Summary
Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.
Abstract
Electroconvulsive 발작 (ECS)는 electroconvulsive 치료, 심한 우울증에 대 한 가장 효과적인 치료의 실험 동물 모델. ECS 낮은 사망률과 신경 죽음으로 일반화 된 토 닉 clonic 발작을 유도 하 고 화면 항 간 질 약에 널리 사용 되는 모델 이다. 여기, 우리는 ECS 유도 방법을 설명 간단한 55-mA 전류 0.5에 대 한 전달 되는에서 남성 s 쥐 귀 클립 전극을 통해 무게에 200-250 g. 이러한 양자 자극 생산 단계 4-5 clonic 발작 지속 약 10 s. 급성 또는 만성 ECS의 정지 후 대부분 쥐 행동 구별 되도록 복구 "발작" 쥐 사기. ECS는 세계적으로 두뇌 활동을 끌어올리고, 때문에 그것 또한 활동 종속 변경 시 냅 스 단백질 및 여러 방법을 사용 하 여 시 냅 스 강도에 미치는 영향의 검토에 사용 되었습니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 postsynaptic 밀도 (PSD)의 subcellular 분류 전문된이 시 냅 스 구조에서 시 냅 스 단백질의 풍부의 양적 결정 수 있습니다. 설치류 두뇌의 큰 금액을 필요로 하는 이전 분류 방법, 달리 여기 자당 기온 변화도 원심 분리 하지 않고 하나의 쥐의 된에서 PSD를 분리 하는 소규모 분류 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 고립 된 PSD 분수 postsynaptic 막 단백질, PSD95, GluA2, GluN2B, 등을 포함 보여줍니다. 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin는 성공적인 PSD 격리를 보여주는 PSD 분수에서 제외 했다. 또한, 만성 ECS GluN2B 식 우리의 소규모 PSD 분류 방법, 약리, 유전 또는 기계적 치료 후 단일 쥐에서 hippocampal PSD 단백질에 변화를 감지에 적용할 수 있습니다 나타내는 PSD에 감소 .
Introduction
Electroconvulsive 치료 심한 약물 내성 우울증, 양극성 우울증, 파 킨 슨 병의 질병, 그리고 정신 분열 증1,2를 포함 하 여 주요 우울증 장애 환자 치료에 사용 되었습니다. 이 치료에서 발작 epicranial 전극1,2,3를 통해 마 취 환자의 머리에 전달 하는 전기 자극에 의해 생성 됩니다. ECS의 반복적인 관리 임상 약물 내성 우울증 장애1,2,3에 도움이 되었습니다. 그러나, 인 간에 있는 항우울제 효과의 장기 효 험 기본 정확한 메커니즘은 애매 남아 있다. ECS는 electroconvulsive 치료의 동물 모델 이며 치료 메커니즘을 조사에 널리 사용 됩니다. 설치류, 급성 ECS와 ECS 치료 만성는 된 성체를 촉진 하 고 신경 네트워크4,5, 재구성 인지 유연성에서 향상에 기여할 것입니다. 또한, ECS에 의해 두뇌 활동의 글로벌 상승 같은 두뇌 파생 neurotropic 요소6, 그리고 여러 단백질, N-메 틸-D-aspartate metabotropic 글루타민 산 염 수용 체 17 등 성적 증명서의 풍부 변경 (NMDA) 형식 글루타민 산 염 수용 체 소 단위7. 이러한 변화는 시 냅 스 번호, 구조, 및 해 마7,,89에서 힘의 장기 수정 중재에서 포함 된다.
ECS 모델에 전기 자극 일반화 된 토 닉 clonic 발작10,11연상 stereotaxically 이식된 전극, 막 전극, 또는 귀 전극을 통해 설치류에 전달 됩니다. 전극의 stereotaxic 주입 뇌 수술을 포함 하 고 상해를 최소화 하기 위해 실험의 수술 능력을 개선 하기 위해 상당한 시간이 필요 합니다. 적은 침략 적인 각 막 전극 각 막 찰과상과 건조를 일으킬 수 있고 마 취 필요. 귀 클립 전극의 사용 때문에 수술이 나 마 취 없이 설치류에 사용 될 수 있는 최소한의 부상의 입을 이러한 제한을 무시 합니다. 사실, 우리 귀 클립 전극을 통해 현재 깨어 배달된 쥐 안정적으로 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 유도 및 변경 된10그들의 시 냅 스 단백질 발견.
ECS 유도 풍요의 설치류의 특정 두뇌 지구에서 시 냅 스 단백질을 검사, 그것은 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 가장 적합 한 실험 방법을 선택 하는 것이 중요. 두뇌의 subcellular 분별 녹는 cytosolic 단백질;의 원유 격리에 대 한 허용 막 단백질; 세포 기관이 경계 단백질; 그리고 PSD12,,1314같은 특별 한 subcellular 구조에 단백질. PSD는 신경에 시 냅 스 단백질은 매우 집중에서 그리고 postsynaptic 막12,,1315근처에 있는 조밀 하 고 잘 조직 된 subcellular 도메인. PSD의 풍요로 움과 postsynaptic 글루타민 산 염 수용 체, 비 계 단백질, 및 PSD12 신호 변환 단백질의 기능에 동적 변경 이후는 PSD에 농축 하는 시 냅 스 단백질의 연구에 대 한 유용 , 15 , 16 , 17 시 냅 스가 소성 및 여러 가지 신경 장애17,18에서 관찰 하는 synaptopathy와 상관 있다. PSD를 정화 하는 데 사용 하는 이전 subcellular 분류 방법 자당 기온 변화도14, 의 차등 원심 분리에 의해 두뇌의 원유 막 분수에서 세제 불용 성 분수의 참여 19. 많은 양의 설치류 두뇌14,19요구 한다이 전통적인 방법으로 주요 도전 이다. 격리 치료 당 PSD 분수를 10-20 설치류의 준비 광범위 한 비용 및 시간 투자를 요구 하 고 많은 치료 하는 경우에 실제적으로 가능 하지 않습니다.
이 문제를 극복 하기 위해 우리가 직접 PSD 분수 없이 자당 기온 변화도 원심 분리20,21, 격리 하 고 단일 쥐의 된에서 PSD 격리를 적용할 수 있도록 개정 하는 간단한 방법 적응 두뇌입니다. 우리의 소규모 PSD 분류 방법에 대 한 수익률 2 된, immunoprecipitation 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 포함 하 여 생 화 확 적인 분석 실험에서 사용 하기 위해 충분 한에서 PSD 단백질의 30-50 µ g. 부 럽 (PSD-95) postsynaptic 밀도 단백질 95의 농축 및 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin 배제를 공개 하 여 PSD를 고립 시키기를 위한 우리의 방법의 성공을 보여 줍니다. 우리의 ECS 유도 및 소규모 PSD 분류 방법 다른 설치류 뇌 영역에 쉽게 적응할 수 있으며 PSD 단백질의 표현에 ECS의 효과 평가 하는 비교적 간단 하 고 안정적인 방법을 제공.
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Protocol
동물 주제를 포함 하 여 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 어바나-샴페인 일리노이의 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. 쥐 식민지를 유지 하
- Sprague Dawley 쥐 ( 재료의 표참조)를 번 식 하 고 12-h 빛 어두운 주기와 음식과 물에 대 한 ad libitum 액세스 표준 조건에서 그들을 유지 하는 것.
- 출생 후 하루 (P) 28에 쥐 새끼를 유아와 2-4 남성 또는 여성 littermates의 그룹에서 그들을 집.
- 확인을 위해 비 독성 영구 블랙 마커 남성 쥐의 꼬리를 표시 합니다.
- 주 당 3 번 남성 쥐 무게와 그들의 bodyweights를 기록.
2입니다. ECS 시스템의 준비
- 오전 7 시 30 분, 동물 준비 실에서 벤치를 소독 하 고 벤치에는 ECS 컴퓨터 (펄스 발생기)를 배치 합니다.
- 장소는 개별 남성 쥐 새 장에 깨끗 하 고 빈 뚜껑 200-250 g를 무게. 이 모든 남성 쥐 ECS 유도 치료를 반복 합니다. 30 분 동안 길 들 쥐를 보자.
- 쥐가 그들의 감 금 소에서 habituating는, ECS 유도 대 한 펄스 발생기 100 펄스/s, 0.5 ms의 펄스 폭, 0.5의 충격 기간의 주파수로 설정 s, 및 55의 전류 (그림 1A).
- "리셋" 버튼을 누르면 하 고 "준비" 버튼이 켜져 확인 하 여 펄스 발생기를 준비 합니다. 귀 클립 펄스 발생기에 연결 되지 않습니다 다음 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누릅니다 있는지 확인 합니다.
참고:이 시점에서, 펄스 발생기는 ECS 유도 대 한 준비. - 펄스 발생기에 귀 클립을 연결 합니다.
3입니다. 급성 ECS의 유도
: 참고 그림 1B, 상단 패널.
- 멸 균 식 염 수와 귀 클립 젖은 고 그들은 포화 상태를 확인 합니다.
- 식 염 수에 젖은 거 즈에서 그들을 포장 하 여 멸 균 식 염 수와 쥐의 귀를 젖은. 일단 그들이 젖은 거 즈를 제거 합니다.
- 귀, 주요 연골 밴드 넘어 위치 당 하나의 클립을 연결 합니다.
- 그는 진정한 루프 설립; ECS 시스템에서 확인 그렇지 않으면, 오류 메시지 또는 "1"의 컴퓨터에 표시 됩니다.
- 두께, 비-금속 장갑 착용. 부드럽게 gloved 손에서 쥐를 잡고, 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누르고 천천히 발작을 관찰 하기 위해 쥐에 그립을 풀어. "발작" 가짜 (NS) 제어, 쥐를 동일 하 게 처리 하지만 현재 제공 하지 않습니다.
- Clonus 시작으로 귀 클립을 분리 하 고 (1 단계), "머리를 끄 덕" (2 단계), "forelimb clonus" "입과 얼굴의 움직임"를 포함 하는 개정된 라신의 규모22 에 따라 발작 동작 기록 (3 단계), "양육 forelimb clonus와" (4 단계), 그리고 "양육과 forelimb clonus 떨어지고" (5 단계). 나포 약 10 마지막으로 해야 s; 타이머를 사용 하 여 발작 기간을 기록 합니다.
- 나포 종료, 다음 홈 그것의 감 금에 쥐를 반환 합니다. 쥐의 발작에서 회복 되도록 또 다른 5 분 동안 쥐를 모니터링 합니다. 장에 홀로 지 내게 그것을 유지 하 고 회복 실에 감 금 소를 반환.
- 다음 쥐에 ECS 유도 반복 합니다.
- 나머지 하루 아침에 한 번 이상 있고 그들은 실험에 대 한 안락사는 때까지 다음 날 오후에 한번 걸쳐 쥐를 모니터링 합니다.
참고: ECS 유도 메서드는 부수적 부작용으로, 주의 요하는 임상 증상을 발생할 수 있습니다. 예를 들어, ECS 유도 프로토콜 수 쥐를 15 s 및 원인 불필요 한 고통 보다 더 오래 지속 되는 발작을 유도 하 고 있다. 이 경우에, 다이아 제 팜 (10 mg/kg, i.p.) 또는 pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.)를 사용 하 여 발작을 종료 합니다. 쥐 호흡 곤란 이나 심한 행동 이상 발작 정지 다음 개발, 경우 잘린 뒤 이산화탄소 흡입에 의해 그들을 안락사.
4입니다. 만성 ECS의 유도
주: 그림 1B, 하단 패널을 참조 하십시오.
- 7 일 연속, 위의 1-3 단계에 설명 된 대로 아침에 같은 시간에 하루 한 ECS를 유도.
- 모니터는 쥐 두 번 하루에 그들은 그들의 가정에 반환 된 후 연습장.
5. 균질 및 쥐 된의 분류
참고: 그림 2를 참조 하십시오.
- 자당 320 m m, 5mm 나트륨 파이 인산, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 포함 하는 신선한 균질 버퍼 (솔루션) 준비 200 nM okadaic 산 및 효소 억제제. 필터-필터를 사용 하 여 진공 여과 0.22 μ m 기 공 크기와 버퍼를 소독 하 고 얼음에 그것을 배치.
- 주어진된 시간에 가리킨 다음 ECS 급성 또는 만성 ECS (그림 1), 5-10 분, 잘린은 단두대를 사용 하 여 다음 공동2 흡입에 의해 쥐를 안락사.
- 두뇌를 제거 하 고 앞에서 설명한23,24얼음에 배치 하는 금속 격판덮개에 된 해 부.
- 30 m m 조직 문화에 한 쥐에서 장소 2 된 접시 하 고가 위를 사용 하 여 작은 조각으로 그들을 말하다.
- 1 mL 피 펫을 사용 하 여 수동 유리 균질 화기를 다진된 된 전송 하 고 차가운 균질 버퍼 (솔루션, 단계 5.1)의 1 mL를 추가 합니다. 유리 균질 화기에 둥근 유 봉을 삽입 합니다. 얼음에 유리 균질 화기를 실행 하는 동안 부드럽게 그리고 꾸준히 뇌졸중 위아래로 10-15 시간 1 분, 대 한 유 봉에 hippocampal 조직의 작은 조각을 사라질 때까지.
- 1 mL 피 펫을 사용 하 여 1.7 mL microcentrifuge 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 불용 성 조직 및 핵 (P1 분수)를 포함 하는 펠 릿에서 homogenate postnuclear 상쾌한 (S1 분수)를 구분을 4 ° C에서 10 분 동안 800 x g에서 원심. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 두 개의 별도, 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 50 µ L 및 S1 분수의 950 µ L를 전송 및 얼음이 튜브를 저장. 얼음에 P1 분수 펠 릿을 저장 합니다.
- S1 분수 (950 µ L) 13, 800 x g와 상쾌한 (S2 분수), 수용 성 cytosolic 단백질 농축 분리 하 4 ° C에서 10 분 원심 하 고 펠 릿 (P2 분수), 막 바인딩 단백질, synaptosomal 단백질을 포함 한 농축. S2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 물 1 mL 피 펫을 사용 하 여 정화의 498 µ L에서 펠 릿 (P2 분수)를 resuspend. 추가 1 M HEPES (pH 7.4)의 2 µ L 4 mM HEPES (pH 7.4)의 최종 농도 달성 하기 위해 20 µ L 피 펫을 사용 하 여. Resuspended P2 분수 얼음에 30 분이 게에 대 한 동요와 4 ° C에서 품 어.
- BCA 분석 결과 사용 하 여 S1, S2, P2 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C까지 사용, 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 하거나 PSD를 분리 하는 P2 분수를 처리 합니다.
6. 원유 막 단백질 (P2) 분수에서 PSD의 격리
- Lysed 상쾌한 (LS2 분수)와 lysed 펠 릿 (LP1 분수)를 분리 하는 P2 분수 (500 µ L) 25000 x g와 4 ° C에서 20 분을 원심. LS2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.
- 250 µ L 1 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 1에 1% 세제의 혼합 50 mM HEPES (pH 7.4)의 250 µ L에서 LP1 펠 릿을 resuspend. 15 분에 대 한 부드러운 교 반으로 4 ° C에서 품 어.
- 25000 x g와 펠 릿 (PSD 분수)에서 상쾌한 (비 PSD 분수)를 분리 하 4 ° C에서 3 h resuspended LP1 펠 렛 원심 상쾌한 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 제거 하 고 50 mm HEPES (pH 7.4) 100 µ L에서 PSD 펠 릿 resuspend 200 µ L 피 펫을 사용 하 여.
- LS2, 비-PSD를, 그리고 BCA 분석 결과 사용 하 여 PSD 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C에서 사용까지 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 합니다.
참고: 모든 솔루션 (즉, 해결책, HEPES 버퍼, 그리고 PBS 버퍼) 5-6 단계에서 사용 되는 정화 물 이온 및 유기 오염 물질과 입자의 무료 여야 한다.
7. 서 부 럽
- 각 단백질 분수 얼음에 녹여 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브 (S2, P2, 그리고 1 mg/mL의 PSD) 각 분수의 12 µ L를 전송 합니다.
- 5 x SDS 샘플 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 물 욕조에 30 분 동안 75 ° C에 품 어. 차가운 실내 온도 (RT) 아래로 샘플.
- 4-20% 그라데이션 15 잘 빗 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 젤 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 우물에 단백질 샘플의 10 µ L를 로드 합니다. SDS 페이지 장치에 버퍼를 실행에 80-100 V에서 젤을 실행 (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 0.1 %SDS; pH 8.3).
참고: 각 젤 NS 쥐와 급성 또는 만성 ECS 다음 다른 시간 지점에서 ECS 쥐에서 단백질 견본을 포함 해야 합니다. - 전송 SDS 페이지에서 단백질 젤 25-30 V에서 전송 장치에 비닐 difluoride (PVDF) 막 (60 mA) 전송 버퍼에 9-12 h (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 20% 메탄올; pH 8.3).
- 전송 장치에서 PVDF 멤브레인을 제거 하 고 Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서 실시간 다중 목적 회전에 5 분에서 그것을 씻어합니다
- 5% 우유에 막 차단 및 0.1% 트윈-20 1 헤에 대 한 TBS에서 품 어 그것 세척 버퍼에 1 차 항 체 (표 1)에서 (1% 우유와 0.1 %TBS 트윈-20) 4 ° C에서 다중 목적 회전에 하룻밤 (희석에 대 한 재료의 표 참조).
- 워시 버퍼에서 4 시간 10 분 대 한 멤브레인을 세척 하 고 다음 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 그것을 품 어-실시간에 다중 목적 회전에 1 시간에 대 한 버퍼를 세척에 2 차 항 체를 활용
- 5 분 4 시간 10 분 대 한 막 워시 버퍼 그리고 TBS로 세척.
- 1 분에 대 한 향상 된 chemifluorescence 기판으로 막 품 어 하 고 x 선 필름에 노출. 필름 프로세서와 함께 노출된 영화를 개발할 수 있습니다.
8입니다. 서 부도 말의 정량화
- 검색 양과 TIFF 파일로 오 컴퓨터에이 파일을 저장 합니다.
- "파일," "이미지 열기," 오른쪽 화살표 "그레이 스케일" 회색조 이미지로 ImageJ 프로그램에서 서쪽 오 점 파일을 엽니다
- ImageJ 도구 모음에서 사각형 선택 도구를 선택 하 고 관심사의 단백질의 하나의 서양 오 점 밴드를 포함 하는 사각형을 그립니다.
- "분석" 아래 "측정을" 지역 및 선택한 밴드의 평균 밀도를 했다.
- 그것의 크기와 모양을 변경 하지 않고 배경 영역에 사각형을 이동 합니다. 및 배경의 밀도 8.4 단계를 반복 합니다.
- 관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도 주는 서쪽 오 점 밴드의 배경 밴드의 밀도 값을 뺍니다.
- 관심의 모든 서쪽 오 점 밴드 8.2 8.6 단계를 반복 합니다.
- Α-Tubulin;와 같은 내부 관리 유전자 제품의 배경 빼고 밴드 밀도 의해 관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도를 나눕니다 이 단계는 관심사의 단백질의 정규화 된 값을 생성합니다.
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Representative Results
상세한 절차를 사용 하 여 여기에 제시 된, 전기 충격 (55 mA, 0.5에 대 한 100 펄스/s s) 쥐 (그림 1A-B)에서 4-5 토 닉 clonic 발작 귀 클립 전극 유도 반복 되지 않는 단계를 통해 전달. 쥐의 총 8 급성 ECS 유도 받은 고 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 발작 지속 약 10 s, 그리고 모든 쥐 발작 정지의 1-2 분 이내 복구. 가짜 "아니 발작" 쥐 전기 충격을 받지 않았다 고 따라서 발작을 표시 하지 않았다. 4 가짜 쥐의 총 사용 되었다. 만성 ECS 유도, 쥐 7 일 연속 하루 전기 충격을 받은 고 각 전기 충격 (그림 1A-B)를 따라 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 쥐의 총 8 받은 만성 ECS 유도 그리고 4 가짜 쥐의 총 "발작" 쥐로 사용 되었다. 만성 ECS를 받은 대부분의 쥐는 행동 구별할 수 없었다에서 가짜 "발작" 쥐, 몇 가지 발전된 몸 떨림 및 7일 전기 충격에 의해 탐구 활동을 감소.
ECS 유도 글로벌 상승 활동 변경 단백질 표정에는 된 경우 검사, 쥐 했다 희생 3 h 24 h에서 급성 ECS 후와 24 h와 96 h에 만성 ECS 치료 (그림 1B)에서 최종 ECS 후. 각 쥐에서 두 된 해 부 급속 하 게 되었고 우리의 최적화 된 소규모 분별 프로토콜 (그림 2)에 복종. 두 된 불용 성 조직 및 핵 (S1 분수)의 초기 homogenate는 다시 10 분 조 막 펠 릿 포함에서 녹는 세포질 단백질 (S2 분수)를 포함 하는 상쾌한 분리 13,800 x g에서 centrifuged synaptosomes (P2 분수) (그림 2). 우리의 서쪽 오 점 세포질 단백질 α-tubulin 감지 된 쥐 (그림 3 및 그림 4), 급성 및 만성 ECS와 치료에서 S2 분수, 하지만 하지 P2 분수에서의 성공적인 분류를 보여주는 조 막 펠 릿에서 cytosolic 수용 성 단백질입니다.
PSD95 막 관련 guanylate 키 니 아 제 (MAGUK) 가족의 일원이 고 PSD12,,1825의 핵심 구성 요소입니다. PSD95와 NMDA 수용 체 소 단위 GluN2B P2 분수, 하지만 하지 S2 분수 (그림 3 및 그림 4)에 독점적으로 발견 했다. 다른 glutamatergic α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용 체 소 단위 GluA2의 강한 표현 된 (그림 3 및 그림 4)에서 S2 분수에 비해 P2 분수에서 검색 되었습니다. postsynaptic 멤브레인 단백질 풍성 하 게 원유 막 P2 분수 펠 릿에 나타내는. 흥미롭게도, 시 냅 스 소포 단백질 synaptophysin 및 완전 한 막 단백질 Striatal 농축 티로신 인산 가수분해 효소 61 (단계61)26 S2 및 P2 분수 (그림 3 및 그림 4)에 동일 하 게 발견 했다. 시 냅 스 소포의 작은 크기를 고려-39 nm27 endosomes의 평균 직경, 원유 막 펠 릿 (P2 분수)를 분리 하는 원심 않았을 수도 모든 시 냅 스 소포 및 endosomes 작은 충분. 이러한 결과 함께 막-바인딩 단백질 및 막 횡단 단백질 시 냅 스 소포와 가능성이 endosomes 원유 막 P2 분수에 연결 되지 않은 우리의 원유 분별 프로토콜 풍요롭게 수 있습니다 나타냅니다.
검사 활동의 글로벌 상승 ECS 유도 된에 postsynaptic 단백질의 표현을 변경 하는 경우, 원유 막 P2 분수 얼음 처럼 차가운 물에 lysed, HEPES 버퍼에서 resuspended 이었고 25000 x g을 20 분 동안에 centrifuged는 lysed 펠 릿 (LP1) (그림 2). LP1 펠 릿 resuspended HEPES 버퍼 1% 트라이 톤 X-100 세제를 포함 하 고 25000 x g PSD 펠 릿 (그림 2)를 3 h 이상에서 centrifuged. PSD 분수의 후속 서쪽 오 점 발견 PSD95, GluN2B, 및 GluA2 (그림 3 및 그림 4), postsynaptic 단백질17,,2528알려져 있습니다. 그러나, PSD 분수 α-tubulin 부족 하 고, 중요 한 것은, 연 접 마커 synaptophysin (그림 3 및 그림 4). 단계61, GluN2B 및 GluA2 dephosphorylates는 그들의 부정적인 레 귤 레이 터29,,3031역할 PSD 분수 (그림 3 및 그림 4)에서 찾을 수 없습니다. 최근 보고서와 일치 PSD26에서 풍성 하 게 하는 PSD95에 의해 중재 시연 단계61의 시 냅 스 제외. 이러한 결과 우리의 소규모 분류 방법을 성공적으로 원유 막 P2 분수에서 PSD 단백질 분리를 나타냅니다.
서쪽에 게 더 럽 히기의 정량화는 밝혀 GluN2B 식 P2 분수에 변형 되었다 하지만 급성 ECS 후 3 h 24 h에서 PSD 분수에서 증가 추세를 표시 (n = 4) (그림 3B). GluA2 식 3 h와 급성 ECS (그림 3C) 다음 24 시간에서 P2 및 PSD 분수에서 변경 되지 않았습니다. 24 h와 만성 ECS 후 96 h, GluN2B 식 P2 분수에 감소 추세를 표시 하 고 PSD 분수에 크게 감소 했다 (24 h: p < 0.05, n = 4; 48 h: p < 0.01, n = 4) (그림 4B). 대조적으로, 만성 ECS GluA2 식 P2 및 PSD 분수에 미치지 않았다 (n = 4) (그림 4C).
그림 1 : ECS 급성 및 만성 ECS의 유도 대 한 스키마. (A) A 쥐 귀 클립 전극과 전기 충격을 통해 펄스 발생기에 연결 되었다 (55 mA, 0.5에 대 한 100 펄스/s s) 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 유도에 적용 했다. (B) 급성 ECS는 전기 충격에 의해 유도 했다. 만성 ECS는 7 일 연속 하루 전기 충격에 의해 elicited. 표시 시간 포인트 ECS 급성 또는 만성 ECS 유도 된의 해 부 전에 대 한 마지막 ECS의 유도 따라 기간을 나타냅니다. "발작" 가짜 (NS) 제어 쥐 동일 하 게 처리 했다 하지만 전기 충격을 받지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : S2, P2, 및 단일 쥐의 된에서 PSD 분수 분리 Subcellular 분별의 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 시 냅 스 단백질 시험 Hippocampal S2, P2, 그리고 그 받은 NS 또는 급성 ECS 쥐에서 PSD 분수에. 가짜 "아니 발작" (NS) 쥐와 쥐의 된에서 PSD 분수 받은 급성 ECS와 (A) 대표적인 서양 오 점 S2, P2, NMDA 수용 체 소 단위 GluN2B, AMPA 수용 체 GluA2, 및 단계61 의 단백질 표정 표시. 세포질 수용 성 단백질의 α-tubulin S2 분수에 농축입니다. Synaptophysin 연 접 소포 단백질 이며 PSD 분수에 P2 분수, 조 막만을 농축입니다. PSD-95는 P2 및 PSD 분수에 농축입니다. (B-C) GluN2B의 정량화 (B) 및 GluA2 (C) 3와 24 후 급성 ECS h p 2와 PSD 분수에서 (n = 시간 포인트 당 4 쥐). P2 분수에서 GluN2B과 GluA2 식 S2 분수에서 α-Tubulin로 정규화 되었다. PSD 분수에서 GluN2B과 GluA2 식 PSD 분수에 PSD-95 정규화 되었다. 데이터는 % ± SEM.로 표시 됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 시 냅 스 단백질 시험 Hippocampal S2, P2, 그리고 그 받은 NS 또는 만성 ECS 쥐에서 PSD 분수에. Α-tubulin;의 대표 서 지우고 synaptophysin; 단계61; 그리고 postsynaptic 단백질, PSD95, GluN2B, 및 GluA2를 포함 하 여 가짜 "아니 발작" (NS) 쥐와 쥐의 된에서 S2, P2, 그리고 PSD 분수에서 만성 ECS를 받았다. 세포질 수용 성 단백질의 α-tubulin S2 분수에 농축입니다. Synaptophysin 연 접 소포 단백질 이며 PSD 분수에 P2 분수, 조 막만을 농축입니다. PSD-95는 P2 및 PSD 분수에 농축입니다. (B-C) GluN2B의 정량화 (B) 및 GluA2 (C) 24 및 96 후 만성 ECS h p 2와 PSD 분수에서 (n = 시간 포인트 당 4 쥐). P2 분수에서 GluN2B과 GluA2 식 S2 분수에서 α-Tubulin에 정규화 되었습니다. PSD 분수에서 GluN2B과 GluA2 식 PSD 분수에 PSD-95 정규화 되었다. 데이터는 % ± SEM;로 표시 됩니다. * p < 0.05, * * p < 0.01 제어 (ANOVA와 Tukey의 게시물-특별 시험)와 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 분수 | 단백질 분수 | 단백질 마커 |
| P1 | 핵 | Histon H1 |
| S1 | Cytosol/membrances | tubulin (골격) 및 GAPDH (cytosol) |
| P2 | 조 synaptosomes | AMPA와 NMDA 수용 체 소 단위 |
| S2 | Cytosol/라이트 membrances | GAPDH (cytosol) 및 LAMP1 (리소좀) |
| Synaptosomal 막 | Synaptosome/미토 콘 드리 아 | AMPA와 NMDAR 수용 체 소 단위, Synaptophysin (연 접 마커) |
| PSD | PSD | AMPA와 NMDA 수용 체 소 단위, PSD95, PICK1, CaMKII |
표 1: 목록 단백질 마커 및 항 체 Subcellular 분수를 구별 하는 것입니다.
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Discussion
여기, ECS 유도 하는 방법을 쥐에 그들의 된 신경 활동의 글로벌 자극 elicits 설명 합니다. ECS는 electroconvulsive 치료, 임상 인간1,2,3약물 내 화 우울증 질환을 치료 하는 데 사용 되는 동물 모델입니다. 심한 우울증 치료 electroconvulsive 치료의 사용에도 불구 하 고 정확한 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. ECS 경우 새로운 조사를 광범위 하 게 사용 되었습니다 때문에 ECS 설치류에 안티 depressant 같은 행동을 유도 하 고 자극 hippocampal 성체4,32, 성인 선천적인 신경이 뇌의 해 마에 안티-depressant 동작5,32에 기여 한다.
ECS stereotaxically 이식된 전극, 막 전극, 또는 귀 클립 전극33,34현재 배달 시 설치류에 심한에 약한 일반된 토 닉 clonic 발작을 유도합니다. 환자에서 뇌 파 기록 보다 일방적인 자극35,36을 양자 전기 자극 하면 더 유명 하 고 더 이상 일반화 된 발작 계시 했다. 우리의 ECS 유도 방법에 토 닉 clonic 발작 양측 자극36에의해 갖는 인간에서 발작을 흉내 낸 두 귀에 연결 된 비 침범 성 귀 클립 전극을 통해 현재 배달에 의해 유발 됩니다. 우리가 진정 또는 무감각 적용 되는 쥐에서 ECS의 효능을 확인 하지 않은, 그것은 가능한 쥐를 마 취 약을 주는 될 수 있는 전기 자극에 의해 유도 된 발작의 정도 줄일 수는 때문에 사실 마 취 상태가 순수 두뇌 네트워크에 향상 된 금지 및 약화 흥분 성의 톤 연관입니다. 또한, ECS 유도 방법에 중요 한 단계 4-5 단계를 유도 전류 강도를 실험적으로 토 닉-clonic 발작 나이, 무게, 및 설치류의 종에 따라 일반화입니다. 우리의 ECS 유도 방법 4-5 단계 발작을 유도 하는 깨어 있는 남성 Sprague-Dawley 쥐 200-250 g를 무게에서 몇 초 이내에 대 한 최적화 되었습니다. ECS 유도 마 취 상태에서 쥐 사용 하는 경우 강도, 기간, 및 현재 제공의 주파수 단계 4 ~ 5에서에서 배열 하는 발작의 성공적인 유도 대 한 수정 해야 합니다.
ECS 신경 과다 자극 하 고 매우 낮은 사망률33, chemoconvulsants, 등 pilocarpine kainite, 상태 epilepticus 유도 고 있는 달리 일시적 급성 발작의 원인이의 이점을 제공 합니다. 자발적인 재발 성 발작 및 심각한 조직학 변경37,38의 만성 표현. ECS은 화면 항 간 질 약33,34을 정기적으로 이용 되어, 비록 급성 ECS 만성 ECS 만성 간 질 발생을 초래 하지 않습니다 및 따라서 epileptogenesis를 공부 하는 동물 모델에서 사용할 수 없습니다. 대신, ECS는 널리 고용 되어 있는 두뇌 활동의 광범위 한 상승 식 또는 시 냅 스에 지속적인 변화에 공헌 하는 시 냅 스 단백질에 vivo에서,의 posttranslational 수정 변경 범위를 검사 하 강도 및 구조 (그림 3 및 그림 4)10,40. 이 연구에서 우리만 익숙해 남성 쥐 ECS 후 PSD 단백질의 양에 여성 쥐의 사이클 단계는 발 정기의 예기치 않은 효과 제외. 그러나, 그것은 정면 피 질과 해 마39, 발 정기 주기를 제어 하는 호르몬 변화는 기저 미치지 수 있습니다 암시의 PSD 지역에서 PSD-95와 SAP102를 포함 하 여 비 계 단백질에 성별 차이가 있다 관찰 되었다 PSD 단백질의 양입니다.
여러 메서드는 ECS 성체, synaptogenesis, 및 시 냅 스가 소성5,6,7,,89, 에 변화를 유도 하는 정도 검사 하 고용 되었습니다. 11 , 40. electrophysiological 녹음의 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSC)는 널리 흥분 성의 glutamatergic의 시 냅 스 강도 변화 synapses21감지 하는 데 사용 됩니다. 예를 들어 소형 EPSC 녹음 마우스 급성 ECS41다음의 레이어 II-III의 피라미드 대뇌 피 질의 뉴런에서 흥분 성의 시 냅 스 강도 homeostatic 상세화 밝혀졌다. 그러나, ECS 유도 시 냅 스가 소성에 공헌 하는 시 냅 스 단백질의 식별은 도전 electrophysiological 녹음 유전자 녹아웃와 결합 해야 하기 때문에 또는 특정 후보 시 냅 스 단백질의 때 려 눕. 글루타민 산 염 수용 체 postsynaptic 멤브레인 및 PSD에서 풍성 하 게 하는 시 냅 스 단백질의 수준에 변화 조절 강도와 흥분 성의 시 냅 스 전송17,,1825의 효능. Immunohistochemistry 검사 시 냅 스 단백질의 표현에 ECS 유도 된 변화를 사용할 수 있습니다, 하지만이 기술은 한 번에만 1-2 후보 시 냅 스 단백질을 확인할 수 있습니다 하며 구체적으로 그들을 인식 하는 잘 검증 된 항 체 일반적인 발생 하지 않고 얼룩.
서쪽에 게 더 럽 히기와 함께에서 뇌 조직의 subcellular 분별 전기 생리학 이상과 ECS에 의해 변경 되는 시 냅 스 단백질 식별 immunohistochemistry 장점이 있습니다. 뇌 조직의 subcellular 분류 방법은 신속 하 고 원유 생화학 녹는 cytosolic 단백질 (S2 분수)에서 원유 막 (P2 분수), ER 및 Golgi 막, 막 바인딩된 세포, 원형질 막를 포함 하 여 분리 하 고 시 냅 스 터미널 막 형태 synaptosomes42,,4344봉인. PSD 분수 더 일 수 있다 시 냅 스 단백질42,,4344풍부 하 P2 분수에서 격리. PSD 분수의 편견된 proteomic 분석 ECS에 의해 변경 되는 해당 수준의 모든 PSD 단백질을 식별할 수 있는. 서 부 럽 PSD 단백질, 일반적인 밴드에서 쉽게 확인 될 수 있는의 식을 변화 검사 신속 하 게 수행할 수 있습니다.
뇌 분별의 이전 방법 설치류 뇌 조직42,43,44만드는이 기술을 사용 하기 위해 도전 검사 때 용 해 또는 개인에서 막 단백질의 큰 금액을 필요 설치류 두뇌 또는 단일 뇌에서 특정 한 두뇌 지역입니다. 양적 비교는 프로테옴 한 뇌 영역에서 다른 및 제어 동물에서 유전자 변형 동물 또는 동물을 특정 치료를 겪고 있다 증가 수요가 있다. 따라서, 우리 개정 하 고 분리 한 쥐의 두 된에서 원유 가용성과 막 분수 전통적인 뇌 분류 방법 최적화. 우리의 소규모 원유 분별 프로토콜 성공적으로 고립 된 원유 P2 막 분수 cytosolic S2 녹는 분수에서 막 도약 PSD95에서 검색 되었습니다 반면 세포질 단백질 α-tubulin P2 분수에의 부족에 의해 표시 된 대로 P2만 하지 S2 분수 (그림 3A 와A 그림 4). 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 우리는 양적 표시 급성 ECS 크게 증가 단계61 식 및 그것의 기판, GluN2B와는 extracellular 신호 통제 키 1/2에서 원유의 티로신 인 산화를 감소 48 h 급성 ECS10다음에 쥐 된의 막 P2 분수.
예기치 않게, S2 분수 포함 된 synaptophysin; 단계61; 그리고, 훨씬 낮은 정도로, GluA2 (A 그림 3및 그림 4A). 단계61 는 당화 완전 한 막 단백질26 바인딩과 그물 (ER) 및 PSD45와 관련 된입니다. 원유 막 펠 릿 (P2 분수)를 분리 하는 원심 않았을 수도 작은 공의 synaptosomes, endosomes 포함 된 모든 시 냅 스 소포에 충분 한을 포함 하는 GluA2 및 단계61리소좀이 가능 하다. 그럼에도 불구 하 고, GluN2B, GluA2, 및 PSD95의 농축을 취소 및 α-tubulin P2 분수에서의 부족 우리의 분별 프로토콜 막-바인딩 단백질 및 시 냅 스 소포와 연결 되지 않은 막 횡단 단백질 풍부 수와 조 막 P2 분수에서 endosomes입니다.
조 막 P2 분수 포함 synaptosomes, P2 분수에서 시 냅 스 단백질의 시험 활동 종속 변경의 한 가지 한계는 그들의 변경의 정확한 위치를 확인할 수 없습니다. PSD에서 풍성 하 게 하는 시 냅 스 단백질 결정 될 경우, PSD을 더 생 화 확 적인 분류를 사용할 수 있습니다. PSD 분별의 이전 방법을 사용 하려면 많은 양의 설치류 뇌 조직 (즉, 10-20 설치류 두뇌) 및 자당 기온 변화도42,,4344. 이 전통적인 방법에서 단일 쥐의 두 된 PSD 분수의 충분 한 금액을 분리 하다, 때문에 우리가 적응 자당 그라데이션20,21 없이 PSD 분수를 직접 분리 하는 간단한 방법 . 이 방법에 대 한 수익률 부 럽을 포함 한 생 화 확 적인 분석 실험에 대 한 충분 한 PSD 단백질의 30-50 µ g. 우리의 방법은 풍요롭게 하는 PSD95, GluN2B, 및 GluA2, PSD 분수에 집중으로 알려져 있습니다, 그리고 PSD 분수 만성 ECS 유도 (그림 3 및 그림 4)를 다음에 GluN2B 식의 변화를 감지.
여기, 우리의 양적 서쪽 오 점 분석 3 h와 급성 ECS (그림 3C) 다음 24 시간에서 P2 및 PSD 분수에 GluA2 식에 중요 한 변화가 나타났다. GluN2B 식 P2 분수에 변형 되었다 하지만 급성 ECS (그림 3B), extrasynaptic 대 시 냅 스의 가능한 차등 규제 제안 후 3 h 24 h에서 PSD 분수에서 증가 추세를 표시 GluN2B 포함 된 NMDA 수용 체입니다. 우리는 또한 GluN2B 식 후 만성 ECS P2 분수에서 감소 추세를 표시 하 고 24 및 96 h 만성 ECS (그림 4B) 다음에 PSD 분수에 크게 감소 했다 관찰 했다. 비록 높은 투기 같은 제거 다음 ECS의 반복적인 유도 PSD에서 GluN2B의 extrasynaptic 사이트에 PSD 막 또는 측면 확산에서 직접 국제화를 포함 하 여 여러 메커니즘을 통해 중재 수 있습니다. 우리의 이전 보고서 신경 활동의 장기 기능 향상을 뚜렷이 고려 단계61 식 증가 하 고 우리의 결과 교양된 hippocampal 신경46, P2 분수에 티 르-GluN2B의 인 산화를 감소 그는 P2와 PSD 분수 만성 ECS로 인해 가능성이 있을 수 있습니다 후에 GluN2B 식에서 감소 향상 단계61 식 및 extrasynaptic 막에서 GluN2B의 후속 제거.
요약 하자면, 우리는 우리의 소규모 PSD 분류 방법, ECS 유도 프로토콜 함께에서 해준다 vivo에서 차별화 하는 글루타민 산 염 수용 체의 활동-종속 규칙 postsynaptic 막에 증명 하고있다 총 플라즈마 막 대 extrasynaptic 막을 포함 하 여. 이 프로토콜 흥분 성의 시 냅 스에서 시 냅 스 단백질 어떤에 쉽게 적용할 수 있습니다 그리고 다른 설치류 된 또는 다른 뇌 영역에 대 한 조직 무게에 따라 각 솔루션의 볼륨을 조정 하 여 수정할 수 있습니다. 따라서, 우리의 소규모 PSD 분류는 다양 한 메서드와 검사, 약리, 유전 또는 기계적 처리에 각 동물에 postsynaptic 단백질의 비보에 변화 하는 미래의 어플리케이션을 위해 채택 될 수 있다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자 분류 및 박사 그레이엄 H. Diering 그의 원심 분리기를 사용 하 여 소규모 프로토콜 PSD 분별에 대 한 제공에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 박사 리처드 L. Huganir의 실험실에서 수 박사 에릭 C. 볼 턴 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
