Summary
Vi demonstrerer en metode for å vise flere molekyler innenfor heterogene nanostrukturer ved nøyaktighet av enkeltmolekyler ved bruk av sekvensiell binding og eluering av fluorescensmerkede antistoffer.
Abstract
Imaging heterogene cellulære strukturer ved bruk av enkeltmolekyl lokaliseringsmikroskopi er blitt hindret av utilstrekkelig lokalisering presisjon og multiplexing evne. Ved hjelp av fluorescerende nano-diamant fiducial markører, beskriver vi driftskorrigerings- og justeringsprosedyrene som kreves for å oppnå høy presisjon i enkeltmolekyler lokaliseringsmikroskopi. I tillegg er en ny multiplekseringsstrategi, madSTORM, beskrevet hvor flere molekyler er målrettet i samme celle ved bruk av sekvensiell binding og eluering av fluorescerende antistoffer. MadSTORM er demonstrert på en aktivert T-celle for å visualisere plasseringen av forskjellige komponenter i en membranbundet, multi-proteinstruktur kalt T-celle-reseptor-mikroklassen. I tillegg diskuteres anvendelse av madSTORM som et generelt verktøy for visualisering av multi-protein strukturer.
Introduction
En rekke superoppløsningsmikroskopiteknikker har blitt utviklet for å overvinne diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi (~ 200 nm). Blant disse er en kategori teknikker kalt single molecule localization microscopy (SMLM) som inkluderer fotoaktivering lokaliseringsmikroskopi (PALM) og stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM). SMLM teknikker deler i bruk av fluoroforer som kan byttes mellom på (fluorescerende) og av (mørke / fotobrytede) tilstander, slik at sekvensiell lokalisering av fluorescens fra enkeltmolekyler 1 , 2 , 3 .
På grunn av kompatibiliteten med kommersielt tilgjengelige farger og mikroskoper, har direkte STORM (dSTORM) blitt en allment vedtatt SMLM-teknikk 4 . DSTORM kan rutinemessig oppnå ~ 10 nm lokaliseringspresisjon, definert som usikkerheten ved beregning av sentrum for en diffraksjonIon-begrenset punkt spredning funksjon (PSF). Til tross for den høye presisjonen som ble estimert ved hjelp av lokaliseringsalgoritmer 5 , 6 , 7 , har nøyaktig bestemmelse av den faktiske plasseringen av enkeltmolekyler blitt hindret av en rekke problemer. For det første legger mekanisk bevegelse av mikroskopstadiet under bildeoppkjøpet betydelig usikkerhet til lokaliseringspresisjon. Som SMLM-bilder er oppnådd over tusenvis av tidsrammer, kan nanoskala bevegelser av mikroskopetrinnet betydelige kompromisser med presisjonen til det endelige superoppløsningsbildet 8 . For å kompensere for scenebevakning under bildeoppkjøpet, estimeres trinndrift vanligvis fra regresjonsbasert montering av inndata lokaliseringer fra selve bildet (krysskorrelasjon) eller sekvensielle lokaliseringer fra fiducial-markører (fiducial-korreksjon) 1 , 9 . HowevEr, disse metodene krever optimalisering av flere parametere for hver bildebunke, og kan ikke regne for scenebevegelser på kort tidskalaer som mekanisk vibrasjon. Gullnano-partikler og flerfargede fluorescerende perler har blitt brukt som fiducial markører i SMLM, men de er ikke fotostabile, og resulterer i betydelig lavere presisjon etter driftskorreksjon enn nitrogen-fluorescerende nanodiamanter (FNDs) I madSTORM 10 .
I tillegg til diffraksjonsgrensen blir lysmikroskopi ytterligere begrenset av spektrale grenser. Samtidig visualisering av flere mål krever fluorescerende sonder med ikke-overlappende spektrale profiler, generelt begrenser fluorescensbasert lysmikroskopi til 6 farger og SMLM til 2-3 farger 4 , 11 , 12 . Videre forårsaker ikke-lineær kromatisk avvikelse feiljustering av flerfargete bilder, wSom krever omfattende justeringsprosedyrer ved bruk av flerfarget fiducial markører 8 , 13 . For å overvinne disse grensene har tidligere studier avbildet flere mål ved bruk av repeterende fotoblekking eller kjemisk slukning av sekvensielt bundet fluoroforer 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Selv om disse metodene kan overvinne spektralgrensene for mikroskopi, er fluorescensbleking kjent for å være en toksisk prosess 20 , og langvarig bleking eller quenching kan forårsake uønskede bivirkninger som tverrbinding. Videre kan akkumuleringen av fluorescerende prober føre til sterisk blokkering av bindingssteder i prøven, for å hindre storskala multipleksering og robust målretting av epitoper. For å unngå slike steriske forstyrrelser, en siste sTudy oppnådd multipleksering ved bruk av stokastisk utveksling av fritt diffuserende proteinfragmenter 21 . Mens denne metoden tillater tett merking av cellulære strukturer, krever det omfattende biokjemisk preparat for å isolere peptidfragmenter, kan ikke lokalisere enkeltmolekylposisjoner og letter ikke lettere storskala-multipleksering ved bruk av kommersielt tilgjengelige prober. Vi presenterer en detaljert videoprotokoll som beskriver sekvensiell binding og eluering av fluorescensantistoffer for multiplexert, antistoffstørrelsesbegrenset dSTORM (madSTORM) avbildning, og bruk av fluorescerende nanodiamanter for å oppnå nøyaktig driftskorrigering og justering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsiktig: Vennligst se alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Flere av kjemikaliene som brukes i denne protokollen er giftige og kreftfremkallende. Vennligst bruk all hensiktsmessig sikkerhetspraksis når du utfører protokollen, herunder bruk av tekniske kontroller (avtrekksvifte, hanskekasse) og personlig verneutstyr (sikkerhetsbriller, hansker, laboratoriejakke, bukser i full lengde, lukkede sko).
1. Multipleksert bildebehandling av aktiverte T-celler
- Direkte konjugerte antistoffer med Alexa-647 (A647) fargestoff ved hjelp av Alexa 647 antistoff merking kit. Følg merkingsprotokollen levert av produsenten.
MERK: Dialyse av antistoffoppløsning i 1x PBS anbefales før dette trinnet for å øke effektiviteten av antistoffmerking. - Spin-merkede antistoffer i 5 minutter ved 20 800 rcf og samle supernatant for å fjerne aggregerte antistoffer.
- Fremstilling av fluorescerende nano-diamantbelagte dekklister
- Forbered en fortynning av 100 nm FNDer i 1x PBS. Test forskjellige fortynninger for å sikre at nok FNDer er synlige hvert synsfelt i trinn 1.2.7 (vi bruker en 1: 200 fortynning av FND som leveres av produsenten).
- Vortex de fortynnede FNDene i 1 min.
- Sonikér FND-supernatanten i 30 s ved høy effekt.
- Inkubér den sonikerte FND-supernatanten i et PLL-belagt 8-brønn dekselkammer i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask 5x med 1x PBS og visualiser det FND-belagte kammeret ved hjelp av 647 nm laser excitering på TIRF-mikroskopet. Ideelt sett bør 4-10 individuelle FND'er være synlige i synsfeltet gitt den riktige fortynningen av FNDer i trinn 1.2.2 (vi bruker et 100X objektiv med 256 x 256 kamera pixel innstilling for å gi 61 x 61 μm synsfelt) Med påMinst én FND tilstede i hver kvadrant av bildefeltet. Hvis FNDene ser ut til å være gruppert ( dvs. FND med signifikant høyere signal enn omgivende FNDs og en punktspredningsfunksjon som er større enn 200 nm), sentrifuger FNDs ved 6 800 rcf i 1 min, og gjenta belegningsprosedyren ved hjelp av FND-supernatanten.
- Tilsett 250 μl anti-CD3-antistoff (10 μg / ml) i hver brønn og inkuber i 1 time ved 37 ° C eller over natten ved 4 ° C.
- Fjern løsningen og tilsett 1x PBS i 30 sekunder. Gjenta dette vaske trinnet 5 ganger (vask 5x).
- Spinn 1 ml Jurkat T-celler ved 800 rcf i 6 min og resuspender i 300 μl 1 x HBS-oppløsning. Jurkat T-celler bør ideelt sett ligge i en konsentrasjon på 0,5-1,0 x 10 6 celler / ml før spinning. 1x HBS-oppløsning består av HEPES-buffertsalt med 1% bovint serumalbumin som beskrevet tidligere 22 .
- Tilsett 150 μLAv 1 x HBS-oppløsning i hver brønn og inkuber ved 37 ° C i 15 minutter.
- Tilsett 50 μL resuspendert Jurkat T-celler til hver brønn og inkuber i 3 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 300 μl 4% paraformaldehyd til hver brønn og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Vask 3x med 1x PBS.
- Permeabiliser celler ved å tilsette 250 μl 0,1% Triton-X løsning i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vask 3x med 1x PBS.
- Tilsett 250 μL 1% fiskelatinoppløsning i 1x PBS til hver brønn i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask 3x med 1x PBS.
- Tilsett 200 μl merket antistoff ved 0,1-0,5 μg / mL til faste celler i 1 time ved romtemperatur.
- Vask 5x med 1x PBS.
- Tilsett 1 ml STORM buffer og dekk kammeret med et glassdeksel for å begrense eksponeringen mot luft. STORM-bufferen er tidligere beskrevet 10 . Vi anbefaler maKonge, ny STORM-buffer for hver runde av avbildning og spinning av STORM-bufferen ved 20 800 rcf i 2 min for å fjerne utfelling.
- Ved å bruke lav 647 nm laserkraft i TIRF-modus, finn en farget celle med minst 3 FNDer i synsfeltet. For å hjelpe til med å lokalisere FNDs, kan samtidig spenning med 568 nm laser brukes til å øke lysstyrken på FND-signalet.
MERK: Resultatet av gjennomsnittlig fiducial korreksjon beskrevet i avsnitt 2.1 forbedrer med inkludering av flere FNDer. - Øk 647 nm laserkraft og kjøp bilder. Vi kjøper vanligvis 10.000 rammer ved 200 ms eksponering, 125 mW 647 nm laser, 100X TIRF objektivlins (1,49 NA), 100X EM gain (5 MHz ved 16 bit, konverteringsgevinst 1). Detaljer om vårt bildeoppsett er tidligere beskrevet 10 .
- Vask 5x med 1x TBS.
- Tilsett 1 ml oF-elueringsbuffer (3,5 M MgCl2, 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) og inkuber ved romtemperatur i 1 min.
- Gjenta eluering 3 ganger. (Nøyaktige elueringsbetingelser og antall elueringsspyler som trengs for å fjerne signalet må kontrolleres for hvert antistoff som brukes).
- Vask 3x med 1x TBS og tilsett 1 ml 1x PBS.
- Photobleach ved hjelp av 647 nm laser ved høy effekt (125 mW) med 405 nm laser ved 2-5 mW for å fotoaktivere A647 fargestoffer i mørk tilstand. Vent til alt gjenværende signal fra ikke-eluert antistoff er photobleached. Vanligvis tar det 2-5 s laser eksponering. Å oppnå prøvebilder (~ 100 bilder) ved hjelp av STORM-innstillingene i 1.3.5 etter eluering og fotoblekking anbefales for å bekrefte fjerning av signal.
Vi fjerner vanligvis 99,8% av signalet ved hjelp av denne metoden. Vi anbefaler å teste elueringseffektiviteten til hvert antistoff før bruk i madSTORM som vist tidligere 10 . - Tilsett 250 μl 4% paraformaldehyd i 15 min. Dette prHendelser omvendt tverrbinding av faste molekyler i cellen.
- Vask 3x med 1x PBS.
- Gjenta trinn 1.3.1-1.3.12 for sekvensiell merking av flere mål. Figur 1 viser et sammensatt bilde av flere molekyler i en aktivert Jurkat T-celle som er oppnådd ved bruk av madSTORM.
2. Driftskorreksjon og justering av multiplexerte bildestabler
- Driftskorreksjon av madSTORM bildestabler
- Åpne bilder ved hjelp av ImageJ. Vi anbefaler at du konverterer bildefiler til et TIFF-format før du åpner ImageJ. Bruk rektangulavkastning til å velge en enkelt FND. Spill tiden for å sikre at FND er synlig i hver ramme av bildestakken. Bruk Run Analysis i ThunderSTORM plugin for å lokalisere FND. For den gjennomsnittlige fiducial-korreksjonsmetoden som er beskrevet i 2.1.5, er det viktig at en enkelt FND er lokalisert i hver bilderamme ( dvs. antall identifiserte topper skal være eKvalifiserer til antall rammer).
- Hvis FND ikke er identifisert i hver ramme, velg en annen FND. Hvis flere topper er plassert i en enkelt ramme, fjern toppen som avviker mest fra tidligere topper.
- Gjenta 2.1.2 for hver FND i bildebunken. Husk at noen FND ikke skal inkluderes i driftskorreksjonsprosessen, slik at de kan fungere som en selvstendig måler for driftskorreksjonspresisjon som beskrevet i trinn 2.1.7.
- For raskere, mindre presis driftskorreksjon, bruk enten krysskorrelasjons- eller fiducial-korreksjonsalgoritmene som er inkludert i ThunderSTORM for å korrigere FND-bildene. Vanligvis bruker vi 100 bokser, 5 forstørrelser og 0,1 baneutjevningsfaktor for krysskorrelasjon og 10 maksimal avstand, 0,1 min markør synlighet og 0,01 baneutjevningsfaktor for fiducial korreksjon. Korskorrelasjon og fiducial korreksjon vil gi en korreksjonsfil som kan brukes til andre FNDs for å teste driftskorreksjonspresisjonen.
- For strengere, mer presis driftskorreksjon, bruk gjennomsnittlig fiducial korreksjon (AFC) algoritmen som beskrevet tidligere 10 . Denne prosessen krever ikke optimalisering av parametere og gir høyere lokaliseringspresisjon enn forutsatt av SMLM lokaliseringsalgoritmer. Imidlertid krever gjennomsnittlig driftskorrigering minst 4 FNDer og for FNDene skal lokaliseres i hver ramme av bildestakken. AFC-driftskorreksjon utfører bedre med inkludering av flere FNDer fordi et stort antall lokaliserte FNDer vil redusere den forvridende effekten av en utadrettende topp i en gitt ramme.
- Lokaliser alle punktspreadfunksjoner i bildebunken med ThunderSTORM som beskrevet tidligere. Vi bruker vanligvis pikselstørrelse på 100 nm, fotoelektroner pr. A / D-telle på 4,28, basisnivå A / D-telle på 100, EM-gevinst på 100, PSF: Integrert Gauss-lokalisering, 5 pikselmonteringsradius, maksimal sannsynlighetsmetode og 1,3 Pixel initial sigma.
- Bruk driftskorreksjonsfaktoren som er overført fra FND til lokaliseringer fra hele bildestakken. Visuelt inspiser det endelige bildet for å sikre riktig driftskorreksjon ( Figur 2 ). Den resulterende driftskorreksjonsfaktoren skal testes uavhengig av FND som ikke er inkludert i AFC-prosedyren for å måle nivået av driftskorreksjonspresisjon. Nøyaktigheten til driftkorrigerte, uavhengige FNDer bør være nær gjennomsnittlig presisjon / usikkerhetsverdi beregnet ut fra lokaliseringsalgoritmen benyttet i trinn 2.1.6.
- Gjenta trinn 2.1.1-2.1.7 for madSTORM-bildestablene av sekvensielt merkede antistoffer. Husk at lokalisering av det samme settet av FNDer i hver madSTORM-bildebrikke er kritisk for følgende justeringsprosedyre.
- Justering av madSTORM-bilder
- Beregn sentroidposisjonen til de driftskorrigerte FNDene i hvert madSTORM-bilde. For å gjøre dette, finn den gjennomsnittlige x- og y-aksen poSisjoner for hver lokalisert FND, og gjennomsnitt gjennomsnitt x og y posisjonene til alle FNDer i hvert madSTORM-bilde. Den detaljerte algoritmen for dette trinnet er tidligere beskrevet 10 . Juster sekvensielle madSTORM-bilder ved hjelp av de sentrale posisjonene til FND fiducial markører. For å utføre justeringen beregner du forskyvningen mellom to lokaliserte madSTORM-bilder ved å subtrahere sentrifugalposisjonen til FNDs i det andre madSTORM-bildet fra det første. Deretter trekker du avregningsbeløpet fra alle lokaliseringer i det andre madSTORM-bildet.
- Vi anbefaler at du bruker det første madSTORM-bildet som et referansebilde og gjentar dette tilpasningstrinnet mellom første og tredje, første og fjerde osv. Test justeringspresisjonen ved å måle forskyvningen mellom FND som ikke er inkludert i justeringsprosessen. Store offsets kan indikere at forskjellige sett med FNDs ble brukt ved beregning av sentroidposisjonene av sekventielle madSTORM-bilder.
- I så fall skal trinn 2.2.1-2.2.2 shouLd gjentas ved å bruke det samme settet av FNDer for å utføre justering.
MERK: Tilpassede koder for både AFC-driftskorrigering og justeringsprosedyrer er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den sekventielle eluerings- og fargemetode ble brukt til å produsere det multiplekserte madSTORM-bildet av mikroklustere og andre strukturer i en aktivert Jurkat T-celle ( figur 1 , kontrollfigurjusteringer). Hvert pseudo-farget bilde representerer en runde med madSTORM-bildebehandling som er oppnådd i trinn 1.1.1 til 1.3.13. Som beskrevet tidligere 10 , bør synspunktet overvåkes for residualt signal fra tidligere, ikke-eluert antistoff for å unngå krysstal mellom multiplexerte mål. Dessuten, da elueringseffektiviteten kan variere mellom antistoffer, bør rekkefølgen av sekvensiell multipleksering ordnes fra det beste til det verste eluerende antistoff for å minimere sterisk blokkering av epitoper. Det endelige madSTORM-bildet i figur 1 er korrigert for drift og justering ved hjelp av AFC og FND fiducial markører som beskrevet i avsnitt 2.
Figur 2A , 2B ) og en aktivert Jurkat T-celle ( Figur 2C , 2D ). AFC-driftskorreksjonen ble utført som beskrevet i trinnene 2.1.1-2.1.8 ved bruk av de tilveiebragte algoritmer. Først anbefales visuell inspeksjon av bildet etter driftskorreksjon ( figur 2C ) for å sikre korrekt bruk av driftskorrigeringsalgoritmen. For det andre, måling av standardavviket for lokaliseringer i både X- og Y-aksen anbefales for å bekrefte nøyaktigheten oppnådd av AFC. Som rapportert tidligere 10 gir AFC typisk bedre presisjon enn forventet av forskjellige lokaliseringsalgoritmer.
Figur 1: ( A B ) Utvidet bilde av boksegruppe i A. Skalbjelke = 500 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SMLM-bilde av en enkelt FND lokalisert i 30.000 bilderammer ( A ) før og ( B ) etter driftskorreksjon med gjennomsnittlig fiducial-korreksjon. Skalestenger = 20 nm (A og B). SMLM bilde av en aktivert Jurkat T celle farget wiAnti-fosforylert SLP76 (Y128) antistoff og FND fiducial markører ( C ) før og ( D ) etter driftskorreksjon med gjennomsnittlig fiducial korreksjon. Skalbjelke = 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den sekventielle multipleksering, driftskorrigering og justeringsprosedyrene i madSTORM tillater nøyaktig, høymultiplexert visualisering av heterogene strukturer i celler. 10 Videre unngår madSTORM begrensningene i flerfarget STORM, for eksempel kromatisk avvikelse og suboptimale fotoomkoblings- / utslippsegenskaper for ikke-fargerøde fargestoffer 9 , 12 . Ettersom elueringstrinnet signifikant reduserer sterisk interferens fra sekvensielt bundne antistoffer, kan madSTORM brukes til å utføre gjentatt avbildning av celleprøver utover 6-10 runder av multiplexert avbildning oppnådd ved tidligere teknikker 9 , 15 , 21 . Videre er sekvensielle eluerings- og fargingstrinnene ikke begrenset til SMLM og kan brukes til andre avbildningsteknikker, så som konfokalmikroskopi, SIM og tofotonmikroskopi. Men gitt det galteTORM er en sekvensiell immunostaining-teknikk, denne teknikken er begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer for hvert målrettet molekyl. Hvert antistoff bør testes nøye for å sikre spesifisitet, merkingseffektivitet og elueringsevne.
Oppkjøpsinnstillingene for madSTORM ble valgt for å maksimere deteksjonen av individuelle fotobrytingshendelser, slik at vi kunne oppnå 2,5 nm gjennomsnittlig lokaliseringspresisjon. Den høye presisjonen kommer imidlertid på bekostning av tiden, og krever ~ 3 timer for hver runde med madSTORM-bildebehandling som diskutert tidligere 10 . For raskere bildeoppkjøp ved lavere lokaliseringspresisjon (5-10 nm) anbefales en kortere eksponeringstid og høyere EM-gevinst ( f.eks. 20 ms eksponering, 300 x EM gain, 17 MHz ved 16 bit, konverteringsgevinst 3). Videre kan multifargedimensjonering ( f.eks. Atto-488, Alexa-568 og Alexa-647 nm) utføres for hver runde av madSTORM-bildebehandling for å øke omfanget av multipleksering, om enn wiEn reduksjon i justeringspresisjon på grunn av kromatisk avvik.
Vi har utført opptil 25 runder med madSTORM-bildebehandling ved hjelp av denne protokollen. Da hele prosedyren utføres med dekselkammeret montert på mikroskopetrinnet, er det viktig å feste dekselkammeret i samme posisjon. For å gjøre dette, bruk autofokusmodus og monter kammeret på mikroskopetrinnet ved hjelp av metallklemmer. Hvis det har skjedd betydelig stadiumdrift, bruk kjente posisjoner av FND fiducial markører for å sentrere celleprøven.
Samtidig visualisering av justerte madSTORM-bilder kan være utfordrende. For samtidig å se 7 eller færre madSTORM-bilder, bruk Color / Merge Channels i ImageJ for å lage et pseudo-farget komposittbilde. For 8 eller flere bilder er det tilrådelig å kategorisere madSTORM-bildene i forskjellige grupper, slå sammen hver gruppe i et sammensatt bilde, og bruk en enkelt LUT-farge på hvert komposittbilde.
10 . Endelig kan utslippsstyrken reduseres med opptil ~ 50% in situ ved bruk av et statisk magnetfelt 23 for NV - ledig FND. Reduksjonen i intensiteten er omtrent lineær opp til ~ 500 Gauss, hvilket betyr at effektenT mettet. I praksis kan intensiteten av diamanter i synsfeltet reduseres til ønsket grad ved å bringe en permanent magnet nærmere mikroskopisk glid fra toppen.
Til slutt optimaliserte vi elueringsbufferen for fjerning av antistoffer rettet mot molekylkomponentene i T-celle-mikroklassen. MadSTORM er ikke begrenset til TCR mikroklustere, men som mikrotubuli, mitokondrier, F-aktin, Vimentin og andre molekylære strukturer er blitt avbildet ved hjelp av denne teknikken 10 . For antistoffer rettet mot andre cellulære rom, kan det være nødvendig med ytterligere trinn for å forstyrre epitopbinding, slik som høyere temperatur, lavere pH og lengre inkubering av elueringsbuffer. Omvendt kan elueringsbufferen brukes uten Tween-20 for å målrette følsomme membranstrukturer, for å forhindre forstyrrelse av ikke-ioniske interaksjoner. Vi forutser i fremtidige eksperimenter at elueringsbuffersammensetningen skal skreddersys for individuelle antistoffer tO optimalisere elueringseffektiviteten og prøvebehandlingen Videre, utover applikasjonen i aktiverte T-celler, kan madSTORM være mulig med andre systemer, inkludert in vitro molekylære komplekser, forskjellige celletyper og vevseksjoner. Ulike parametere av madSTORM-protokollen, slik som fiksering, permeabilisering, antistofffarging og elueringsbufferblanding, må justeres for hvert målrettet system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Xufeng Wu for tilgang til STORM-mikroskopet. Denne forskningen ble støttet av Intramural Research Programmet fra National Cancer Institute (NCI) Center for Cancer Research og National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
