Summary
Электросудорожная захват (ECS) является модель экспериментальных животных электросудорожной терапии для тяжелой депрессии. ECS глобально стимулирует активность в гиппокампе, приводит к synaptogenesis и синаптической пластичности. Здесь мы описываем методы для ECS индукции в крыс и внутриклеточных фракционирование их гиппокампах захват индуцированные изменения в синаптических белков.
Abstract
Электросудорожная захват (ECS) является модель экспериментальных животных электросудорожной терапии, наиболее эффективное лечение для тяжелой депрессии. ECS индуцирует обобщенных тоник клонические припадки с низкой смертности и нейрональных смерти и представляет собой широко используется модель экрана анти-эпилептических наркотиков. Здесь мы описываем метод индукции ECS в которой краткий 55-мА ток поставляется для 0.5 s для мужчин крысы 200-250 г веса через электроды клип ухо. Такие двусторонние стимуляции производства стадии 4-5 клонические судороги, которые длились около 10 s. После прекращения острой или хронической ECS большинство крыс, восстановлены быть поведенчески неотличим от липовые «не взятие» крыс. Потому что ECS глобально повышает активность мозга, он также использовался для изучения деятельности зависимые изменения синаптических белков и их воздействие на синаптической силы, используя несколько методов. В частности субцеллюлярные фракционирование постсинаптических плотности (PSD) в сочетании с Западный blotting позволяет для количественного определения обилие синаптических белков в этой специализированной структуре синаптических. В отличие от предыдущих метод фракционирования, который требует большого количества грызунов мозги опишем здесь мелких фракционирование метод, чтобы изолировать PSD от гиппокампах одной крысы, без сахарозы градиентного центрифугирования. С помощью этого метода, мы показывают, что изолированные фракции PSD содержит белки постсинаптической мембраны, включая PSD95, GluN2B и GluA2. Пресинаптический маркер synaptophysin и растворимых цитоплазматический белок α-тубулина были исключены из PSD дроби, демонстрируя успешное PSD изоляции. Кроме того хронические ECS уменьшилось GluN2B выражение в PSD, указав, что наши мелкие PSD фракционирование метод может применяться для обнаружения изменений в гиппокампа PSD белки от одного крыс после генетических, фармакологическим или механических обработок .
Introduction
Электросудорожной терапии был использован для лечения пациентов с основными депрессивных расстройств, включая лекарственно-тяжелой депрессии, биполярной депрессии, болезни Паркинсона и шизофрении1,2. В этой терапии захват генерируется электрические стимула доставляется глава наркотизированных пациентов через надчерепное электроды1,2,3. Повторяющихся администрация ECS была клинически полезным лекарственно-депрессивные расстройства1,2,3. Однако точный механизм, лежащий в основе долгосрочной эффективности антидепрессивный эффект в организме человека остается недостижимой. ECS животной модели электросудорожной терапии и широко используется расследовать его терапевтический механизм. Грызунов острый ECS и лечение хронических ECS поощрять взрослых нейрогенез в гиппокампах и реорганизовать нейронной сети4,5, который может вносить усовершенствования в когнитивной гибкости. Кроме того глобального повышения активности мозга, ECS изменяет обилие стенограммы, такие, как мозг производные нейротропные фактор6и несколько белков, включая Метаботропные глутамата приемного устройства 17 и N-метил D-аспартат (NMDA) типа глутамата рецептор субблоков7. Эти изменения участвуют в посреднических долгосрочные изменения числа синапсов, структуры и силы в гиппокампе7,8,9.
В моделях ECS электрической стимуляции доставляется грызунов через stereotaxically имплантированных электродов, роговицы электродов или уха электроды вызывают обобщенных тонизирующий клонические судороги10,11. Стереотаксического имплантация электродов предполагает хирургии и требует значительного времени для улучшения экспериментатора хирургических навыков для сведения к минимуму ущерба. Менее инвазивные роговицы электродов может вызвать сухость и роговицы ссадины и требует анестезии. Использование электродов клип ухо обходит эти ограничения, потому что они могут быть использованы на грызунов без хирургического вмешательства или анестезии и вызвать минимальной травмы. Действительно мы обнаружили, что текущий доставлены к просыпаются крыс через электроды клип ухо надежно индуцирует стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги и изменяет синаптических белков в их гиппокампах10.
Для изучения ECS-индуцированных обилием синаптических белков в регионах конкретных мозга грызунов, важно выбрать экспериментальные методы, которые являются наиболее подходящими для их обнаружения и количественного определения. Субцеллюлярные фракционирование головного мозга позволяет для сырой изоляции растворимые белки цитозольной; Мембранные белки; органеллы границы белков; и даже белки в специальных внутриклеточных структур, таких как PSD12,,1314. PSD — густой и хорошо организованной субцеллюлярные домен в нейроны, в которых сконцентрированы на и вблизи постсинаптической мембраны12,13,15синаптических белков. Изоляция PSD является полезным для изучения синаптических белков обогащенного в PSD, поскольку динамические изменения в изобилии и функции рецепторов постсинаптической глутамата, леса белков и белков трансдукции сигнала в PSD12 , 15 , 16 , 17 коррелируют с синаптической пластичности и synaptopathy наблюдается в нескольких неврологических расстройств17,18. Предыдущих субцеллюлярные фракционирование метод, используемый для очистки PSD участие изоляции моющих средств нерастворимые дроби от сырой мембранные часть мозга, дифференциального центрифугирования сахарозы градиенты14, 19. Основная проблема с этим традиционным методом является, что она требует большого количества грызунов мозги14,19. Подготовка 10-20 грызунов изолировать PSD фракция за лечение требует обширных стоимости и времени инвестиций и не является практически осуществимым, если есть много лечения.
Чтобы преодолеть эту проблему, мы адаптировали более простой метод, который непосредственно изолирует PSD фракции, без сахарозы градиентного центрифугирования20,21и внес в него должна применяться к PSD изоляции от гиппокампах одного крыса мозг. Наши мелкие метод фракционирования PSD дает о 30-50 мкг PSD белков из 2 гиппокампах, достаточных для использования в нескольких биохимических анализов, включая иммунопреципитации и Западный blotting. Западный blotting демонстрирует успех нашего метода для изоляции PSD, раскрывая обогащения постсинаптических плотность белка 95 (PSD-95) и исключение Пресинаптический маркер synaptophysin и растворимых цитоплазматический белок α-тубулина. Наши ECS индукции и мелких PSD фракционирование методы легко приспосабливаются в другие регионы грызунов мозга и относительно простой и надежный способ для оценки воздействия ECS на экспрессию белков PSD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, включая животных темы были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом в Университете Иллинойса в Урбана-Шампейн.
1. поддержание колонии крыс
- Порода крысах Sprague-Dawley (см. Таблицу материалы) и сохранять их в стандартных условиях с 12-h свето тени цикла и ad libitum доступ к продовольствию и воде.
- Отучить потомства крыс в день послеродового (P) 28 и их группами по 2-4 мужского или женского пола однопометники.
- Марк хвосты самцов крыс с токсичными постоянного черным маркером для идентификации.
- Вес самцов крыс 3 раза в неделю и записывать их особи.
2. Подготовка машины ECS
- В 7:30 утра продезинфицируйте скамейке в зале животных подготовки и место ECS машина (генератор импульсов) на скамейке.
- Место отдельные мужчина крыса, весом 200-250 г в чистой, пустой клетке с крышкой. Повторите это действие для всех самцов крыс следует относиться с ECS индукции. Пусть крысы приучать за 30 мин.
- В то время как крысы habituating в их клетках, установить генератор импульсов для ECS индукции частоты 100 импульсов в секунду, импульса 0,5 мс, шок, продолжительностью 0,5 s и тока 55 мА (рис. 1А).
- Подготовьте генератор импульсов, нажав кнопку «RESET» и обеспечения того, что горит кнопку «Готово». Убедитесь, что уха клипы не прикреплены к генератор импульсов и затем нажмите кнопку «Шок» на несколько секунд.
Примечание: на данный момент, генератор импульсов готов к индукции ECS. - Подключите уха клипы в генератор импульсов.
3. индукция острого ECS
: Примечание Рисунок 1B, верхней панели.
- Намочите уха клипы с стерильного физиологического раствора и убедитесь, что они являются насыщенными.
- Влажные крыса уши с стерильного физиологического раствора, завернув их в марлей, смоченной соленой. Как только они влажные, удалите марлю.
- Присоедините один клип за ухо, положение за полосе главной хряща.
- Подтверждение на машине ECS что установлен верно цикла; Если нет, появится сообщение об ошибке или чтение «1» на компьютере.
- Носите толстые, неметаллических перчатку. Удерживая крысы аккуратно в перчатке, нажмите на кнопку «Шок» на несколько секунд и медленно отпустите ручку на крыса наблюдать за захват. Для Шам «не захват» (NS) управления, одинаково обрабатывать крыса, но не доставить ток.
- Отсоедините уха клипы как пассивные начинается и записывать захват поведение согласно пересмотренной Расин шкалы22 , включающий «рот и лицевого движения» (этап 1), «кивал головой» (этап 2), «передних конечностей Клонус» (этап 3), «воспитание с передних конечностей Клонус» (этап 4) и «воспитания и падения с передних конечностей Клонус» (этап 5). Захват должен длиться приблизительно 10 s; рекорд продолжительности захвата с помощью таймера.
- После прекращения захвата вернуть его домой клетке крыса. Контролировать крыс для еще 5 минут чтобы убедиться восстановления крысы от изъятия. Держите его в клетке поодиночке здании и вернуть клетку в комнате восстановления.
- Повторите ECS индукции на следующий крыса.
- Контролировать крыс на протяжении оставшейся в день и по крайней мере один раз утром и один раз в день следующий день до тех пор, пока они являются умерщвлено для экспериментов.
Примечание: Метод индукции ECS может привести к клинические признаки как случайный побочный эффект, который требует внимания. Например протокол индукции ECS может вызвать судороги, которые длятся дольше, чем 15 s и причиной ненужных бедствия для крыс. В этом случае прекратить захват с помощью диазепама (10 мг/кг, и.п.) или Пентобарбитал (25-30 мг/кг, и.п.). Если крысы респираторного дистресса или серьезные поведенческие аномалии, после прекращения захвата, усыпить их вдыханием двуокиси углерода, следуют обезглавливание.
4. индукция хронических ECS
Примечание: См. рис. 1Б, нижней панели.
- Вызвать одну ECS в день в то же время в первой половине дня, как описано в шагах 1-3, выше, за семь дней подряд.
- Монитор, крысы два раза в день после их возвращения в свои дома клетки.
5. гомогенизации и фракционирования гиппокампах крыса
Примечание: Смотрите Рисунок 2.
- Подготовьте свежие гомогенизации буфера (решение A), который содержит Пирофосфат натрия 5 мм, 1 мм ЭДТА, сахароза 320 мм, 10 мм HEPES рН 7,4, 200 Нм okadaic кислоты и ингибиторов протеазы. Фильтр стерилизуйте буфер с помощью фильтров с размером пор 0,22 мкм для вакуумной фильтрации и поместите его на льду.
- В данный момент точку после ECS острой или хронической ECS (рис. 1), усыпить крысы на CO2 ингаляции 5-10 мин, следуют обезглавливание с помощью гильотины.
- Удаление мозга и вскрыть гиппокампах на металлической пластине, размещены на льду, как описано ранее,23,24.
- Место два гиппокампах от одной крысы на 30-мм тканевой культуры блюдо и размельчите их на мелкие кусочки с помощью ножниц.
- Передать фарш гиппокампах ручной стекла гомогенизатор, с помощью пипетки 1 мл и добавьте 1 mL ледяной гомогенизации буфера (решение A, шаг 5.1). Вставьте круглый пестиком в гомогенизатор стекла. Хотя стекло гомогенизатор на льду, мягко и постепенно удар вверх и вниз на пестик 10 - 15 раз за 1 мин, пока исчезают мелкие кусочки ткани, гиппокампа.
- Передача огневки до 1,7 мл microcentrifuge с помощью пипетки 1 мл и центрифуги огневки на 800 x g 10 мин при 4 ° C для разделения шпагу супернатант (S1 фракция) от Пелле, содержащих нерастворимые ткани и ядер (P1 дробь). Передача 50 мкл и 950 мкл S1 дроби для двух отдельных, новый 1,7 мл microcentrifuge трубок с помощью пипетки 1 мл и хранить эти трубы на льду. Сохраните P1 фракция гранул на льду.
- Центрифуга для S1 дроби (950 мкл) для 10 мин в 13800 x g и 4 ° C для разделения супернатант (S2 фракция), обогащенный цитозольной растворимые белки, и Пелле (P2 фракция), обогащенный с белками мембраны привязкой, включая синаптосомальных белков. Передать новые microcentrifuge 1,7 мл с помощью пипетки 1 мл S2 дроби и хранить его на льду.
- Ресуспензируйте Пелле (P2 фракция) в 498 мкл ледяной очищенной воды с помощью пипетки 1 мл. 2 мкл 1 М HEPES (рН 7,4) с помощью пипетки 20 мкл для достижения конечной концентрации 4 мм HEPES (рН 7,4). Инкубируйте на 4 ° C с агитации за 30 мин магазина ресуспензированы фракция P2 на льду.
- Определите концентрацию белка S1, S2 и P2 фракций, с использованием пробирного BCA. Добавьте 50 мм HEPES (рН 7,4) для каждой фракции для достижения 1 мг/мл, концентрация и хранить при температуре-80 ° C до использования, или обработать P2 фракция изолировать PSD.
6. изоляция PSD от сырой мембранных белков (P2) фракция
- Центрифуга P2 дроби (500 мкл) для 20 минут 25 000 x g и 4 ° C для разделения лизированных супернатант (LS2 фракция) и лизированных Пелле (LP1 дробь). Передать новой microcentrifuge 1,7 мл трубки с помощью пипетки 1 мл LS2 дроби и хранить его на льду.
- Ресуспензируйте LP1 Пелле в 250 мкл 50 мм HEPES (рН 7,4), смешанного с 250 мкл 1% стирального порошка в 1 x PBS буфер с помощью пипетки 1 мл. Инкубируйте на 4 ° C с нежным агитации за 15 мин.
- Центрифуга ресуспензированы LP1 Пелле за 3 ч при 25 000 x g и 4 ° C для разделения супернатант (фракция-PSD) от Пелле (PSD фракция). Удалить супернатант microcentrifuge 1.7-мл пробирку и Ресуспензируйте Пелле PSD в 100 мкл 50 мм HEPES (рН 7,4) с помощью пипетки 200 мкл.
- Определите концентрацию белка LS2, -PSD и PSD фракций с использованием пробирного BCA. Добавьте 50 мм HEPES (рН 7,4) для каждой фракции для достижения 1 мг/мл, концентрация и хранить при температуре-80 ° C до использования.
Примечание: Все решения, используемые в шагах 5-6 (то есть, решение, HEPES буфер и PBS буфер) следует с очищенной водой бесплатно ионных и органических загрязняющих веществ и твердых частиц.
7. западный Blotting
- Оттепель каждый белковые фракции на льду. Передача 12 мкл каждой фракции (S2, P2 и PSD в 1 мг/мл) для новой microcentrifuge 1,7 мл трубки с помощью пипетки 20 мкл.
- 3 мкл буфера выборки SDS 5 x и Инкубируйте на 75 ° C за 30 минут на водяной бане. Прохладный образца до комнатной температуры (RT).
- Загрузка 10 мкл пример белка в каждой скважине 4-20% градиента 15-Ну гребень гель полиакриламида SDS электрофореза (SDS-PAGE) гель с помощью пипетки 20 мкл. Запустите геля SDS-PAGE аппарат и на 80-100 V в управлении буфера (25 мм трис, 190 мм глицин и 0.1% SDS; рН 8.3).
Примечание: Каждый гель должен содержать образцы протеина от крыс NS и ECS крыс в разное время точках после острой или хронической ECS. - Передача белки от SDS-PAGE гель поливинил дифторид (PVDF) мембраны в передаче аппарат на 25-30 V (60 мА) для 9-12 ч в буфер передачи (25 мм трис, 190 мм глицин и 20% метанола; рН 8.3).
- Удаление PVDF мембрану из аппарата передачи и промойте его в трис буфер солевой раствор (TBS) за 5 мин на многоцелевой ротатор на RT.
- Блокировать мембрану в 5% молока и 0.1% Tween-20 в TBS 1 ч. Инкубируйте в первичных антител (Таблица 1) в Отмывающий буфер (молоко 1% и 0,1% Tween-20 в TBS) на ночь на многоцелевой ротатор на 4 ° C (см. Таблицу материалов для разведения).
- Вымойте мембраны 4 раза по 10 мин в буфере мыть и проинкубируйте его с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных вторичные антитела в отмывающего буфера для 1 h на многоцелевой ротатор на RT.
- Вымойте мембраны 4 раза по 10 мин в мыть буфера и затем с TBS за 5 мин.
- Проинкубируйте мембрану с расширенной chemifluorescence субстрата за 1 мин и подвергать рентгеновской пленки. Разработка открытых фильм с процессором фильм.
8. Количественная оценка западных помарок
- Сканирования в западной помарки в виде файла TIFF и сохраните этот файл на компьютере.
- Откройте файл западной помарки в программе ImageJ как изображение в градациях серого, под «Файл», «Открыть изображение,» стрелка вправо «серого.»
- Выберем инструмент Прямоугольное выделение панели ImageJ и нарисуйте прямоугольник, который охватывает один иммуноблоттинга полоса протеина интереса.
- Под «Анализировать,» хит «Мера» для получения области и средняя плотность выбранной группы.
- Переместите прямоугольник в область фона не изменяя его размер и форму. Повторите шаг 8.4 области и средней плотности фона.
- Вычтите значение средней плотности фон полосы от того из группы западной помарки, давая фон вычитается группы плотность протеина интереса.
- Повторите шаги 8.2-8,6 для всех полос иммуноблоттинга интерес.
- Разделите фон вычитается группы плотность протеина интереса, фон вычитается группы плотности продукта гена хозяйствования, например α-тубулина; Этот шаг дает нормализованное значение протеина интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подробная процедура с использованием представленные здесь, один электрическим током (55 мА, 100 импульсов в секунду для 0.5 s) доставлено через ухо клип электроды индуцированной неповторяющегося стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги у крыс (рис. 1A-B). Всего 8 крыс получил острый ECS индукции и отображается стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги. Судороги длилось около 10 s и все крысы, восстановлена в течение 1-2 мин прекращения захвата. Шам» не захват» крыс не получить поражение электрическим током и поэтому не отображать изъятий. В общей сложности 4 Шам крыс были использованы. Для хронической ECS индукции крысы получил один электрическим током в день 7 дней подряд и отображается стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги после каждого удара электрическим током (рис. 1A-B). Всего 8 крыс получил хронический ECS индукции и в общей сложности 4 Шам крыс были использованы в качестве «не захват» крыс. Хотя большинство крыс, которые получили хронический ECS поведенчески неотличим от липовые «не взятие» крыс, несколько развитое тело дрожь и снижение разведочной деятельности 7th электрическим током.
Для изучения если ECS-индуцированной глобального повышения активности изменяет выражение протеина в гиппокампах, крысы были принесены в 3 ч. и 24 ч после острых ECS и в 24 ч и 96 ч после окончательного ECS в лечении хронических ECS (рис. 1Б). Два гиппокампах от каждого крысы были быстро расчлененные и подвергается наш оптимизированный мелких фракционирование протокол (рис. 2). Первоначальный огневки двух гиппокампах бесплатно нерастворимых ткани и ядер (S1 фракция) вновь центрифугируют в 13800 x g 10 мин для разделения супернатанта, содержащий водорастворимые цитоплазматических белков (S2 фракция) гранулы сырой мембраны, содержащего синаптосомах (P2 фракция) (Рисунок 2). Наша Западная помарка обнаружено цитоплазматический белок α-тубулина в S2 фракций, но не дроби P2, в гиппокампах от крыс, получавших острых и хронических ECS (рис. 3 и рис. 4), демонстрируя успешное фракционирования Цитозольный растворимые белки от гранулы сырой мембраны.
PSD95 является членом семьи связанный мембранами гуанилат киназы (MAGUK) и основной компонент PSD12,18,25. PSD95 и NMDA-рецептора субъединица GluN2B были обнаружены исключительно в P2 фракций, но не дроби S2 (рис. 3 и рис. 4). Сильнее выражение другого глутаматергические α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic кислоты (АМПА) рецептор субъединица GluA2 был обнаружен в долях P2, по сравнению с S2 фракций в гиппокампах (рис. 3 и рис. 4), Указывает, что белки постсинаптической мембраны обогащаются в сырой мембраны P2 фракция гранул. Интересно, что синаптических пузырьков белка synaptophysin интегральный мембранный белок полосатой обогащенный тирозин фосфатазы 61 (шаг61)26 были обнаружены и одинаково в S2 и P2 фракций (рис. 3 и рис. 4). Учитывая небольшой размер синаптических пузырьков-со средним диаметром 3927 Нм и endosomes, центрифугирования изолировать гранулы сырой мембраны (P2 фракция) возможно не было достаточно, чтобы гранулы все синаптических пузырьков и endosomes. Вместе, эти результаты показывают, что наш общий коэффициент фракционирования протокол может обогатить мембраны прыгните белков и трансмембранные белки, которые не связаны с синаптических пузырьков и, возможно, с endosomes в P2 фракции сырой мембраны.
Для изучения если ECS-индуцированной глобального повышения активности изменяет выражение постсинаптических белков в гиппокампах, доля сырой мембраны P2 был лизированы в ледяной воде, высокомобильна в буфер HEPES и центрифугируют в 25000 х g на 20 минут, чтобы изолировать лизированных Пелле (LP1) (Рисунок 2). LP1 Пелле высокомобильна в HEPES буфер, содержащий 1% тритон X-100 моющее средство и центрифугируют в 25000 х g свыше 3 h для получения гранул PSD (рис. 2). Последующие иммуноблоттинга PSD фракции обнаружены PSD95, GluN2B и GluA2 (рис. 3 и рис. 4), которые известны постсинаптических белков17,25,28. Однако, PSD фракций не хватало α-тубулина и, главное, Пресинаптический маркер synaptophysin (рис. 3 и рис. 4). ШАГ61, который dephosphorylates GluN2B и GluA2 и действует как их негативный регулятор29,30,31, не был найден в PSD фракций (рис. 3 и рис. 4), в соответствии с последним докладом демонстрации синаптических исключение шаг61, опосредовано PSD95, обогащенный в PSD26. Вообще эти результаты показывают, что наши мелкие фракционирование метод успешно изолирует PSD белки от фракции сырой мембраны P2.
Количественная оценка Западный blotting показали, что GluN2B выражение неизменной в P2 фракции, но отображается растущую тенденцию в PSD фракции в 3 ч. и 24 ч после острой ECS (n = 4) (рис. 3B). GluA2 выражение не было изменено в PSD, так и P2 фракций на 3 ч. и 24 ч после острого ECS (рис. 3C). В 24 h и 96 ч после хронической ECS, GluN2B выражение отображается тенденция к снижению доли P2 и был значительно сокращен в PSD фракции (24 h: p < 0,05, n = 4; 48 h: p < 0.01, n = 4) (рис. 4B). В отличие от хронической ECS не влияет на GluA2 выражение в P2 и PSD фракций (n = 4) (рис. 4C).
Рисунок 1 : Схема для индукции ECS острых и хронических ECS. (A) A крыса была подключена к генератор импульсов через электроды клип ухо и электрическим током (55 мА, 100 импульсов в секунду для 0.5 s) был применен к получению стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги. (B) острого ECS было вызвано одним электрическим током. Хронический ECS был вызвал один поражения электрическим током в день 7 дней подряд. Моменты времени показано представляют после индукции острого ECS или последний ECS для хронических ECS индукции до вскрытия гиппокампах продолжительность. Липовые «не захват» (NS) управления крыс были обрабатываются одинаково, но не получил поражение электрическим током. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Рабочий процесс субцеллюлярные фракционирования изолировать S2, P2 и PSD фракций от гиппокампах одного крыса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Экспертиза синаптических белков в гиппокампа S2, P2 и PSD дроби от крыс, что получил NS или острый ECS. (A) представитель западной помарки Показать выражение протеина NMDA-рецептора субъединица GluN2B, АМПА рецептора GluA2 и шаг61 в S2, P2, и PSD фракций от гиппокампах Шам «не захват» (NS) крысы и крысы, получил острый ECS. Цитоплазматическая растворимого белка α-тубулина обогащается в S2 фракции. Synaptophysin является белок Пресинаптический везикул и обогащается в сырой мембраны P2 дроби, но не в PSD дроби. PSD-95 обогащается в PSD, так и P2 фракций. (B-C) Количественная оценка GluN2B (B) и GluA2 (C) в P2 и PSD фракций на 3 и 24 ч после острого ECS (n = 4 крыс на момент времени). GluN2B и GluA2 выражение в P2 фракции нормализована α-тубулина в S2 фракции. GluN2B и GluA2 выражение в PSD фракции нормализована PSD-95 в PSD фракции. Данные представлены в виде % ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Экспертиза синаптических белков в гиппокампа S2, P2 и PSD дроби от крыс, что получил NS или хронический ECS. Представитель западных помарок α-тубулина; synaptophysin; ШАГ61; и постсинаптических белков, в том числе PSD95, GluN2B и GluA2, в S2, P2 и PSD фракций от гиппокампах Шам «не захват» (NS) крысы и крысы, получил хронический ECS. Цитоплазматическая растворимого белка α-тубулина обогащается в S2 фракции. Synaptophysin является белок Пресинаптический везикул и обогащается в сырой мембраны P2 дроби, но не в PSD дроби. PSD-95 обогащается в PSD, так и P2 фракций. (B-C) Количественная оценка GluN2B (B) и GluA2 (C) в P2 и PSD фракций на 24 и 96 ч после хронической ECS (n = 4 крыс на момент времени). GluN2B и GluA2 выражение в P2 фракции нормализована α-тубулина в S2 фракции. GluN2B и GluA2 выражение в PSD фракции нормализована PSD-95 в PSD фракции. Данные представлены в виде % ± SEM; * p < 0,05, ** p < 0,01 по сравнению с контролем (тест ANOVA и Тьюки пост hoc ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Фракция | Белковые фракции | Белка маркера |
| P1 | Ядерные | Хистон-H1 |
| S1 | Цитозоль/membrances | -тубулина (цитоскелета) и GAPDH (цитозоль) |
| P2 | Сырой синаптосомах | АМПА и NMDA рецепторы субблоков |
| S2 | Цитозоль/свет membrances | GAPDH (цитозоль) и LAMP1 (оксидазных) |
| Синаптосомальных мембран | Synaptosome/митохондрий | АМПА и NMDAR рецептор субблоков, Synaptophysin (Пресинаптический маркер) |
| PSD | PSD | АМПА и NMDA рецепторы субблоков, PSD95, PICK1, CaMKII |
Таблица 1: Список маркеров белка и антител различать субцеллюлярные фракций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем метод индукции ECS крыс, который вызывает глобальные стимуляции активности нейронов в их гиппокампах. ECS — животное модель электросудорожной терапии, которая клинически используется для лечения наркотиков огнеупорных депрессивных расстройств в людей1,2,3. Несмотря на применение электросудорожной терапии для лечения тяжелой депрессии точный механизм остается неясным. Потому что ECS индуцирует depressant-как функциональности в грызунов и стимулирует гиппокампа нейрогенез4,32, ECS широко использовалась для расследования, если новые нейроны взрослого родился в зубчатой извилине гиппокампа способствовать антидепрессант поведение5,32.
ECS индуцирует легкой до тяжелой обобщенных тонизирующий клонические припадки грызунов на текущей доставки через stereotaxically имплантированных электродов, роговицы электродов или клип ухо электроды33,34. Записи ЭЭГ у больных показали, что двусторонние электрическая стимуляция вызывает более заметным и более генерализованных судорог чем односторонних стимуляции35,36. В наш метод индукции ECS тонизирующий клонические судороги вызванных текущей доставки через электроды неинвазивной уха клип прилагается к обоим ушам, подражая изъятий в организме человека, вызываемые двусторонних стимуляции36. Хотя мы еще не проверили эффективность ECS в крыс, к которым применяется анестезии или седации, вполне возможно, что давать крыс анестетики могут уменьшить степень судорог, вызванных электрической стимуляции, который может быть связано с тем, что с расширенной тормозящее и смоченной возбуждающим тон в мозг сети физиологически связано состояние анестезии. Кроме того важным шагом в методе индукции ECS — экспериментально набирать интенсивность тока вызывают стадии 4-5 обобщенной тоник - клонические судороги, на основе возраста, веса и видов грызунов. Наш метод индукции ECS была оптимизирована для вызывая судороги стадии 4-5 в течение нескольких секунд проснулся самцах Sprague-Dawley, весом 200-250 г. Если крысы под наркозом, используются для ECS индукции, интенсивность, продолжительность и частота доставки текущего следует изменить для успешного индукции захватом, начиная от стадии 4-5.
ECS также предлагает преимущества стимулирования гиперактивность в нейронах и вызывая острые временных изъятий с очень низкой смертности33, в отличие от chemoconvulsants, включая пилокарпин и каинит, которые вызывают эпилептический статус и вызвать хронический проявление спонтанное периодические приступы и тяжелой гистологические изменения37,38. Хотя ECS регулярно использовались в экране анти-эпилептических наркотиков33,34, ECS острых и хронических ECS не приводят к генерации хронических эпилепсии и поэтому не может использоваться в животной модели для изучения epileptogenesis. Вместо этого для изучения степени, какой широкий повышение активности мозга изменяет выражение или Посттрансляционная модификации синаптических белков в естественных условиях, которые способствуют стойкие изменения в синаптических широко использовалась ECS силы и структуры (рис. 3 и рис. 4)10,40. В этом исследовании мы только использовали самцах исключить неожиданные эффекты эструса фазе цикла самок крыс на количество белка PSD после ECS. Однако было отмечено, что нет никакой разницы пола в леса белков, включая PSD-95 и SAP102 в регионе PSD лобной коры головного мозга и гиппокампе39, подразумевая, что гормональные изменения регулирующих цикл эструса может не повлиять на базальной количество белков PSD.
Несколько методов для изучения степени, к которому ECS вызывает изменения в нейрогенез, synaptogenesis и синаптической пластичности5,6,,78,9, 11 , 40. Электрофизиологические записи возбуждающих постсинаптических тока (EPSC) широко используются для обнаружения изменений в синаптической силы глутаматергические возбуждающим синапсов21. Например миниатюрные EPSC записи показали гомеостатических разукрупнение возбуждающим синаптической силы в корковых пирамидных нейронов слоя II-III мышей после острого ECS41. Однако определение синаптических белков, которые способствуют ECS-индуцированной синаптической пластичности является сложной, потому что электрофизиологических записи должны быть в паре с генетический нокаут или нокдауна определенного кандидата синаптических белков. Изменения в уровне глутаматных рецепторов постсинаптической мембраны и синаптических белков, обогащенный в PSD регулировать силу и эффективность возбуждающим синаптической передачи17,18,25. Хотя иммуногистохимия может использоваться для изучения ECS-индуцированные изменения в выражении синаптических белков, этот метод можно рассматривать только 1-2 кандидата синаптических белков в то время и требует хорошо проверенных антитела, которые конкретно признать их не вызывая неспецифичный пятнать.
Субцеллюлярные фракционирование ткани мозга в сочетании с Западный blotting предлагает преимущества над электрофизиологии и иммуногистохимии в выявлении синаптических белков, которые изменяются от ECS. Субцеллюлярные фракционирование ткани мозга является быстрый и сырой биохимический метод для разделения растворимых цитозольной белки (S2 фракция) от сырой мембраны (P2 фракция), включая ER и Гольджи мембраны, мембранных органелл, мембраны плазмы, и синаптических терминала мембраны, которые запечатывается в форме синаптосомах42,,4344. PSD фракция может быть в дальнейшем изолированы от P2 фракция обогатить синаптических белков42,,4344. Беспристрастной протеомного анализа PSD фракции может идентифицировать все белки PSD, уровни которых изменяются от ECS. Западный blotting может выполняться быстро чтобы рассмотреть изменения выражения PSD белков, которые могут быть легко идентифицированы от неспецифичных.
Предыдущий метод фракционирования мозга требуется большое количество грызунов мозга ткани42,43,44, что делает этот метод сложной для использования при изучении растворимые или мембранных белков от индивидуального грызун мозга или конкретных мозга регион от одного мозга. Существует растущий спрос количественно сравнить протеома от мозга одного региона к другому и от животного управления трансгенное животное или животное, которое претерпел специфического лечения. Следовательно мы пересмотрели и оптимизированный метод фракционирования традиционные мозга изолировать сырой растворимых и мембраны фракций из двух гиппокампах одного крыса. Наши мелкие сырой фракционирование протокол успешно изолированные сырой P2 мембраны фракций от цитозольной S2 растворимых фракций, как указывалось отсутствие цитоплазматический белок α-тубулина в P2 фракции, тогда как мембрана прыгните PSD95 был обнаружен в P2, но не S2 фракций (рис. 3A и Рисунок 4A). Используя метод, описанный здесь, мы количественно показали, что острый ECS значительно увеличивает шаг61 выражение и уменьшает фосфорилирования тирозина его субстратов, GluN2B и внеклеточной сигнала регулируется киназы 1/2 в сырой нефти мембрана P2 доля гиппокампах Крыса на 48 ч после острого ECS10.
Неожиданно фракций S2 содержится synaptophysin; ШАГ61; и, в гораздо меньшей степени, GluA2 (рис. 3A и Рисунок 4A). ШАГ61 является гликозилированного интегральный мембранный белок26 связанные с эндоплазменный ретикулум (ER) и PSD45. Вполне возможно, что центрифугирования изолировать гранулы сырой мембраны (P2 фракция) может не было достаточно, чтобы гранулы все синаптических везикулы, содержащие синаптосомах, а также endosomes и лизосомы, содержащие GluA2 и шаг61. Тем не менее, ясно обогащения GluN2B, GluA2 и PSD95 и отсутствие α-тубулина в P2 фракций указывают, что наш фракционирование протокол может обогатить мембраны прыгните белков и трансмембранные белки, которые не связаны с синаптических пузырьков и endosomes в сырой мембраны P2 фракции.
Хотя P2 фракции сырой мембрана содержит синаптосомах, ограничение следственный активности зависимые изменения синаптических белков в P2 фракции состоит, что не может быть определено точное место их изменения. Если синаптических белков, обогащенный в PSD были определены, дальнейшей биохимической фракционирование может использоваться для изоляции PSD. Предыдущий метод PSD фракционирование требует большого количества грызунов мозговой ткани (т.е., 10-20 грызунов мозги) и сахароза градиенты42,,4344. Потому что этот традиционный метод недостаточно выделить достаточное количество PSD фракции от двух гиппокампах одной крысы, мы адаптировали более простой метод, который непосредственно изолирует PSD фракции, без сахарозы градиента20,21 . Этот метод дает о 30-50 мкг белка PSD, достаточных для нескольких биохимических анализов, включая Западный blotting. Наш метод обогащает PSD95, GluN2B и GluA2, которые известны в основном в PSD дроби и обнаруживает изменения в GluN2B выражении в PSD фракции после хронической ECS индукции (рис. 3 и рис. 4).
Здесь наш количественных Вестерн-блот анализ показал никаких существенных изменений в GluA2 выражении в P2 и PSD фракций в 3 ч. и 24 ч после острого ECS (рис. 3C). GluN2B выражение неизменной в P2 фракции, но отображается растущую тенденцию в PSD фракции в 3 ч. и 24 ч после острой ECS (Рисунок 3B), предлагая возможность дифференцированного регулирования синаптических против внесинаптического GluN2B-содержащих NMDA рецепторы. Мы также отмечено, что выражение GluN2B отображается тенденция к снижению доли P2 после хронической ECS и было значительно сокращено в PSD дроби на 24 и 96 ч, после хронической ECS (Рисунок 4B). Хотя спекулятивной, такое удаление GluN2B из PSD после повторяющихся индукции ECS может опосредовано нескольких механизмов, включая прямые интернализации внесинаптического сайты из PSD мембраны или боковых диффузии. Учитывая наш предыдущий доклад, что длительное повышение активности нейронов заметно увеличивает шаг61 выражение и уменьшает Tyr фосфорилирование GluN2B в P2 фракций культивировали Нейроны гиппокампа46, наши результаты показывают уменьшение GluN2B выражение в P2 и PSD фракции после хронической ECS может быть скорее всего из-за укрепления шага61 выражения и последующего удаления GluN2B от внесинаптического мембраны.
Таким образом мы показали, что наши мелкие метод фракционирования PSD, в сочетании с протоколом индукции ECS, позволяет нам дифференцировать в естественных условиях деятельность зависимой регуляции глутаматных рецепторов на постсинаптической мембраны по сравнению с всего мембраны плазмы, включая внесинаптического мембраны. Этот протокол легко может быть применен к любой синаптических белков в возбуждающим синапсов и могут быть изменены для других грызунов гиппокампах или других регионах мозга регулируя объем каждого решения, основанные на вес ткани. Таким образом наши мелких метод фракционирования PSD является универсальным и может быть принят для будущих приложений для изучения изменений в естественных условиях в постсинаптической белков в каждое животное на генетические, фармакологическим или механические лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят д-р Эрик C. Bolton за предоставленную нам возможность использовать его центрифуги для фракционирования и д-р Грэм х. Diering в лаборатории д-р Ричард л Huganir в университете Джона Хопкинса для предоставления нам с мелким протоколом для фракционирования PSD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
