Summary
Floro etiketli antikorların ardışık bağlanması ve elüsyonunu kullanarak heterojen nano yapılardaki çoklu molekülleri tek molekül doğruluğu ile görüntüleme yöntemi gösteriyoruz.
Abstract
Tek molekül lokalizasyonu mikroskopisini kullanarak heterojen hücresel yapıların görüntülenmesi yetersiz lokalizasyon hassasiyeti ve çoklama yeteneği tarafından engellenmiştir. Flüoresan nano elmas referans işaretleyiciler kullanarak, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobunda yüksek hassasiyet elde etmek için gereken sürüklenme düzeltme ve hizalama prosedürlerini açıkladık. Ayrıca, floresan antikorlarının ardışık bağlanması ve elüsyonu kullanılarak aynı hücrede birden fazla molekülün hedeflendiği yeni bir çoklama stratejisi madSTORM açıklanmaktadır. MadSTORM, T hücresi reseptör mikroklusteru adı verilen, membrana bağlı, çoklu proteinli yapıdaki farklı bileşenlerin yerlerini görselleştirmek için aktive edilmiş bir T hücresi üzerinde gösterilmiştir. Buna ek olarak, çoklu protein yapılarının görselleştirilmesi için genel bir araç olarak madSTORM'un uygulanması tartışılacaktır.
Introduction
Işık mikroskopisinin (~ 200 nm) kırınım sınırını aşmak için çeşitli süper-çözünürlüklü mikroskopi teknikleri geliştirilmiştir. Bunların arasında, foto-aktivasyon lokalizasyonu mikroskopisi (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) içeren tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) adı verilen bir teknik kategorisi bulunmaktadır. SMLM teknikleri, (floresan) ve kapalı (karanlık / foto-anahtarlamalı) durumlar arasında değiştirilebilen, floresanın tekli moleküller 1 , 2 , 3'den sıralı lokalizasyona olanak tanıyan flüorofor kullanımını paylaşır.
Ticari olarak mevcut boyalar ve mikroskoplar ile uyumluluğu nedeniyle doğrudan STORM (dSTORM) yaygın bir şekilde benimsenen SMLM tekniği haline gelmiştir. DSTORM, bir kırınım merkezinin hesaplanmasında belirsizlik olarak tanımlanan ~ 10 nm lokalizasyon hassasiyetini rutin olarak gerçekleştirebilirIyon sınırlı nokta yayılım fonksiyonu (PSF). Bununla birlikte, lokalizasyon algoritmaları 5 , 6 , 7 kullanılarak yüksek hassasiyet tahmini yapılmasına rağmen, tek moleküllerin gerçek konumunun doğru olarak belirlenmesi bir takım hususlarla engellenmiştir. Birincisi, görüntü yakalama işlemi sırasında mikroskop kademesinin mekanik hareketi, lokalizasyon hassasiyetinde belirgin belirsizlik katmaktadır. SMLM görüntüleri binlerce zaman aşımı karesinden elde edildiğinde, mikroskop kademesinin nano ölçekli hareketi, son süper-çözünürlüklü görüntünün 8 hassasiyetini önemli ölçüde tehlikeye atabilir. Görüntü yakalama işlemi sırasında sahne hareketini telafi etmek için sahne kayması yaygın olarak, kendiliğinden yerleşimlerin resmin kendisinden regresyon temelli uydurulması (çapraz korelasyon) veya referans işaretlerinden sıralı lokalizasyonlar (referans düzeltme 1 , 9 ) ile tahmin edilir. ancak buradanBu yöntemler, her görüntü yığıtı için birden fazla parametrenin optimizasyonunu gerektirir ve mekanik titreşim gibi kısa zaman ölçeklerinde sahne hareketlerini hesaba katamaz. SMLM'de, altın nano parçacıkları ve çok renkli flüoresan boncuklar referans işaretleyiciler olarak kullanılıyor ancak foto-kararlı değiller ve sürüklenme düzeltildikten sonra kullanılan azot boşluğu-merkez flüoresan nano-elmas (FND) değerlerinden çok daha düşük hassasiyetle sonuçlanıyorlar MadSTORM 10'da .
Kırılma sınırına ek olarak, ışık mikroskopisi spektral sınırlarla daha da sınırlandırılmıştır. Birden fazla hedefin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi, örtüşmeyen spektral profilleri olan flüoresan sondaları gerektirir ve genellikle 6 renk ve SMLM'den flüoresan esaslı ışık mikroskopisi 4 , 11 , 12'ye kısıtlanır. Ayrıca, lineer olmayan renk sapmaları, çok renkli görüntülerin hizalamasına neden olur, wÇok renkli referans işaretleri 8 , 13 kullanarak geniş hizalama prosedürleri gerektirir. Bu sınırların üstesinden gelmek için, daha önceki çalışmalar, ardışık olarak bağlı fluoroforların 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19'un tekrarlayan fotoblokajı veya kimyasal söndürme kullanılarak çoklu hedefleri görüntülemiştir. Bu yöntemler mikroskopik spektrum sınırlarını aşabilmesine karşın floresans ağartma işlemi toksik bir süreçtir20 ve uzun süren ağartma veya söndürme, çapraz bağ kaybı gibi istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Ayrıca, flüoresan probların birikimi, numunedeki bağlanma alanlarının sterik olarak bloke edilmesine ve epitopların geniş çaplı çoğullama ve sağlam hedeflemesine engel olabilir. Bu tür sterik parazitlerden kaçınmak için, son zamanlardaTitizlikle serbestçe yayılmakta olan protein parçalarının stokastik değişimi kullanılarak çoğullama elde edilmiştir 21 . Bu yöntem, hücresel yapıların yoğun şekilde etiketlenmesine izin verirken, peptid parçalarını izole etmek için kapsamlı biyokimyasal hazırlık gerektirir, tek molekül konumlarını bulamaz ve piyasada bulunan problar kullanılarak büyük ölçekli çoğullamayı kolayca kolaylaştırmaz. Çoğaltılmış, antikor boyutuna sınırlı dSTORM (madSTORM) görüntüleme için floresan antikorların sıralı bağlanmasını ve elüsyonunu anlatan ayrıntılı bir video protokolünü sunmak ve hassas sürüklenme düzeltmesi ve hizalama yapmak için flüoresan nano-elmas kullanımı kullanmaktayız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dikkat: Kullanmadan önce lütfen ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Bu protokolde kullanılan kimyasallardan birçoğu zehirli ve kanserojen. Mühendislik kontrollerinin (davlumbaz, torpido gözlüğü) ve kişisel koruyucu ekipmanların (koruyucu gözlükler, eldivenler, laboratuar önlükleri, tam pantolonlar, kapalı ayakkabı) kullanılmasını içeren protokolü uygularken lütfen tüm uygun güvenlik kurallarını kullanın.
1. Aktive T Hücrelerinin Çoklu Görüntüleme
- Alexa 647 antikor etiketleme kiti kullanılarak antikorları doğrudan Alexa-647 (A647) boya ile konjuge edin. Üretici tarafından verilen etiketleme protokolünü izleyin.
NOT: Antikor etiketleme verimliliğini artırmak için bu aşamadan önce 1x PBS'de antikor çözeltisinin diyalizi yapılması önerilir. - Etiketli antikorları 20.800 rcf'de 5 dakika spinleyin ve toplanmış antikorları uzaklaştırmak için süpernatant toplayın.
- Floresan nano-elmas kaplamalı lamelleri hazırlama
- 1x PBS'de 100 nm FND'lik bir seyreltme hazırlayın. Adım 1.2.7'deki her görüş alanında yeterli FND'lerin görünmesini sağlamak için çeşitli seyreltileri test edin (üretici tarafından sağlanan FND'lerin 1: 200 oranında seyreltilmesini kullanıyoruz).
- Seyreltilmiş FND'leri 1 dakika boyunca vorteksleyin.
- Yüksek güçlü bir ortamda 30 saniyeliğine FND süpernatantını sonik hale getirin.
- Sonike edilmiş FND üst fazını bir PLL kaplı 8 kuyulu lamel hücresinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- 1x PBS ile 5x yıkayın ve TDAF mikroskopta 647 nm lazer uyarımı kullanarak FND kaplı oda görselleştirmek. İdeal olarak, adım 1.2.2'de uygun FND seyreltmesi göz önüne alındığında, 4-10 bireysel FND'ler bir görüş alanında görülebilir olmalıdır (256 x 256 kamera piksel ayarı ile 100X objektif kullanarak 61 x 61 μm görüntü alanı elde ediyoruz) At ileGörüntüleme alanının her kadranında en az bir FND mevcut. FND'ler kümelenmiş görünüyorsa ( örn. Çevreleyen FND'lerden önemli ölçüde daha yüksek sinyal ile FND'ler ve 200 nm'den büyük bir nokta yayılım fonksiyonu) 1 dakika boyunca FND'leri 6,800 rcf'de santrifüjleyin ve FND üst fazını kullanarak kaplama prosedürünü tekrarlayın.
- Her oyuğa 250 ul anti-CD3 antikoru (10 ug / mL) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Çözümü çıkarın ve 30 saniye boyunca 1x PBS ekleyin. Bu yıkama adımını 5 kez tekrarlayın (5x yıkayın).
- 1 ml Jurkat T hücresini 6 dakika boyunca 800 rcf'de döndürün ve 300 μl 1x HBS solüsyonunda tekrar süspansiyon haline getirin. Jurkat T hücreleri, eğrilmeden önce ideal olarak 0.5-1.0 x 106 hücre / ml konsantrasyonda olmalıdır. 1x HBS çözeltisi, daha önce tarif edildiği gibi% 1 sığır serum albümini içeren HEPES tampon salininden oluşur 22 .
- 150 uL ekleHer kuyuda 1x HBS solüsyonu ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- Her bir göze 50 μL yeniden süspansiyon haline getirilmiş Jurkat T hücresi ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
- Her göze 300 μL% 4 Paraformaldehit ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika 250 μL% 0.1 Triton-X çözeltisi ilave ederek hücreleri geçirir hale getirin.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her oyuğa 1x PBS içerisinde 250 μL% 1 balık jelatin solüsyonu ekleyin.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca sabit hücrelere 0.1-0.5 μg / mL'de etiketli antikor 200 mcL ekleyin.
- 1x PBS ile 5x yıkayın.
- 1 ml STORM tamponu ekleyin ve hava ile temasını sınırlamak için cam bir lamelle bölmeyi kapatın. STORM tamponu daha önce açıklanmıştır 10 . Ma tavsiye ediyoruzHer raund görüntüsü için yeni STORM tamponunu ve çökeltileri çıkarmak için STORM tamponunu 20.800 rcf'de 2 dakika döndürün.
- TIRF modunda düşük 647 nm lazer gücü kullanarak, görüş alanında en az 3 FND olan lekeli bir hücreyi bulun. FND'lerin konumlandırılmasına yardımcı olmak için, 568 nm lazerle eşzamanlı uyarılma, FND sinyalinin parlaklığını arttırmak için kullanılabilir.
NOT: Bölüm 2.1'de anlatılan ortalama düzeltme düzeltmesinin performansı, daha fazla FND içermesi ile gelişir. - 647 nm lazer gücünü artırın ve görüntü elde edin. Genellikle 200 ms pozlama, 125 mW 647 nm lazer, 100X TIRF objektif lens (1.49 NA), 100X EM kazanımı (16 bitte 5 MHz, dönüşüm kazancı 1) ile 10,000 çerçeve elde ediyoruz. Görüntüleme kurulumumuzun ayrıntıları daha önce açıklanmıştır 10 .
- 1x TBS ile 5 kez yıkayın.
- 1 ml oElüsyon tamponu (3.5 M MgCI2, 20 mM BORULAR,% 0.1 Tween-20, pH 6.5) ile yıkanır ve oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edilir.
- Elüsyonu 3 kez tekrarlayın. (Kesin elüsyon koşulları ve sinyal kaldırmak için gereken yıkama durulama sayısı kullanılan her bir antikor için kontrol edilmelidir).
- 1x TBS ile 3 kez yıkayın ve 1 ml 1x PBS ekleyin.
- Fotobirik, karanlık durumda A647 boyalarını foto-aktive etmek için 2-5 mW'da 405 nm lazerle yüksek güçte (125 mW) 647 nm lazer kullanıyor. Seyreltilmemiş antikorun kalan tüm sinyalleri photobleached edilinceye kadar bekleyin. Tipik olarak bu, 2-5 sn'lik bir lazer maruziyeti gerektirir. Elution ve fotokopi sonrası sinyallerin kaldırılmasını onaylamak için 1.3.5'deki STORM ayarlarını kullanarak örnek resimler (~ 100 çerçeve) edinilmesi önerilir.
Bu yöntemi kullanarak sinyalin% 99.8'ini ortadan kaldırırız. Daha önce gösterildiği gibi madSTORM'da kullanılmadan önce her antikorun elüsyon verimliliğini test etmenizi öneririz 10 . - 15 dakika boyunca 250 μL% 4 paraformaldehid ekleyin. Bu prOlaylar hücredeki sabit moleküllerin çapraz bağlanmasını tersine çevirir.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Birden fazla hedefin sıralı etiketlenmesi için adım 1.3.1-1.3.12'yi tekrarlayın. Şekil 1 , madSTORM kullanılarak elde edilen aktive edilmiş Jurkat T hücresindeki çoklu moleküllerin birleşik bir görüntüsünü göstermektedir.
2. Çoğaltılmış Görüntü Yığınlarının Drift Düzeltmesi ve Hizalanması
- MadSTORM görüntü yığınlarının sürüklenme düzeltmesi
- ImageJ kullanarak resimleri aç. ImageJay'ı açmadan önce görüntü dosyalarını bir TIFF formatına dönüştürmenizi öneririz. Tek bir FND seçmek için dikdörtgen ROI kullanın. FND'nin görüntü yığınının her karesinde görünür olmasını sağlamak için zaman aşımını oynatın. FND'yi yerelleştirmek için ThunderSTORM eklentisindeki Çalıştırma Analizi'yi kullanın. 2.1.5'te açıklanan ortalama düzeltme yöntemi için, tek bir FND'nin her görüntü çerçevesinde lokalize olması önemlidir ( örn . Belirlenen tepe sayıları e olmalıdırQual sayısına göre).
- FND her çerçevede tanımlanmazsa, başka bir FND seçin. Birden fazla zirve tek bir karede bulunuyorsa, en yüksek zirvelerden sapan zirveyi çıkarın.
- Görüntü yığındaki her FND için 2.1.2'yi tekrarlayın. Bazı FND'lerin sürüklenme düzeltme sürecine dahil edilmemesi gerektiğini unutmayın; bu nedenle, adım 2.1.7'de anlatıldığı gibi sürüklenme düzeltme hassasiyeti için bağımsız bir gösterge görevi görebilirler.
- Hızlı, daha az hassas sürüklenme düzeltmesi için, FND görüntülerini düzeltmek için ThunderSTORM'da bulunan çapraz korelasyon veya düzeltme algoritmalarını kullanın. Tipik olarak, çapraz korelasyon ve 10 maksimum mesafe, 0.1 dakika işaretleyici görünürlük oranı ve 100 düzeltme düzeltmesi için 0.01 yörünge düzeltme faktörü için 100 kutu, 5 büyütme ve 0.1 yörünge yumuşatma faktörü kullanıyoruz. Çapraz korelasyon ve standart düzeltme, sürüklenme düzeltme hassaslığını test etmek için diğer FND'lere uygulanabilecek bir düzeltme dosyası üretecektir.
- Daha katı, daha hassas sürüklenme düzeltmesi için, daha önce tarif edildiği gibi ortalama referans düzeltme (AFC) algoritmasını kullanın 10 . Bu işlem, parametrelerin optimizasyonunu gerektirmez ve SMLM yerelleştirme algoritmaları tarafından öngörülenden daha yüksek yerelleştirme hassaslığı sağlar. Bununla birlikte, ortalama sürüklenme düzeltmesi en az 4 FND gerektirir ve FND'lerin görüntü yığınının her karesinde lokalize edilmesi gerekir. AFC sürüklenme düzeltmesi, daha fazla FND'yi dahil ederek daha iyi performans gösterir çünkü çok sayıda yerel FND belirli bir çerçevedeki aşırı olmayan bir tepenin bozucu etkisini azaltacaktır.
- ThunderSTORM'u daha önce açıklandığı gibi kullanarak görüntü yığını içindeki tüm nokta yayılım fonksiyonlarını lokalize edin 10 . Genelde 100 nm piksel boyutu, 4.28 A / D sayısı başına fotoelektronlar, 100 taban seviye A / D sayısı, 100 EM kazancı, PSF: Entegre Gauss lokalizasyonu, 5 piksel uyum yarıçapı, maksimum olasılık uydurma yöntemi ve 1.3 Piksel başlangıç sigma.
- FND'lerden elde edilen sürüklenme düzeltme faktörünü tüm görüntü yığından yerelleştirmelere uygulayın. Uygun sürüklenme düzeltmesini sağlamak için nihai görüntüyü görsel olarak inceleyin ( Şekil 2 ). Oluşan sürüklenme düzeltme faktörü, sürüklenme düzeltme hassasiyet seviyesini ölçmek için AFC prosedürüne dahil edilmeyen FND'lerde bağımsız olarak test edilmelidir. Sürüklenerek düzeltilmiş bağımsız FND'lerin hassasiyeti, adım 2.1.6'da kullanılan lokalizasyon algoritmasından hesaplanan ortalama hassasiyet / belirsizlik değerine yakın olmalıdır.
- Kademeli etiketli antikorların madSTORM görüntü yığınları için 2.1.1-2.1.7 adımlarını tekrarlayın. Her madSTORM görüntü yığında aynı FND setini yerelleştirmenin aşağıdaki hizalama prosedürü için kritik olduğunu unutmayın.
- MadSTORM resimlerinin hizalanması
- Her bir madSTORM görüntüsünde sapma düzeltilmiş FND'lerin merkez konumunu hesaplayın. Bunu yapmak için, ortalama x ve y ekseni poHer yerelleştirilmiş FND için alanlar ve her madSTORM görüntüsündeki tüm FND'lerin ortalama x ve y konumlarını ortalamaktadır. Bu adım için ayrıntılı algoritma daha önce açıklanmıştır 10 . FND referans işaretlerinin ağırlık merkez noktalarını kullanarak ardışık madSTORM görüntülerini hizalayın. Hizalamayı gerçekleştirmek için, ilk maddenin ikinci madSTORM görüntüsündeki FND'lerin ağırlık merkezinden çıkararak iki lokalize madSTORM görüntüsü arasındaki farkı hesaplayın. Ardından, ikinci madSTORM resmindeki tüm lokalizasyondan ofset miktarını çıkarın.
- İlk madSTORM resmini referans görüntü olarak kullanmanızı ve birinci ve üçüncü, birinci ve dördüncü arasında bu hizalama adımını tekrar etmenizi öneririz. Hizalama işlemine dahil edilmeyen FND'ler arasındaki ofset ölçerek hizalama hassaslığını test edin. Büyük uzaklıklar ardışık madSTORM görüntülerinin ağırlık merkezlerini hesaplarken farklı FND setlerinin kullanıldığını gösterebilir.
- Eğer öyleyse adımlar 2.2.1-2.2.2 shouHizalama yapmak için aynı FND setini kullanarak tekrarlanmalıdır.
NOT: Hem AFC sürüklenme düzeltmesi hem de hizalama prosedürleri için özel kodlar sağlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sıralı elüsyon ve boyama yöntemi, aktive edilmiş bir Jurkat T hücresindeki mikro kümelerin ve diğer yapıların çoğaltılan madSTORM görüntüsünü üretmek için kullanılmıştır ( Şekil 1 , şekil hizalamalarını kontrol edin). Her sahte renkli görüntü, adım 1.1.1 ila 1.3.13'te elde edilen madSTORM görüntüsünün bir turunu temsil eder. Daha önce açıklandığı gibi 10 , çoklu hedefler arasındaki çapraz izi önlemek için, önceden yıkanmamış antikorun artık sinyali için izleme alanı izlenmelidir. Ayrıca, elüsyon verimi antikorlar arasında farklılık gösterebileceğinden, ardışık çoğullama sırası, epitopların sterik bloklamasını en aza indirgemek için en iyi elektronlardan en kötü elektrota kadar seçilebilir olmalıdır. Şekil 1'deki son madSTORM resmi, bölüm 2'de açıklandığı gibi AFC ve FND referans işaretlerini kullanarak sürüklenme ve hizalama için düzeltilmiştir.
Şekil 2A , 2B ) ve harekete geçirilmiş bir Jurkat T hücresi ( Şekil 2C , 2D ) ile lokalizasyonlar üzerine AFC gerçekleştirmek için kullanıldı. AFC sürüklenme düzeltmesi, verilen algoritmalar kullanılarak 2.1.1-2.1.8. Adımlarda açıklandığı şekilde gerçekleştirildi. İlk önce, sürüklenme düzeltme algoritmasının doğru bir şekilde uygulanmasını sağlamak için, sürüklenme düzeltmesinden ( Şekil 2C ) görselin görsel denetimi önerilir. İkinci olarak, X ve Y eksenlerindeki lokalizasyonların standart sapmasını ölçmek, AFC tarafından elde edilen hassasiyetin onaylanması için önerilir. Daha önce bildirildiği gibi AFC genellikle çeşitli lokalizasyon algoritmaları tarafından beklenenden daha iyi bir hassaslık üretir.
Şekil 1: ( A B ) Kutulu bölgenin A'daki genişlemiş görüntüsü Ölçek çubuğu = 500 nm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: 30.000 görüntü karesinde ( A ) lokalize tek bir FND'nin SMLM görüntüsü ve ( B ) ortalama düzeltme düzeltmesiyle sürüklenme düzeltmesinden sonra. Ölçek çubukları = 20 nm (A ve B). Aktifleştirilmiş bir Jurkat T hücresinin SMLM görüntüsü lekelenmiş haldedir(F12) anti-fosforile SLP76 (Y128) antikoru ve FND referans işaretleyicileri ( C ) ve ( D ) ortalama düzeltme düzeltmesi ile sürüklenme düzeltmesinden sonra. Ölçek çubuğu = 2 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MadSTORM'daki sıralı çoğullama, sürüklenme düzeltme ve hizalama prosedürleri, hücrelerdeki heterojen yapıların hassas, çok yönlü görselleştirilmesini sağlar. 10 Buna ek olarak, madSTORM, çok uzak olmayan kırmızı renklerin 9 , 12 renk sapması ve alt optimal fotoğraflar / ışık emisyon özellikleri gibi çok renkli STORM'un sınırlamalarını önler. Seyreltme adımı, ardışık olarak bağlanan antikorlardan gelen sterik enterferansı önemli ölçüde azalttığından, madSTORM, önceki teknikler 9 , 15 , 21 ile elde edilen 6-10 turlu multiplekslemiş görüntülemenin ötesinde hücre numunelerinin tekrarlanan görüntülemesinin gerçekleştirilmesi için kullanılabilir. Dahası, ardışık elüsyon ve boyama adımları SMLM ile sınırlı değildir ve konfokal mikroskopi, SIM ve iki fotonlu mikroskopi gibi diğer görüntüleme teknikleri için kullanılabilir. Ancak, madS göz önüne alındığındaTORM sıralı bir immün boyama tekniğidir, bu teknik her hedeflenen molekül için antikorların bulunması ile sınırlıdır. Her bir antikor, özgüllüğü, etiketleme verimliliğini ve elüsyon yeteneğini sağlamak için dikkatli bir şekilde test edilmelidir.
MadSTORM'un satın alma ayarları, bireysel photoswitching olaylarının algılanmasını maksimize etmek için seçildi ve böylece ortalama 2.5 nm ortalama lokalizasyon hassaslığı elde edildi. Bununla birlikte, yüksek hassasiyet, zaman kaybı ile gelir; daha önce de belirtildiği gibi, madSTORM görüntülemenin her turu için ~ 3 saat gerektirir. Daha düşük lokalizasyon hassasiyetinde (5-10 nm) daha hızlı görüntü elde etmek için kısa maruz kalma süresi ve daha yüksek EM kazancı önerilir ( ör. 20 ms maruz kalma, 300X EM kazancı, 16 MHz'de 17 MHz, dönüşüm kazancı 3). Ayrıca, çoklu görüntüleme ( örneğin, Atto-488, Alexa-568 ve Alexa-647 nm), madSTORM görüntülemenin her turu için çoklayıcı ölçeğini artırmak için gerçekleştirilebilirRenk sapması nedeniyle hizalama hassasiyetinde bir azalma.
Bu protokolü kullanarak, 25 turlu madSTORM görüntüleme başarıyla gerçekleştirdik. Tüm işlem lamel hücresi mikroskop sahnesine monte edilmiş olarak gerçekleştirildiğinden, lamel hücresini aynı konumda sabitlemek önemlidir. Bunu yapmak için otomatik odaklama modundan yararlanın ve oda metal kelepçeler kullanarak mikroskop sahnesine monte edin. Önemli bir aşama kayması meydana gelmişse, hücre örneğini yeniden merkezlemek için bilinen FND referans işaretleri konumlarını kullanın.
Hizalanmış madSTORM görüntülerinin aynı anda görselleştirilmesi zor olabilir. Aynı anda 7 veya daha az madSTORM görüntüsü görüntülemek için ImageJ'de Renkli / birleştirme kanallarını kullanarak sahte renkli bir bileşik görüntü oluşturun. 8 veya daha fazla görüntü için, madSTORM görüntülerini farklı gruplara katmanlaştırmanız, her grubu birleşik bir resim haline getirmeniz ve her bir bileşik görüntüye tek bir LUT rengi uygulamanız önerilir.
10 . Son olarak, NV boşluklu FND'ler için emisyon yoğunluğu, statik bir manyetik alan 23'in uygulanmasıyla yerinde% 50'ye kadar azaltılabilir. Yoğunluğun azalması kabaca ~ 500 Gauss'a kadar doğrusaldır ki bu noktada etkinlikT doyurur. Uygulamada, görünüş alanındaki elmas yoğunluğu, üstten mikroskop slaydına daha yakın bir kalıcı mıknatıs getirerek istenilen dereceye düşürülebilir.
Son olarak, T hücresi mikroklusterunun moleküler bileşenlerini hedefleyen antikorların çıkarılması için elüsyon tamponunu optimize ettik. MadSTORM, TCR mikro kümeleri ile sınırlı değildir, bununla birlikte mikrotubüller, mitokondri, F-aktin, Vimentin ve diğer moleküler yapılar bu tekniği kullanarak görüntülendi 10 . Diğer hücresel bölmeleri hedef alan antikorlar için, yüksek sıcaklık, daha düşük pH ve elüsyon tamponunun daha uzun kuluçka süresi gibi epitop bağlanmasını bozmak için ilave adımlar gerekebilir. Tersine, elüsyon tamponu, iyonik olmayan etkileşimlerin bozulmasını önleyen hassas membran yapılarını hedeflemek için Tween-20 olmadan kullanılabilir. Gelecekteki deneylerde, elüsyon tamponu bileşiminin, münferit antikorlar için terzi edileceğini öngörüyoruz.O elüsyon verimliliğini ve numunenin korunmasını optimize edin. Ayrıca aktive edilmiş T hücrelerindeki uygulamaların ötesinde madSTORM, in vitro moleküler kompleksler, farklı hücre tipleri ve doku kesitleri dahil olmak üzere diğer sistemlerle uygulanabilir olabilir. MadSTORM protokolünün fiksasyon, permeabilizasyon, antikor boyama ve elüsyon tamponu kompozisyonu gibi çeşitli parametreleri hedeflenen her sistem için ayarlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak bir şeyimiz yok.
Acknowledgments
STORM mikroskopuna erişim için Xufeng Wu'ya teşekkür ediyoruz. Bu araştırma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Kanser Araştırmaları Merkezi ve Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI )'nin İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
