15 min. Esta prEventos de reticulación inversa de moléculas fijas en la célula.
- Lavar 3 veces con 1x PBS.
- Repita los pasos 1.3.1-1.3.12 para el etiquetado secuencial de objetivos múltiples. La Figura 1 muestra una imagen compuesta de múltiples moléculas en una célula T de Jurkat activada adquirida usando madSTORM.
2. Corrección de deriva y alineación de pilas de imágenes multiplexadas
- Corrección de la deriva de pilas de imágenes madSTORM
- Abrir imágenes con ImageJ. Recomendamos convertir los archivos de imagen a un formato TIFF antes de abrirlos en ImageJ. Utilice rectángulo ROI para seleccionar un único FND. Reproducir el lapso de tiempo para asegurarse de que el FND es visible en cada marco de la pila de imágenes. Utilice Run Analysis en el complemento ThunderSTORM para localizar el FND. Para el método de corrección fiducial en promedio descrito en 2.1.5, es importante que un único FND se localiza en cada trama de imagen ( es decir, el número de picos identificados debe ser eCalidad al número de fotogramas).
- Si el FND no está identificado en cada trama, seleccione otro FND. Si varios picos se encuentran en un solo cuadro, quite el pico que se desvía más de picos anteriores.
- Repita 2.1.2 para cada FND en la pila de imágenes. Tenga en cuenta que algunos FNDs no deben ser incluidos en el proceso de corrección de deriva para que puedan servir como un indicador independiente para la precisión de corrección de deriva como se describe en el paso 2.1.7.
- Para una corrección de deriva más rápida y menos precisa, utilice los algoritmos de correlación cruzada o de corrección fiducial incluidos en ThunderSTORM para corregir las imágenes FND. Usualmente se usan 100 bins, 5 de aumento, y 0,1 factor de suavizado de trayectoria para correlación cruzada y 10 de distancia máxima, 0,1 min de relación de visibilidad de marcador y 0,01 de factor de suavizado de trayectoria para la corrección fiducial. La correlación cruzada y la corrección fiducial producirán un archivo de corrección que se puede aplicar a otros FND para probar la precisión de corrección de deriva.
- Para una corrección de deriva más estricta y precisa, utilice el algoritmo de corrección fiducial promedio (AFC) como se describió anteriormente 10 . Este proceso no requiere la optimización de los parámetros y proporciona una precisión de localización más alta de lo previsto por los algoritmos de localización SMLM. Sin embargo, la corrección de deriva promedio requiere al menos 4 FNDs y para que los FNDs se localizen en cada trama de la pila de imágenes. La corrección de la deriva de AFC mejora mejor con la inclusión de más FNDs porque un gran número de FND localizados disminuirá el efecto de distorsión de un pico de outlier en un marco dado.
- Localice todas las funciones de propagación de puntos dentro de la pila de imágenes usando ThunderSTORM como se describió anteriormente 10 . Por lo general, usamos un tamaño de píxel de 100 nm, fotoelectrones por recuento A / D de 4,28, recuento A / D de nivel base de 100, ganancia EM de 100, PSF: localización gaussiana integrada, radio de ajuste de 5 píxeles, método de ajuste de máxima verosimilitud y 1,3 Píxel sigma inicial.
- Aplicar el factor de corrección de deriva adquirido de FNDs a las localizaciones de toda la pila de imágenes. Inspeccione visualmente la imagen final para asegurar una correcta corrección de la deriva ( Figura 2 ). El factor de corrección de la deriva resultante debe ser probado independientemente en FNDs no incluidos en el procedimiento AFC para medir el nivel de precisión de corrección de deriva. La precisión de los FND independientes y corregidos por la deriva debería ser cercana al valor promedio de precisión / incertidumbre calculado a partir del algoritmo de localización utilizado en el paso 2.1.6.
- Repita los pasos 2.1.1-2.1.7 para las pilas de imágenes madSTORM de anticuerpos marcados secuencialmente. Tenga en cuenta que la localización del mismo conjunto de FNDs en cada pila de imágenes madSTORM es crítica para el siguiente procedimiento de alineación.
- Alineación de imágenes madSTORM
- Calcule la posición del centroide de los FNDs corregidos por deriva en cada imagen madSTORM. Para hacer esto, encuentre el eje xyy medioPara cada localizada FND, y el promedio de la media xyy posiciones de todos los FNDs en cada madSTORM imagen. El algoritmo detallado para este paso se ha descrito anteriormente 10 . Alinee las imágenes madSTORM secuenciales utilizando las posiciones centróides de los marcadores fiduciales FND. Para realizar la alineación, calcule el desplazamiento entre dos localizadas madSTORM imágenes mediante la sustracción de la posición centroide de FNDs en la segunda madSTORM imagen de la primera. A continuación, resta la cantidad de desplazamiento de todas las localizaciones en la segunda imagen madSTORM.
- Se recomienda utilizar la primera imagen madSTORM como imagen de referencia y repetir este paso de alineación entre el primero y el tercero, el primero y el cuarto, etc. Pruebe la precisión de la alineación midiendo el desplazamiento entre los FND no incluidos en el proceso de alineación. Los desplazamientos grandes pueden indicar que se usaron diferentes conjuntos de FNDs al calcular las posiciones de centroide de las imágenes secuenciales de madSTORM.
- Si es así, los pasos 2.2.1-2.2.2 shouLd se repita utilizando el mismo conjunto de FNDs para realizar la alineación.
NOTA: Se proporcionan códigos personalizados para los procedimientos de corrección de deriva de AFC y de alineación.
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Representative Results
Se utilizó el método secuencial de elución y tinción para producir la imagen madSTORM multiplexada de microclusters y otras estructuras en una célula T de Jurkat activada ( Figura 1 , alineaciones de figuras de comprobación). Cada imagen pseudo-coloreada representa una ronda de formación de imágenes madSTORM adquirida en los pasos 1.1.1 a 1.3.13. Como se ha descrito anteriormente 10 , el campo de visión debe ser monitorizado para detectar la señal residual de anticuerpos previos no eluidos para evitar la diafonía entre dianas multiplexadas. Además, como la eficacia de elución puede variar entre anticuerpos, el orden de multiplexación secuencial debe estar dispuesto del anticuerpo de elución mejor a peor para minimizar el bloqueo estérico de epítopos. La imagen madSTORM final en la Figura 1 se ha corregido para la deriva y la alineación utilizando AFC y FND marcadores fiduciales como se describe en la sección 2.
Figura 2A , 2B ) y una célula Jurkat T activado ( Figura 2C , 2D ). La corrección de deriva AFC se realizó como se describe en los pasos 2.1.1-2.1.8 utilizando los algoritmos proporcionados. Primero, se recomienda la inspección visual de la imagen después de la corrección de la deriva ( Fig. 2C ) para asegurar la correcta aplicación del algoritmo de corrección de deriva. En segundo lugar, se recomienda medir la desviación estándar de las localizaciones en ambos ejes X e Y para confirmar la precisión alcanzada por AFC. Como se informó anteriormente 10 , AFC típicamente produce una mejor precisión de lo esperado por varios algoritmos de localización.
Figura 1: ( A B ) Imagen ampliada de la región en caja en A. Barra de escala = 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen SMLM de un único FND localizado en 30.000 fotogramas ( A ) antes y ( B ) después de la corrección de la deriva con una corrección fiducial promedio. Barras de escala = 20 nm (A y B). Imagen SMLM de una célula T Jurkat activada teñida wiEl anticuerpo anti-fosforilado SLP76 (Y128) y los marcadores fiduciales FND ( C ) antes y ( D ) después de la corrección de la deriva con una corrección fiducial promedio. Barra de escala = 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los procedimientos de multiplexación secuencial, corrección de deriva y alineación en madSTORM permiten una visualización precisa y altamente multiplexada de estructuras heterogéneas en células. 10 Además, madSTORM evita las limitaciones de la TORMENTA multicolor como la aberración cromática y las propiedades de fotosensibilización / emisión subóptimas de colorantes rojos no lejanos 9 , 12 . A medida que la etapa de elución reduce significativamente la interferencia estérica de los anticuerpos unidos secuencialmente, madSTORM puede utilizarse para realizar imágenes repetidas de muestras de células más allá de las 6-10 rondas de imágenes multiplexadas logradas mediante técnicas anteriores 9 , 15 , 21 . Además, las etapas de elución y tinción secuenciales no están restringidas a SMLM y pueden usarse para otras técnicas de formación de imágenes tales como microscopía confocal, SIM y microscopía de dos fotones. Sin embargo, dado que madSTORM es una técnica de inmunotinción secuencial, esta técnica está limitada por la disponibilidad de anticuerpos para cada molécula diana. Cada anticuerpo debe ser cuidadosamente probado para asegurar la especificidad, la eficacia del etiquetado y la capacidad de elución.
Las configuraciones de adquisición de madSTORM se eligieron para maximizar la detección de eventos de fotolibración individuales, lo que nos permite alcanzar una precisión media de localización de 2,5 nm. Sin embargo, la alta precisión viene a expensas del tiempo, requiriendo ~ 3 h para cada ronda de madSTORM como se discutió anteriormente 10 . Para una adquisición más rápida de la imagen con una precisión de localización más baja (5-10 nm), se recomienda un tiempo de exposición más corto y una mayor ganancia EM ( por ejemplo , exposición de 20 ms, ganancia 300X EM, 17 MHz a 16 bits y ganancia de conversión 3). Además, se pueden realizar imágenes multicolores ( por ejemplo, Atto-488, Alexa-568 y Alexa-647 nm) para cada ronda de imágenes de madSTORM para aumentar la escala de multiplexación, aunque wiTh una disminución en la precisión de alineación debido a la aberración cromática.
Hemos realizado con éxito hasta 25 rondas de madSTORM imágenes utilizando este protocolo. Como todo el procedimiento se realiza con la cámara de cubreobjetos montada en la platina del microscopio, es importante asegurar la cámara de cubreobjetos en la misma posición. Para ello, utilice el modo de enfoque automático y monte la cámara en la platina del microscopio utilizando abrazaderas metálicas. Si se ha producido una deriva significativa de la etapa, utilice posiciones conocidas de marcadores fiduciales FND para centrar de nuevo la muestra celular.
La visualización simultánea de imágenes madSTORM alineadas puede ser un desafío. Para ver simultáneamente 7 o menos imágenes madSTORM, utilice los canales Color / merge en ImageJ para crear una imagen compuesta pseudo-coloreada. Para 8 o más imágenes, es aconsejable catagorizar las imágenes madSTORM en diferentes grupos, combinar cada grupo en una imagen compuesta y aplicar un solo color LUT a cada imagen compuesta.
10 . Por último, en el caso de NV - vacancy FNDs, la intensidad de emisión puede disminuirse hasta un 50% in situ mediante la aplicación de un campo magnético estático 23 . La disminución de la intensidad es aproximadamente lineal hasta ~ 500 Gauss en cuyo punto el efectoT satura. En la práctica, la intensidad de los diamantes en el campo de visión se puede disminuir al grado deseado acercando un imán permanente al portaobjetos del microscopio desde la parte superior.
Por último, optimizamos el tampón de elución para la eliminación de anticuerpos dirigidos a los componentes moleculares del microcluster de células T. MadSTORM no se limita a microgrupos de TCR, sin embargo, como microtúbulos, mitocondrias, F-actina, Vimentina y otras estructuras moleculares han sido imágenes utilizando esta técnica [ 10] . Para anticuerpos dirigidos a otros compartimentos celulares, pueden requerirse etapas adicionales para interrumpir la unión a epítopos tales como temperatura más alta, pH más bajo e incubación más prolongada del tampón de elución. Por el contrario, el tampón de elución se puede usar sin Tween-20 para dirigirse a estructuras de membrana sensibles, evitando la interrupción de las interacciones no iónicas. Prevemos en futuros experimentos que la composición de tampón de elución se adaptará para anticuerpos individuales tO optimizar la eficacia de la elución y preservar la muestra. Además, más allá de la aplicación en células T activadas, madSTORM puede ser factible con otros sistemas, incluyendo complejos moleculares in vitro , diferentes tipos de células y secciones de tejido. Varios parámetros del protocolo madSTORM, tales como fijación, permeabilización, tinción de anticuerpos y composición de tampón de elución, deberán ajustarse para cada sistema diana.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Xufeng Wu por el acceso al microscopio STORM. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) Centro de Investigación del Cáncer y el Instituto Nacional de Pulmón del Corazón y la Sangre (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
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