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Neuroscience

Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/56016
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsive para la depresión severa. ECS a nivel mundial estimula la actividad en el hipocampo, a sinaptogénesis y plasticidad sináptica. Aquí, describimos los métodos para la inducción de ECS en ratas y para el fraccionamiento subcelular de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en proteínas sinápticas.

Abstract

Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsiva, el tratamiento más efectivo para la depresión severa. ECS induce convulsiones tonico-clónicas generalizadas con baja mortalidad y muerte neuronal y es un modelo ampliamente utilizado para drogas antiepilépticas de pantalla. Aquí, describimos un método de inducción de ECS en que se entrega una breve corriente de 55 mA para 0.5 s para hombre ratas 200-250 g de peso por medio de electrodos clip de oreja. Tal estimulación bilateral producida etapa 4-5 convulsiones clónicas que duró cerca de 10 s. Tras el cese de ECS aguda o crónica, las ratas más recuperadas para ser indistinguible su comportamiento simulado ratas "no crisis". Porque ECS a nivel mundial eleva la actividad cerebral, también se ha utilizado para examinar alteraciones dependientes de la actividad de proteínas sinápticas y sus efectos en la fuerza sináptica mediante varios métodos. En particular, fraccionamiento subcelular de la densidad postsináptica (PSD) en combinación con Western Blot permite la determinación cuantitativa de la abundancia de proteínas sinápticas a esta estructura sináptica especializada. En contraste con un método de fraccionamiento anterior que requiere gran cantidad de cerebros de roedores, se describe aquí un método de fraccionamiento en pequeña escala para aislar el PSD desde el hipocampo de una rata sola, sin centrifugación gradiente de sacarosa. Usando este método, nos muestran que la fracción aislada del PSD contiene proteínas de la membrana postsináptica, incluyendo PSD95, GluN2B y GluA2. Sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina fueron excluidos de la fracción PSD, demostrando el aislamiento exitoso de PSD. Además, ECS crónica disminuyó la expresión de GluN2B en PSD, lo que indica que nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala puede aplicarse para detectar los cambios en las proteínas PSD hipocampales de una rata sola después de tratamientos genéticos, farmacológicos o mecánicos .

Introduction

La terapia electroconvulsiva se ha utilizado para tratar a pacientes con trastornos depresivos mayores, incluyendo depresión severa resistente a los medicamentos, depresión bipolar, enfermedades de Parkinson y esquizofrenia1,2. En esta terapia, crisis es generada por estímulos eléctricos a la cabeza de los pacientes anestesiados vía epicranial electrodos1,2,3. Administración repetitiva de ECS ha sido clínicamente beneficiosa para los trastornos depresivos resistentes a los medicamentos1,2,3. Sin embargo, el mecanismo exacto subyacente la eficacia a largo plazo del efecto antidepresivo en los seres humanos ha permanecido elusivo. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva y es ampliamente utilizada para investigar su mecanismo terapéutico. En roedores, ECS aguda y crónica tratamiento de ECS promoción la neurogénesis adulta en el hipocampo y reorganizan la red neuronal4,5, que es probable que contribuyen a las mejoras en la flexibilidad cognitiva. Además, la elevación global de la actividad cerebral por ECS altera la abundancia de las transcripciones, como un cerebro derivada factor neurotrópico6y varias proteínas, incluyendo metabotrópicos glutamato receptor 17 y la N-metil-D-Aspartato (NMDA) tipo glutamato receptor subunidades7. Estos cambios están involucrados en mediar modificación a largo plazo del número de sinapsis, estructura y fuerza en el hipocampo7,8,9.

En modelos ECS, estimulación eléctrica se entrega a los roedores mediante electrodos implantados stereotaxically, electrodos corneales o electrodos de oído evocar convulsiones tonico-clónicas generalizadas10,11. Implantación estereotáctica de electrodos consiste en una cirugía de cerebro y requiere un tiempo considerable para mejorar las habilidades quirúrgicas del experimentador para minimizar el daño. Menos invasivos electrodos corneales pueden causar sequedad y abrasión corneal y requieren anestesia. El uso de electrodos clip de oreja omite estas limitaciones ya que pueden ser utilizados en roedores sin cirugía ni anestesia y causar lesión mínima. De hecho, encontramos que actual ratas entregado a despierto a través de clip de oreja electrodos confiablemente induce convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5 y altera las proteínas sinápticas en sus hipocampos10.

Para examinar la abundancia ECS-inducida de proteínas sinápticas en las regiones específicas del cerebro de los roedores, es importante elegir los métodos experimentales que son los más adecuados para su detección y cuantificación. Fraccionamiento subcelular del cerebro permite el aislamiento crudo de proteínas solubles del citosol; proteínas de membrana; proteínas orgánulo-límites; e incluso las proteínas en especiales estructuras subcelulares, tales como el PSD12,13,14. El PSD es un dominio subcelular densa y bien organizado en las neuronas en que las proteínas sinápticas están concentradas en y cerca de la membrana postsináptica12,13,15. El aislamiento de la PSD es útil para el estudio de las proteínas sinápticas enriquecido en el PSD, desde cambios dinámicos en la abundancia y la función de receptores de glutamato postsinápticos, proteínas de andamiaje y proteínas de transducción de señal en el PSD12 , 15 , 16 , 17 se correlacionan con la plasticidad sináptica y la synaptopathy observada en varios trastornos neurológicos17,18. Un método de fraccionamiento subcelular anterior utilizado para purificar el PSD participando el aislamiento de la fracción insoluble en detergente de la fracción cruda de la membrana del cerebro de la centrifugación diferencial de gradientes de sacarosa14, 19. el gran reto con este método tradicional es que requiere grandes cantidades de roedores los cerebros de14,19. Preparación de roedores 10-20 para aislar la fracción de la PSD por tratamiento requiere amplia costo e inversión de tiempo y no es prácticamente posible si hay muchos tratamientos.

Para superar este reto, hemos adaptado un método más sencillo que directamente aísla la fracción PSD, sin centrifugación del gradiente de sacarosa de20,21y revisada para que sea aplicable al aislamiento de PSD desde el hipocampo de una rata sola cerebro. Nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala produce sobre 30-50 μg de las proteínas PSD de 2 hipocampos, suficientes para el uso en diversos estudios bioquímicos, incluyendo inmunoprecipitación y Western blotting. El borrar occidental demuestra el éxito de nuestro método para aislar el PSD al revelar el enriquecimiento de proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) y la exclusión de sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina. Nuestra inducción de ECS y métodos de fraccionamiento de PSD en pequeña escala son fácilmente adaptables a otras regiones del cerebro de roedores y proporcionan una manera relativamente simple y confiable para evaluar los efectos de ECS en la expresión de las proteínas PSD.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales incluyendo temas animal han sido aprobados por el cuidado de animales institucional y Comité de uso de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign.

1. mantener una colonia de la rata

  1. Raza de ratas Sprague-Dawley (véase la Tabla de materiales) y mantenerlas en condiciones estándar con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso ad libitum al alimento y al agua.
  2. Destetar las crías de rata en el día postnatal (P) 28 y alojarlos en grupos de 2-4 hermanos de camada machos o hembras.
  3. Marque las colas de ratas macho con un marcador negro permanente no tóxico para la identificación.
  4. Peso de las ratas macho 3 veces por semana y registrar sus pesos corporales.

2. preparación de una máquina ECS

  1. En 7:30, desinfectar el Banco en la sala de preparación de animales y poner una máquina ECS (generador de pulso) en el Banco.
  2. Lugar una rata macho individual pesa 200-250 g en una jaula limpia, vacía con una tapa. Repita para todas las ratas macho tratados con inducción de ECS. Que las ratas habituarse durante 30 minutos.
  3. Mientras que las ratas son habituar en sus jaulas, establece un generador de pulsos para la inducción de ECS en la frecuencia de 100 pulsos/s, una anchura de pulso de 0,5 ms, una duración de choque de 0,5 s y una corriente de 55 mA (figura 1A).
  4. Preparar el generador de impulsos empujando el botón de "RESET" y asegurando que el botón "Listo" se ilumina. Asegúrese que los clips de la oreja no están conectados a un generador de pulsos y luego presionen el botón de "Choque" durante unos segundos.
    Nota: en este punto, el generador de pulso está listo para la inducción de la ECS.
  5. Conecte los clips de la oreja en el generador de impulsos.

3. inducción de ECS aguda

Nota: Vea figura 1B, panel superior.

  1. Moje los clips del oído con solución salina estéril y asegurar que están saturadas.
  2. Mojar orejas de rata con solución salina estéril envolviéndolas en una gasa empapada en solución salina. Una vez mojados, retirar la gasa.
  3. Coloque un clip por oído, posición más allá de la banda principal del cartílago.
  4. Confirmar en la máquina ECS que se establece un lazo verdadero; Si no, un mensaje de error o una lectura de "1" aparecerá en la máquina.
  5. Use un guante grueso, no metal. Sosteniendo la rata suavemente en una mano enguantada, presione el botón de "Choque" durante unos segundos y suelte lentamente el apretón en la rata para observar la incautación. Para la farsa de "no crisis" (NS) de control, manejar la rata idénticamente pero no entregan la corriente.
  6. Desconecte las abrazaderas del oído como clonus comienza y registrar el comportamiento de incautación según escala22 que incluye "movimientos de boca y facial" (etapa 1), "cabeceo" (etapa 2), "clonus del miembro anterior de un Racine revisado" (etapa 3), "crianza con clonus de miembro anterior" (etapa 4), "crianza y caer con clonus de miembro anterior" (etapa 5). La toma debe durar aproximadamente 10 s; registrar la duración de la crisis mediante un temporizador.
  7. Tras la terminación de la crisis, volver la rata a su jaula casera. Seguimiento de la rata para otros 5 minutos para asegurarse de la recuperación de la rata de las convulsiones. Mantenerlo ubicado solo en la jaula y volver a la jaula a la sala de recuperación.
  8. Repetir la inducción de ECS en la rata próxima.
  9. Controlar las ratas en el resto del día y al menos una vez en la mañana y una vez en la tarde del día siguiente hasta que son sacrificados para los experimentos.
    Nota: El método de inducción de ECS puede llevar a signos clínicos como un efecto secundario accidental, que requiere atención. Por ejemplo, el protocolo de inducción de ECS podría inducir convulsiones que duran más de 15 s y causa sufrimiento innecesario a las ratas. En este caso, terminar la convulsiones utilizar diazepam (10 mg/kg, i.p.) o pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Si las ratas desarrollan dificultad respiratoria o anormalidades del comportamiento severas tras el cese de la convulsión, les eutanasia por inhalación de dióxido de carbono, seguida por decapitación.

4. inducción de ECS crónica

Nota: Ver figura 1B, panel inferior.

  1. Inducir una ECS por día a la misma hora en la mañana como se describe en los pasos 1-3, anteriormente, durante siete días consecutivos.
  2. Monitor de las ratas dos veces al día después de que regresaron a su casa de jaulas.

5. homogeneización y fraccionamiento de hipocampo de rata

Nota: Véase la figura 2.

  1. Preparar un buffer de homogeneización fresco (solución A) que contiene sacarosa 320 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 200 ácido okadaico de nM y los inhibidores de la proteasa. Filtro-esterilizar el búfer utilizando filtros con un tamaño de poro de 0,22 μm para la filtración de vacío y coloque en hielo.
  2. En un momento dado el punto después de ECS aguda o crónica ECS (figura 1), eutanasia la rata por la inhalación de CO2 por 5-10 min, seguida de decapitación con una guillotina.
  3. Quitar el cerebro y diseccionar los hipocampos en la placa metálica colocada en hielo, como se describió anteriormente23,24.
  4. Coloque dos hipocampo de una rata en un cultivo de tejido de 30-mm plato y picar en trozos pequeños con unas tijeras.
  5. Transferencia de los hipocampos picaditos a un homogeneizador de vidrio manual con una pipeta de 1 mL y añadir 1 mL de buffer de homogenización helada (solución A, paso 5.1). Inserte un mortero redondo en un homogeneizador de vidrio. Mientras el homogenizador de vidrio en el hielo, suavemente y constantemente al movimiento hacia arriba y hacia abajo en la mano del mortero 10 - 15 veces durante 1 minuto, hasta desaparecerán pequeñas porciones de tejido del hipocampo.
  6. Transferir el homogenizado a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y centrifugar el homogeneizado a 800 x g por 10 min a 4 ° C para separar el sobrenadante postnuclear (fracción S1) pellets que contiene tejido insoluble y núcleos (fracción de P1). Transferir 50 μl y 950 μl de la fracción S1 a dos tubos de microcentrífuga de separado, nuevo 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar estos tubos en hielo. Guardar el sedimento de la fracción de P1 en el hielo.
  7. Centrifugar la fracción S1 (950 μL) durante 10 minutos a 13.800 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante (fracción S2), enriquecido con proteínas citosólicas solubles, y el pellet (fracción de P2), enriquecido con proteínas de membrana, incluyendo proteínas synaptosomal. Transferir la fracción S2 a una microcentrífuga nuevo de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar en hielo.
  8. Resuspender el precipitado (fracción de P2) en 498 μl de agua purificada fría utilizando una pipeta de 1 mL. Añadir 2 μl de 1 M HEPES (pH 7,4) con una pipeta de 20 μl para alcanzar una concentración final de 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubar a 4 ° C con agitación por 30 minutos tienda la fracción P2 resuspendida en el hielo.
  9. Determinar la concentración de proteína de las fracciones S1, S2 y P2 utilizando un ensayo BCA. Añadir 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fracción para alcanzar una concentración de 1 mg/mL y guardar a-80 ° C hasta su uso, o proceso de la fracción de P2 para aislar el PSD.

6. aislamiento de la PSD de la fracción de membrana cruda proteína (P2)

  1. Centrifugar la fracción P2 (500 μl) por 20 min a 25.000 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante sometidas a lisis (LS2 fracción) y el pellet sometidas a lisis (fracción de LP1). Transferencia de la fracción de LS2 a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar en hielo.
  2. Resuspender el precipitado de LP1 en 250 μl 50 mm HEPES (pH 7.4) mezclado con 250 μl de detergente al 1% en el 1 x de tampón PBS con una pipeta de 1 mL. Incubar a 4 ° C con agitación suave durante 15 minutos.
  3. Centrifugue la LP1 resuspendido por 3 h a 25.000 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante (fracción no-PSD) pellets (fracción de PSD). Quite el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL y resuspender el precipitado PSD en 100 μl de 50 mM HEPES (pH 7,4) con una pipeta de 200 μl.
  4. Determinar la concentración de proteína de las LS2, no PSD, PSD fracciones y usando un análisis de la BCA. Añadir 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fracción para alcanzar una concentración de 1 mg/mL y guardar a-80 ° C hasta su uso.
    Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 5-6 (es decir, solución tampón HEPES y tampón PBS) deben hacerse con agua purificada libre de partículas y contaminantes iónicos y orgánicos.

7. Western Blotting

  1. Descongelar cada fracción de proteína en el hielo. Transferencia 12 μl de cada fracción (S2 P2 y PSD en 1 mg/mL) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 20 μl.
  2. Agregar 3 μl de tampón de muestra de SDS de x 5 e incubar a 75 ° C por 30 min en un baño de agua. Enfriar la muestra a temperatura ambiente (RT).
  3. Cargar 10 μl de la muestra de proteína en cada pozo de 4-20% peine de 15 pozos gradiente SDS-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) en gel utilizando una pipeta de 20 μl. Correr el gel en el aparato de SDS-PAGE y en el 80-100 V en el almacenador intermediario de funcionamiento (25 mM Tris, glicina de 190 mM y 0.1% SDS; pH 8,3).
    Nota: Cada gel debe contener muestras de proteína de NS ratas y ratas ECS en diferentes puntos temporales después de ECS aguda o crónica.
  4. Transferencia de las proteínas de la SDS-PAGE gel a una membrana de difluoruro de polivinilo (PVDF) en los aparatos de transferencia en 25-30 V (60 mA) durante 9-12 h en tampón de transferencia (25 mM Tris, glicina de 190 mM y metanol 20%; pH 8,3).
  5. Quitar la membrana PVDF de la unidad de transferencia y lavar en solución salina tamponada con Tris (TBS) por 5 min en un agitador multiuso a TA.
  6. Bloquear la membrana en la leche de 5% y 0,1% Tween-20 en TBS para 1 h. Incubar en anticuerpos primarios (tabla 1) en tampón de lavado (leche 1% y 0,1% Tween-20 en TBS) durante la noche en un rotador de multiuso a 4 ° C (véase la Tabla de materiales para las diluciones).
  7. Lavar la membrana 4 tiempos de 10 minutos en tampón de lavado y luego lo Incube con peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado anticuerpos secundarios en lavado tampón durante 1 h en un rotador de multiuso a TA.
  8. Lavar la membrana 4 tiempos de 10 minutos en tampón de lavado y luego con TBS durante 5 minutos.
  9. Incubar la membrana con mayor chemifluorescence sustrato durante 1 min y exponerlo a la película de rayos x. Desarrollar la película expuesta con un procesador de la película.

8. cuantificación de Western Blots

  1. Análisis del Western blot como un archivo TIFF y guardar este archivo en el ordenador.
  2. Abra el archivo de Western blot en el programa ImageJ como una imagen en escala de grises, debajo de "Archivo", "Abrir imagen" flecha derecha "escala de grises".
  3. Elija la herramienta selección rectangular de la barra de herramientas de ImageJ y dibujar un rectángulo que cubre una banda de Western blot solo de una proteína de interés.
  4. Bajo "Analizar," golpeó "Medida" para obtener el área y la densidad media de un grupo seleccionado.
  5. Mover el rectángulo a un área de fondo sin cambiar su forma y tamaño. Repita el paso 8.4 a la zona y la densidad media de un fondo.
  6. Restar el valor de la densidad media de una banda de fondo de la de una banda de Western blot, lo que da la densidad de banda resta de fondo de la proteína de interés.
  7. Repita los pasos 8.2 8.6 para todas las bandas de Western blot de interés.
  8. Dividir la densidad de banda resta de fondo de la proteína del interés por la densidad de banda resta de fondo de un producto génico de limpieza, tales como α-tubulina; Este paso obtiene el valor normalizado de la proteína de interés.

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Representative Results

Utilizando el procedimiento detallado aquí, presenta una descarga eléctrica (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) suministra a través de clip de oreja electrodos inducida por etapa no recurrente asimientos tónico-clónicos 4-5 en la rata (figura 1A-B). Un total 8 de ratas recibió inducción aguda de ECS y aparecen convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5. Las crisis duraron cerca de 10 s y todas las ratas recuperadas dentro de 1-2 minutos de cese de la convulsión. Las ratas Sham "sin embargo" no recibió una descarga eléctrica y por lo tanto no se mostraban convulsiones. Se utilizaron un total de 4 ratas sham. Para la inducción crónica de ECS, las ratas recibieron una descarga eléctrica por día durante 7 días consecutivos y muestran asimientos tónico-clónicos etapa 4-5 en cada choque eléctrico (figura 1A-B). Un total 8 de ratas recibieron inducción crónica de ECS y un total de 4 ratas sham fueron utilizados como ratas de la "no crisis". Aunque la mayoría las ratas que recibieron ECS crónica eran conducta indistinguibles de farsa ratas "no crisis", unos temblores de cuerpo desarrollado y disminución de la actividad exploratoria por la electrocución de 7th .

Para examinar si elevación global ECS-inducida de la actividad altera la expresión de proteínas en el hipocampo, ratas fueron sacrificadas a las 3 h y 24 h después de ECS aguda y en 24 h y 96 h después de la final ECS en el tratamiento crónico de la ECS (figura 1B). Dos hipocampos de cada rata rápidamente fueron disecados y sometidos a nuestro protocolo optimizado de fraccionamiento en pequeña escala (figura 2). El homogeneizado inicial de dos hipocampos de tejido insoluble y núcleos (fracción S1) nuevamente se centrifugó a 13.800 x g por 10 min separar el sobrenadante que contiene proteínas citoplásmicas solubles (fracción S2) de la pelotilla de membrana cruda que contiene sinaptosomas (fracción de P2) (figura 2). El Western blot detecta proteína citoplásmica α-tubulina en las fracciones de la S2, pero no las fracciones de la P2, del hipocampo de ratas tratadas con ECS aguda y crónica (figura 3 y figura 4), demostrando el éxito fraccionamiento de proteínas solubles citosólicas de membrana cruda pellets.

PSD95 es un miembro de la familia de asociados de membrana guanilato cinasa (MAGUK) y un componente esencial de PSD12,18,25. Se detectaron PSD95 y subunidad del receptor NMDA GluN2B exclusivamente en las fracciones de P2, pero no las fracciones de S2 (figura 3 y figura 4). Expresión más fuerte de otro glutamatérgicos α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico ácido (AMPA) subunidad del receptor GluA2 se detectó en las fracciones de P2 en comparación con las fracciones de S2 en el hipocampo (figura 3 y figura 4), indicando que las proteínas de la membrana postsináptica se enriquecen en las pelotillas de la fracción de membrana cruda P2. Curiosamente, vesícula sináptica proteína sinaptofisina y proteína integral de membrana estriada enriquecido tirosina fosfatasa 61 (paso61)26 detectaron igualmente en las fracciones S2 y P2 (figura 3 y figura 4). Teniendo en cuenta el pequeño tamaño de las vesículas sinápticas-con un diámetro promedio de 39 nm27 y endosomas, la centrifugación para aislar la pelotilla de membrana cruda (fracción de P2) no habría sido suficiente para que sedimenten todas las vesículas sinápticas y endosomas. Juntos, estos resultados indican que nuestro protocolo de fraccionamiento crudo puede enriquecer las proteínas de membrana y proteínas transmembranales que no están asociadas con vesículas sinápticas y posiblemente con endosomas en la fracción de membrana cruda P2.

Para examinar si elevación global ECS-inducida de la actividad altera la expresión de proteínas postsinápticas en los hipocampos, la fracción de membrana cruda P2 se lisis en agua helada, resuspendió en buffer HEPES y se centrifugó a 25.000 x g por 20 min aislar el sometidas a lisis pellets (LP1) (figura 2). La pelotilla de LP1 se resuspendió en buffer HEPES que contiene detergente al 1% Tritón X-100 y se centrifugó a 25.000 x g durante 3 h para obtener el pellet PSD (figura 2). El Western blot subsecuente de las fracciones PSD detectado PSD95, GluN2B y GluA2 (figura 3 y figura 4), que se conocen las proteínas postsynaptic17,25,28. Sin embargo, las fracciones PSD carecían de α-tubulina y, importante, sinaptofisina marcador presináptica (figura 3 y figura 4). PASO61, que desfosforila GluN2B y GluA2 y actúa como su regulador negativo29,30,31, no se encuentra en las fracciones PSD (figura 3 y figura 4), consonancia con el reciente informe demostrando la exclusión sináptica de paso61, mediada por PSD95 enriquecido en el PSD26. En conjunto, estos resultados indican que nuestro método de fraccionamiento en pequeña escala con éxito aísla proteínas PSD de la fracción de membrana cruda P2.

La cuantificación de Western blotting revelaron que GluN2B expresión fue inalterado en la fracción de P2 pero muestra una tendencia creciente en la fracción PSD en 3 h y 24 h después de ECS aguda (n = 4) (figura 3B). Expresión de GluA2 no fue cambiado en el P2 y el PSD fracciones en 3 h y 24 h después de ECS agudo (figura 3C). En 24 h y 96 h después de ECS crónica, expresión de GluN2B muestra una tendencia decreciente en la fracción de P2 y se redujo significativamente en la fracción PSD (24 h: p < 0.05, n = 4, 48 h: p < 0.01 n = 4) (figura 4B). En cambio, ECS crónica no afectó la expresión de GluA2 en las fracciones P2 y PSD (n = 4) (figura 4C).

Figure 1
Figura 1 : Esquema de la inducción de ECS aguda y crónica ECS. (A) A rata fue conectado a un generador de pulso vía electrodos clip de oreja y un choque eléctrico (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) se aplicó para provocar convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5. (B) aguda ECS fue inducida por una descarga eléctrica. ECS crónica fue sacada por una descarga eléctrica por día durante 7 días consecutivos. Los puntos de tiempo indicados representan la duración después de la inducción de ECS aguda o la última ECS para la inducción de ECS crónica antes de la disección de los hipocampos. No farsa de la "crisis" las ratas de control (NS) se manejaron de manera idéntica pero no recibió un choque eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Flujo de trabajo de fraccionamiento subcelular para aislar el S2 P2 y fracciones PSD desde el hipocampo de rata solo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Examen de proteínas sinápticas en hipocampo S2 P2 y fracciones de PSD de las ratas que recibieron NS o ECS aguda. (A) representante manchas blancas /negras occidentales muestran la expresión de la proteína de la subunidad del receptor NMDA GluN2B, receptor AMPA GluA2 y paso61 en el S2, P2, y fracciones de la PSD de los hipocampos de sham "no crisis" (NS) las ratas y las ratas que recibieron ECS aguda. La proteína citoplásmica soluble α-tubulina se enriquece en la fracción S2. Sinaptofisina es una proteína de la vesícula presináptica y se enriquece en la membrana cruda fracción de P2, pero no en la fracción PSD. PSD-95 se enriquece en fracciones el P2 y el PSD. (B-C) Cuantificación de GluN2B (B) y GluA2 (C) en las P2 y PSD fracciones en 3 y 24 h después de ECS aguda (n = 4 ratas por el momento). Expresión de GluN2B y GluA2 en la fracción de P2 se normalizó a α-tubulina en la fracción S2. Expresión de GluN2B y GluA2 en la fracción PSD fue normalizada a PSD-95 en la fracción PSD. Los datos se presentan como el por ciento ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Examen de proteínas sinápticas en hipocampo S2 P2 y fracciones de PSD de las ratas que recibieron NS o ECS crónica. Representante de Western blots de α-tubulina; sinaptofisina; PASO61; y proteínas postsynaptic, incluyendo PSD95, GluN2B y GluA2, en las fracciones S2 P2 y PSD de los hipocampos de sham "no crisis" (NS) las ratas y las ratas recibieron ECS crónica. La proteína citoplásmica soluble α-tubulina se enriquece en la fracción S2. Sinaptofisina es una proteína de la vesícula presináptica y se enriquece en la membrana cruda fracción de P2, pero no en la fracción PSD. PSD-95 se enriquece en fracciones el P2 y el PSD. (B-C) Cuantificación de GluN2B (B) y GluA2 (C) en las P2 y PSD fracciones a las 24 y 96 h después de ECS crónica (n = 4 ratas por el momento). Expresión de GluN2B y GluA2 en la fracción de P2 se normalizó la α-tubulina se une a la fracción S2. Expresión de GluN2B y GluA2 en la fracción PSD fue normalizada a PSD-95 en la fracción PSD. Los datos se presentan como porcentaje ± SEM; * p < 0.05, ** p < 0.01 comparada con control (test ANOVA y de Tukey post hoc ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fracción Fracción de la proteína Marcador de la proteína
P1 Nuclear Histon H1
S1 Citosol/membrances a-tubulina (citoesqueleto) y GAPDH (citosol)
P2 Sinaptosomas crudos Subunidades del receptor AMPA y NMDA
S2 Citosol luz membrances GAPDH (citosol) y LAMP1 (lisosoma)
Membrana Synaptosomal Synaptosome/mitocondrias Subunidades del receptor AMPA y NMDAR, sinaptofisina (marcador presináptica)
PSD PSD Subunidades del receptor AMPA y NMDA, PSD95, PICK1, CaMKII

Tabla 1: Lista de marcadores de proteínas y anticuerpos para distinguir fracciones subcelulares.

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Discussion

Aquí, describimos un método de inducción de ECS en ratas que provoca la estimulación global de la actividad neuronal en sus hipocampos. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva, que se utiliza clínicamente para tratar trastornos depresivos refractarios de drogas en los seres humanos1,2,3. A pesar de uso de la terapia electroconvulsiva para tratar la depresión severa, el mecanismo exacto subyacente sigue siendo confuso. Porque ECS induce comportamientos anti-depressant-como en roedores y estimula la neurogénesis hipocampal4,32, ECS se ha utilizado extensivamente para investigar si el nuevo nacido adulto las neuronas en el giro dentado del hipocampo contribuyen al comportamiento de antidepresivos5,32.

ECS induce leve a grave crisis tonicoclónicas generalizadas en roedores a la entrega actual a través de electrodos implantados stereotaxically, electrodos corneales o clip de oreja electrodos33,34. Las grabaciones de EEG en pacientes han revelado que la estimulación eléctrica bilateral causa asimientos más prominentes y más generalizados de estimulación unilateral hace35,36. En nuestro método de inducción de ECS, convulsiones tonico-clónicas son inducidas por la entrega actual a través de electrodos no invasivos-clip de oreja a ambos oídos, mímico las convulsiones en los seres humanos evocados por estimulación bilateral36. Aunque no hemos comprobado la eficacia de la CE en las ratas a las que se aplica sedación o anestesia, es posible que dando medicamentos anestésicos a las ratas podría reducir el grado de convulsiones inducidas por estimulación eléctrica, que puede ser debido a que Estado de anestesia es fisiológico asociado con mayor tono excitatorio inhibitorio y humedecido en la red del cerebro. Además, el paso crítico en el método de inducción de ECS es a dial experimentalmente la intensidad de corriente para obtener etapa 4-5 generalizada tónico - asimientos clónicos basados en la edad, peso y las especies de roedores.  Nuestro método de inducción de ECS se ha optimizado para la inducción de convulsiones etapa 4-5 en unos pocos segundos en ratas de Sprague-Dawley macho despiertos con 200-250 g de peso. Si las ratas en estado de anestesia se utilizaron para la inducción de ECS, la intensidad, duración y frecuencia de entrega actual deben modificarse para la inducción exitosa de convulsiones que van desde 4 a 5.

ECS también ofrece la ventaja de estimular la hiperactividad de las neuronas y causar convulsiones transitorias agudas con muy baja mortalidad33, en contraste con chemoconvulsants, como la pilocarpina y silvinita, que inducir epilepticus del estado y crónica manifestación espontáneas convulsiones recurrentes y alteraciones histológicas severas37,38. Aunque ECS se ha utilizado rutinariamente a los fármacos antiepilépticos de pantalla33,34, ECS aguda y crónica ECS no resultan en la generación de la epilepsia crónica y así no se puede utilizar en un modelo animal para el estudio de epileptogénesis. En cambio, ECS se ha empleado ampliamente para examinar el grado en que la gran elevación de la actividad cerebral altera modificaciones postraduccionales de las proteínas sinápticas en vivo, que contribuyen a cambios persistentes en synaptic o expresiones fuerza y estructuras (figura 3 y figura 4)10,40. En este estudio, hemos utilizado ratas macho para excluir los efectos inesperados del estro ciclo fase de ratas hembras en la cantidad de proteína PSD después de ECS. Sin embargo, se observó que no hay diferencias de sexo en las proteínas del andamio, incluyendo PSD-95 y SAP102 en la región PSD de la corteza frontal y el hipocampo39, lo que implica que los cambios hormonales que regulan el ciclo estral no afecte la basal cantidad de proteínas PSD.

Varios métodos han sido empleados para examinar el grado en que ECS induce cambios en la neurogénesis, sinaptogénesis y plasticidad sináptica5,6,7,8,9, 11 , 40. las grabaciones electrofisiológicas de corriente excitatorio postsináptico (EPSC) son ampliamente utilizadas para detectar los cambios en la fuerza sináptica de excitatorios glutamatérgicos sinapsis21. Por ejemplo, grabaciones de EPSC miniatura han revelado el downscaling homeostática de fuerza excitatoria sináptica en las neuronas piramidales corticales de las capas II-III de ratones tras aguda ECS41. Sin embargo, la identificación de proteínas sinápticas que contribuyan a la plasticidad sináptica inducida por la ECS es desafiante porque las grabaciones electrofisiológicas deben estar emparejadas con el nocaut genético o precipitación de las proteínas sinápticas candidato específico. Cambios en el nivel de los receptores de glutamato en la membrana postsináptica y proteínas sinápticas enriquecidas en el PSD regulan la fuerza y la eficacia de transmisión sináptica excitatoria17,18,25. Aunque immunohistochemistry puede utilizarse para examinar los cambios inducidos por la ECS en la expresión de proteínas sinápticas, esta técnica puede examinar sólo las proteínas sinápticas del candidato 1-2 a la vez y requiere validados anticuerpos que reconocen específicamente sin causar tinción inespecífica.

El fraccionamiento subcelular del tejido de cerebro en combinación con el borrar occidental ofrece ventajas sobre la electrofisiología e immunohistochemistry en la identificación de proteínas sinápticas que son alteradas por ECS. El fraccionamiento subcelular de tejido cerebral es un método rápido y crudo bioquímico para separar proteínas citosólicas solubles (fracción S2) de las membranas crudas (fracción de P2), incluyendo membranas ER y Golgi, membrana-limite organelles, membranas del plasma, y membranas terminal sinápticas que sellar formulario sinaptosomas42,43,44. La fracción PSD puede ser más aislado de la fracción de P2 para enriquecer las proteínas sinápticas42,43,44. El análisis proteómico imparcial de la fracción PSD podría identificar todas las proteínas PSD cuyos niveles se alteran por ECS. Western Blot se puede realizar rápidamente para examinar los cambios de expresión de las proteínas PSD, que pueden ser fácilmente identificados de bandas inespecíficas.

El anterior método de fraccionamiento del cerebro requiere una gran cantidad de roedores cerebro tejido42,43,44, haciendo esta técnica desafiadora para el uso al examinar solubles o proteínas de la membrana de un individuo cerebro de roedor o una región del cerebro específicas de un solo cerebro. Hay una creciente demanda para comparar cuantitativamente el proteoma de la región de un cerebro a otro y de un animal del control a un animal transgénico o un animal que ha sufrido un tratamiento específico. Por lo tanto, hemos revisado y optimizado el método de fraccionamiento tradicional cerebro para aislar fracciones solubles y de membrana crudas de dos hipocampo de una rata sola. Nuestro protocolo de fraccionamiento crudo en pequeña escala con éxito aislado crudo P2 fracciones de membrana de fracciones solubles citosólicas de S2, como se indica por la falta de proteína citoplásmica α-tubulina en las fracciones de la P2, que unida a la membrana PSD95 fue detectada en el P2 pero no S2 fracciones (figura 3A y 4 de la figuraA). Utilizando el método descrito aquí, cuantitativamente hemos demostrado que ECS agudo significativamente aumenta paso61 expresión y disminuye la fosforilación de tirosina de sus substratos, GluN2B y la quinasa regulada por señal extracelular 1/2 en el crudo fracción de membrana P2 de hipocampo de rata a las 48 h después ECS aguda10.

Inesperadamente, el synaptophysin fracciones contenidas S2; PASO61; y, en mucha menor medida, GluA2 (figura 3A y 4 de la figuraA). PASO61 es una glicosilada integral de la membrana proteína26 asociados con el retículo endoplásmico (ER) y el PSD45. Es posible que la centrifugación para aislar la pelotilla de membrana cruda (fracción de P2) no habría sido suficiente para que sedimenten todas vesículas sinápticas que contienen sinaptosomas, así como endosomas y lisosomas que contienen GluA2 y paso61. Sin embargo, claro enriquecimiento de GluN2B, GluA2 y PSD95 y la falta de α-tubulina en las fracciones de P2 indican que nuestro protocolo de fraccionamiento puede enriquecer las proteínas de membrana y proteínas transmembranales que no están asociadas con vesículas sinápticas y endosomas en la fracción de membrana cruda P2.

Aunque la fracción de membrana cruda P2 contiene sinaptosomas, una limitación de examinar alteraciones dependientes de la actividad de proteínas sinápticas en la fracción de P2 es que no se puede determinar la ubicación exacta de sus cambios. Proteínas sinápticas enriquecidas en el PSD pudieran determinarse, otro bioquímico fraccionamiento puede utilizarse para aislar el PSD. El anterior método de fraccionamiento de PSD requiere una gran cantidad de tejido cerebral de roedor (es decir, cerebros de roedores 10-20) y gradientes de sacarosa42,43,44. Porque este método tradicional es insuficiente para aislar una cantidad suficiente de la fracción PSD de dos hipocampo de una rata sola, hemos adaptado un método más simple que aísla directamente la fracción PSD, sin sacarosa gradiente20,21 . Este método produce sobre 30-50 μg de la proteína de la PSD, suficiente para diversos estudios bioquímicos, incluyendo borrar occidental. Nuestro método enriquece PSD95, GluN2B y GluA2, que se concentró en la fracción de la PSD y detecta cambios en la expresión GluN2B en fracción PSD tras inducción crónica de ECS (figura 3 y figura 4).

Aquí, nuestro análisis de Western blot cuantitativo no revelaron ningún cambio significativo en la expresión de GluA2 en las fracciones P2 y PSD en 3 h y 24 h después de ECS agudo (figura 3C). La expresión GluN2B era sin alteraciones en la fracción P2 pero muestra una tendencia creciente en la fracción PSD en 3 h y 24 h después de la aguda ECS (figura 3B), sugiriendo la posible regulación diferencial de sinápticos y extrasinápticos GluN2B que contiene los receptores NMDA. También observamos que GluN2B expresión muestra una tendencia decreciente en la fracción P2 después de ECS crónica y se redujo significativamente en la fracción PSD a las 24 y 96 h después de ECS crónica (figura 4B). Aunque altamente especulativa, tal retiro de GluN2B de la PSD tras inducción repetitiva de ECS puede mediada por múltiples mecanismos, incluyendo la internalización directa de la difusión de la membrana o lateral PSD a sitios extrasinápticos. Considerando nuestro anterior informe mejora prolongada de la actividad neuronal marcado aumenta la expresión de61 paso y reduce la fosforilación de Tyr de GluN2B en las fracciones de P2 de neuronas hippocampal cultivadas46, nuestros resultados sugieren que una disminución en la expresión de GluN2B en el P2 y las fracciones PSD después crónica ECS puede ser probablemente debido a mayor expresión de61 de paso y el retiro subsecuente del GluN2B de la membrana extrasinápticos.

En Resumen, hemos demostrado que nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala, en combinación con un protocolo de inducción de ECS, nos permite distinguir en vivo la regulación dependiente de la actividad de los receptores de glutamato en la membrana postsináptica frente a las membranas de plasma total, incluyendo las membranas extrasinápticos. Este protocolo puede aplicarse fácilmente a cualquier proteínas sinápticas en las sinapsis excitatorias y puede modificarse para otros hipocampos roedores u otras regiones del cerebro ajustando el volumen de cada solución basada en el peso del tejido. Así, nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala es versátil y puede ser adoptada para que futuras aplicaciones examinar los cambios en vivo en las proteínas postsynaptic en cada animal sobre el tratamiento genético, farmacológico o mecánico.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Dr. Eric C. Bolton por permitirnos usar su centrífuga para el fraccionamiento y el Dr. Graham H. Diering en laboratorio del Dr. Richard L. Huganir Universidad de John Hopkins por facilitarnos el protocolo en pequeña escala para el fraccionamiento de la PSD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spargue-Dawley rat Charles River Laboratories ECS supplies
A pulse generator Ugo Bsile, Comerio, Italy 57800 ECS supplies
MilliQ water purifying system EMD Millipore Z00Q0VWW Subcellular fractionation supplies
Sucrose Em science SX 1075-3 Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2 SIGMA-ALDRICH 221368 Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) SIGMA-ALDRICH E9884 Subcellular fractionation supplies
HEPES SIGMA-ALDRICH H0527 Subcellular fractionation supplies
Okadaic acid TOCRIS 1136 Subcellular fractionation supplies
Halt Protease Inhibitor Thermo Scientific 78429 Subcellular fractionation supplies
NaVO3 SIGMA-ALDRICH 72060 Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters Fisher Scientific SCGPS05RE Subcellular fractionation supplies
Iris Scissors WPI (World Precision Instruments) 500216-G Subcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dish Fisher Scientific 08-772B Subcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestle VWR 89026-384 Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tube DENVILLE SCIENTIFIC INC.  C2170 (1001002) Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge  Thermo Fisher 75004521 Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL Thermo Fisher #23228 Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL Thermo Fisher #1859078 Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) BIO-RAD #4561086S Western blot supplies
Running Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel BIO-RAD #1658004 Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane  Milipore IPVH00010 Western blot supplies
Transfer Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Tris-base Fisher Scientific BP152-1 Western blot supplies
Glycine Fisher Scientific BP381-5 Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfate SIGMA-ALDRICH 436143 Western blot supplies
Methanol  Fisher Scientific A454-4 Western blot supplies
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module  BIO-RAD #1703935 Western blot supplies
Nonfat instant dry milk Great value Western blot supplies
Multi-purposee rotator  Thermo Scientific Model-2314 Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography Film DENVILLE SCIENTIFIC INC.  E3018 (1001365) Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate  Thermo Scientific 32106 Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processor KONICA MINOLTA SRX-101A Western blot supplies
Name of Antibody
PSD-95 Cell Signaling #2507 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
Synaptophysin Cell Signaling #4329 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-Tubulin Santacruz SC-5286 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2B Neuromab 75-097 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2 Sigma-aldrich Sab 4501295 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEP Santacruz SC-23892 Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 715-035-150 Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 711-035-152 Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

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