Summary
Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de terapia eletroconvulsiva para depressão grave. ECS globalmente estimula a atividade no hipocampo, levando a sinaptogênese e plasticidade sináptica. Aqui, descrevemos os métodos para a indução de ECS em ratos e para fraccionamento subcelular de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em proteínas sinápticas.
Abstract
Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de eletroconvulsoterapia, o tratamento mais eficaz para a depressão severa. ECS induz convulsões tônico-clônica generalizadas com baixa mortalidade e morte neuronal e é um modelo utilizado para droga anti-epiléptica de tela. Aqui, descrevemos um método de indução de ECS em que uma corrente de 55-mA breve é entregue para 0,5 s para macho ratos 200-250 g de peso através de eletrodos de orelha-clip. Tal estimulação bilateral produzida estágio 4-5 convulsões Clônicas que durou cerca de 10 s. Após a cessação da ECS aguda ou crônica, a maioria dos ratos recuperados para ser comportamentalmente indistinguível de sham a ratos "nenhuma apreensão". Porque ECS globalmente eleva a atividade cerebral, ele também serviu para examinar alterações de atividade-dependente de proteínas sinápticas e seus efeitos na força sináptica, usando vários métodos. Em particular, fraccionamento subcelular da densidade pós-sináptica (PSD) em combinação com mancha ocidental permite a determinação quantitativa da abundância de proteínas sinápticas nesta estrutura sináptica especializada. Em contraste com um método de fracionamento anterior que exige grande quantidade de cérebros de roedores, descrevemos aqui um método de fracionamento de pequena escala para isolar o PSD do hipocampo de rato único, sem centrifugação gradiente de sacarose. Usando esse método, mostramos que a fração isolada do PSD contém proteínas de membrana pós-sináptica, incluindo PSD95, GluN2B e GluA2. Sinaptofisina marcador pré-sináptica e proteínas citoplasmáticas solúveis α-tubulina foram excluídas a fração PSD, demonstrando bem sucedido isolamento do PSD. Além disso, a ECS crônica diminuiu GluN2B expressão no PSD, indicando que o nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala pode ser aplicado para detectar as alterações no hipocampo proteínas PSD de um único rato após tratamentos genéticos, farmacológicos ou mecânicos .
Introduction
Eletroconvulsoterapia tem sido usada para tratar pacientes com distúrbios depressivos major, incluindo depressão severa resistente a medicamentos, depressão bipolar, a doença de Parkinson doenças e esquizofrenia1,2. Esta terapia, convulsão é gerado pelo estímulo eléctrico entregado na cabeça de pacientes anestesiados através de sub-fascial eletrodos1,2,3. Administração repetitiva de ECS tem sido clinicamente benéfica para transtornos depressivos resistentes1,2,3. No entanto, o mecanismo exato subjacentes a eficácia a longo prazo do efeito antidepressivo em humanos permaneceu indescritível. ECS é um modelo animal de eletroconvulsoterapia e é amplamente usado para investigar seu mecanismo terapêutico. Em roedores, ambos ECS aguda e crônico tratamento ECS promovem neurogénese adulta no hipocampo em reorganizar a rede neural4,5, susceptível de contribuir para melhorias na flexibilidade cognitiva. Além disso, elevação global da atividade cerebral por ECS altera a abundância de transcrições, tais como um cérebro derivada neurotrópica fator6e várias proteínas, incluindo metabotrópico glutamato receptor 17 e o N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutamato receptor subunidades7. Estas mudanças estão envolvidas na mediação a longo prazo modificação do número de sinapse, estrutura e força do hipocampo7,8,9.
Modelos ECS, estimulação elétrica é entregue para roedores via stereotaxically implantados eletrodos, eletrodos corneais ou eletrodos de orelha para evocar as convulsões tônico-clônica generalizada10,11. Estereotáxica implante de eletrodos envolve cirurgia cerebral e exige um tempo significativo para melhorar habilidades cirúrgicas do experimentador para minimizar a lesão. Menos invasivos eletrodos corneais podem causar secura e abrasão corneal e requer anestesia. O uso de eletrodos de orelha-clip ignora essas limitações porque eles podem ser usados em roedores sem cirurgia ou anestesia e causam lesão mínima. De fato, descobrimos que atual entregues ao acordado ratos através de orelha-clip eletrodos confiantemente induz convulsões tônico-clônicas fase 4-5 e altera as proteínas sinápticas em seu hipocampo10.
Para examinar a abundância de ECS-induzida de proteínas sinápticas em regiões específicas do cérebro dos roedores, é importante escolher os métodos experimentais que são mais adequados para a sua detecção e quantificação. Fraccionamento subcelular do cérebro permite o isolamento bruto de proteínas citosólico solúveis; proteínas de membrana; proteínas de organela-limites; e até mesmo proteínas em estruturas subcelulares especiais, tais como o PSD12,13,14. O PSD é um domínio subcellular denso e bem organizado em neurônios no qual proteínas sinápticas são altamente concentradas em e perto da membrana pós-sináptica12,13,15. O isolamento do PSD é útil para o estudo de proteínas sinápticas enriquecido no PSD, desde mudanças dinâmicas na abundância e função de receptores pós-sinápticos glutamato, andaimes proteínas e proteínas de transdução de sinal no PSD12 , 15 , 16 , 17 são correlacionadas com plasticidade sináptica e o synaptopathy observado em várias doenças neurológicas17,18. Um método de fracionamento subcelular anterior usado para purificar o PSD envolveu o isolamento da fração insolúvel em detergente da fracção bruto da membrana do cérebro pela centrifugação diferencial de gradientes de sacarose14, 19. o grande desafio com esse método tradicional é que ele requer grandes quantidades de roedores cérebros14,19. Preparação de 10-20 roedores para isolar a fração do PSD por tratamento exige extensivo custo e investimento de tempo e não é praticamente viável se existem muitos tratamentos.
Para superar este desafio, nós adaptamos um método mais simples que diretamente isola a fração do PSD, sem sacarose centrifugação gradiente20,21e revisto para ser aplicável ao isolamento do PSD do hipocampo de rato único cérebro. Nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala produz sobre 30-50 µ g de proteínas PSD de 2 hipocampo, suficiente para o uso em vários ensaios bioquímicos, incluindo imunoprecipitação e mancha ocidental. Mancha ocidental demonstra o sucesso do nosso método para isolar o PSD, revelando o enriquecimento da proteína densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) e a exclusão de marcador pré-sináptica Sinaptofisina e proteínas citoplasmáticas solúveis α-tubulina. Nossa indução ECS e métodos de fracionamento de PSD em pequena escala são facilmente adaptáveis para outras regiões do cérebro de roedor e fornecem uma maneira relativamente simples e confiável para avaliar os efeitos da ECS na expressão de proteínas do PSD.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso na Universidade de Illinois em Urbana-Champaign e cuidado de animais institucionais.
1. manter uma colônia de rato
- Raça de ratos Sprague-Dawley (consulte a Tabela de materiais) e mantê-las em condições normais, com um ciclo de 12 h claro-escuro e ad libitum acesso à comida e água.
- Desmamar os filhotes de rato no dia pós-natal (P) 28 e colocá-los em grupos de 2-4 machos ou fêmeas littermates.
- Marca as caudas dos ratos machos com um marcador preto permanente de tóxicos para identificação.
- Pesar os ratos machos 3 vezes por semana e registar a sua bodyweights.
2. preparação de uma máquina de ECS
- Às 07:30, desinfectar o banco na sala de preparação de animais e colocar uma máquina ECS (gerador de pulso) no banco.
- Coloque um rato masculino individual pesando 200-250 g numa gaiola limpa e vazia com tampa. Repita isto para todos os ratos machos devem ser tratados com indução de ECS. Deixe os ratos se habituar por 30 min.
- Enquanto os ratos são habituating em suas gaiolas, defina um gerador de pulso para indução de ECS para a frequência de 100 pulsos/s, uma largura de pulso de 0,5 ms, a duração do choque de 0,5 s e uma corrente de 55 mA (Figura 1A).
- Prepare o gerador de pulso, apertando o botão de "RESET" e garantindo que o botão "Pronto" estiver acesa. Certifique-se de que os clipes de ouvido não estão conectados a um gerador de pulso e em seguida, pressione o botão de "Choque" por alguns segundos.
Nota: neste ponto, o gerador de pulso está pronto para a indução de ECS. - Conecte os clipes de orelha o gerador de pulso.
3. indução de ECS aguda
Nota: Ver Figura 1B, painel superior.
- Molhar os clipes de orelha com solução salina estéril e certifique-se de que eles estão saturados.
- Molhe as orelhas de um rato com solução salina estéril por envolvê-los em gaze embebida em soro fisiológico. Uma vez que eles estão molhados, remova a gaze.
- Anexe um clip por orelha, posição além da banda principal de cartilagem.
- Confirmar na máquina ECS que seja estabelecido um laço verdadeiro; Se não, uma leitura de "1" ou uma mensagem de erro aparecerá na máquina.
- Use uma luva grossa, não-metálicos. Enquanto segura o rato delicadamente em uma mão enluvada, pressione o botão de "Choque" por alguns segundos e solte lentamente o punho no rato para observar a apreensão. Para a farsa "nenhuma apreensão" (NS) controlam, manipular o rato de forma idêntica, mas não entregam a corrente.
- Desconecte os clipes de orelha como clonus começa e registrar o comportamento de ataque de acordo com uma revista Racine escala22 que inclui "os movimentos faciais e boca" (fase 1), "cabeça a acenar" (fase 2), "clonus membro anterior" (fase 3), "criação com clonus membro anterior" (etapa 4) e "criação e caindo com clonus membro anterior" (etapa 5). A apreensão deve durar cerca de 10 s; registar a duração de ataque usando um timer.
- Após a cessação de apreensão, retorne o rato para sua gaiola em casa. Monitore o rato para outro 5 min certificar-se da recuperação do rato de apreensões. Mantê-lo isoladamente alojado na gaiola e retornar a gaiola para a sala de recuperação.
- Repita a indução de ECS no próximo rato.
- Monitore os ratos no restante do dia e pelo menos uma vez de manhã e uma vez na parte da tarde no dia seguinte, até que eles são sacrificados para experimentos.
Nota: O método de indução de ECS pode levar a sinais clínicos como um efeito colateral incidental, o que requer atenção. Por exemplo, o protocolo de indução de ECS pode induzir convulsões que duram mais de 15 s e causa sofrimento desnecessário para os ratos. Neste caso, encerrar o ataque usando o diazepam (10 mg/kg, i.p.) ou pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Se os ratos desenvolvem insuficiência respiratória ou graves anomalias comportamentais após a cessação de apreensão, sacrificá-los por inalação de dióxido de carbono, seguida por decapitação.
4. indução de ECS crônica
Nota: Consulte a Figura 1B, painel inferior.
- Induzi uma ECS por dia ao mesmo tempo pela manhã, conforme descrito nas etapas 1-3, acima, durante sete dias consecutivos.
- Monitor os ratos gaiolas duas vezes um dia depois que eles são retornados para a sua casa.
5. homogeneização e fracionamento do hipocampo de rato
Nota: Consulte a Figura 2.
- Preparar uma reserva de homogeneização fresco (solução A) que contém sacarose 320mm, pirofosfato de sódio de 5 mM, 1 mM EDTA, pH de 10 mM HEPES 7.4, 200 o ácido ocadaico nM e inibidores da protease. Filtro-esterilizar o buffer usando filtros com um tamanho de poro 0,22 µm para filtragem do vácuo e colocá-lo no gelo.
- Em um determinado momento ponto seguinte ECS aguda ou crônica ECS (Figura 1), eutanásia o rato por inalação de CO2 por 5-10 min, seguido por decapitação usando uma guilhotina.
- Remover o cérebro e dissecar o hipocampo na placa de metal colocados no gelo, conforme descrito anteriormente,23,24.
- Coloque dois hipocampo de um rato em uma cultura de tecido de 30 mm do prato e pique-os em pequenos pedaços com uma tesoura.
- Transferir o hipocampo picado para um homogeneizador de vidro manual usando uma pipeta de 1 mL e adicionar 1 mL de tampão de homogeneização gelada (solução A, passo 5.1). Inserir um pilão redondo em um homogeneizador de vidro. Enquanto o homogenizador de vidro está no gelo, delicadamente e com firmeza curso acima e para baixo sobre o pilão 10 - 15 vezes por 1 min, até pequenos pedaços de tecido hippocampal desapareceram.
- Transfira o homogeneizado para um tubo de microcentrifuga de 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e centrifugar o homogenate a 800 x g durante 10 minutos a 4 ° C para separar o sobrenadante pós-nucleares (fração de S1) da pelota contendo tecido insolúvel e núcleos (fração de P1). Transferir 50 µ l e 950 µ l da fração S1 para dois tubos de microcentrifuga separado, nova 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazenar esses tubos no gelo. Salve a pelota de fração de P1 no gelo.
- Centrifugue a fração de S1 (950 µ l) durante 10 minutos a 13.800 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante (fração S2), enriquecido com proteínas solúveis no citosol, e a pelota (fração P2), enriquecido com proteínas de membrana-limite, incluindo proteínas synaptosomal. Transferir a fração S2 para novo microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazená-lo no gelo.
- Resuspenda o pellet (fração P2) em 498 µ l de água filtrada gelada, utilizando uma pipeta de 1 mL. Adicionar 2 µ l de 1 M HEPES (pH 7,4) utilizando uma pipeta de 20 µ l a obter uma concentração final de 4 mM HEPES (pH 7,4). Incube a 4 ° C, com agitação por 30 min. loja a ressuspensa fração P2 no gelo.
- Determine a concentração de proteína das frações S1, S2 e P2 usando um ensaio BCA. Adicionar 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fração para atingir uma concentração de 1 mg/mL e armazenar a-80 ° C até o uso, ou processar a fração P2 para isolar o PSD.
6. isolamento do PSD da fracção membrana bruto proteína (P2)
- Centrifugue a fração P2 (500 µ l) por 20 min em 25.000 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante lisado (LS2 fração) e o pellet lisado (LP1 fração). A fração LS2 de transferência para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazená-lo no gelo.
- Resuspenda o pellet LP1 em 250 µ l de 50 mM HEPES (pH 7,4) misturado com 250 µ l de detergente de 1% em tampão PBS, usando uma pipeta de 1 mL de 1x. Incube a 4 ° C, com agitação suave por 15 min.
- Centrifugue o ressuspenso LP1 para 3h em 25.000 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante (fração não-PSD) a pelota (fração do PSD). Remover o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL e ressuspender o PSD em 100 µ l de 50 mM HEPES (pH 7,4) utilizando uma pipeta de 200 µ l.
- Determine a concentração de proteína da LS2, não-PSD e frações PSD usando um ensaio BCA. Adicione 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fração para atingir uma concentração de 1 mg/mL e armazenar a-80 ° C até o uso.
Nota: Todas as soluções utilizadas nas etapas 5-6 (ou seja, A solução tampão HEPES e tampão PBS) devem ser feitas com água purificada e livre de partículas e contaminantes orgânicos e iônicos.
7. mancha ocidental
- Descongele a cada fração de proteína no gelo. Transferência para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 20 µ l de 12 µ l de cada fração (S2, P2 e PSD em 1 mg/mL).
- Adicione 3 µ l de buffer de amostra 5 x SDS e incubar a 75 ° C por 30 min em um banho de água. Refrigerar a amostra até à temperatura (RT).
- Carrega 10 µ l da amostra da proteína em cada poço de 4-20% gradiente 15-bem pente SDS-gel de eletroforese (SDS-PAGE) do gel de polyacrylamide usando uma pipeta de 20 µ l. Funcione o gel no aparato de SDS-PAGE e em 80-100 V em reserva de marcha (25 mM Tris glicina de 190 mM e 0,1% SDS; pH 8.3).
Nota: Cada gel deve conter amostras da proteína de NS ratos e ratos ECS em pontos diferentes do tempo seguindo ECS aguda ou crônica. - Transferência das proteínas da SDS-página do gel para uma membrana de policloreto difluoreto (PVDF) no aparelho de transferência em 25-30 V (60 mA) para 9-12 h no buffer de transferência (25 mM Tris glicina 190mm e 20% de metanol; pH 8.3).
- Retire o aparelho de transferência da membrana PVDF e lavá-lo em salino Tris (TBS) por 5 min em um rotador de múltiplos propósito a RT
- Bloquear a membrana em leite de 5% e 0,1% Tween-20 em TBS para h. 1-incubar em anticorpos primários (tabela 1) em tampão de lavagem (leite de 1% e 0.1% Tween-20 em TBS) durante a noite em um rotador de múltiplos propósito a 4 ° C (ver a Tabela de materiais para as diluições).
- Lavar a membrana por 10 min cada por 4 vezes em tampão de lavagem e incube-a então com peroxidase de rábano (HRP)-conjugados com anticorpos secundários no buffer para 1h de lavagem em rotacao multi-uso em RT
- Lave a membrana por 10 min cada por 4 vezes em tampão de lavagem e depois com TBS por 5 min.
- Incubar a membrana com substrato chemifluorescence reforçada por 1 min e expô-la a película de raio x. Desenvolva o filme exposto com um processador de filme.
8. quantificação dos borrões ocidentais
- Varredura do Western blot como um arquivo TIFF e salve este arquivo no computador.
- Abra o arquivo de borrão ocidental no programa ImageJ como uma imagem em tons de cinza, em "Arquivo", "Abrir imagem", seta para a direita "escala de cinza".
- Escolha a ferramenta de seleção retangular na barra de ferramentas do ImageJ e desenhe um retângulo que abrange uma banda simples borrão ocidental de uma proteína de interesse.
- Sob "Analisar," bateu "Medida" para obter a área e a densidade média de uma banda selecionada.
- Mova o retângulo de uma área de fundo sem alterar seu tamanho e forma. Repita a etapa 8.4 para a área e a densidade média de um plano de fundo.
- Subtrai o valor da densidade média de uma banda de fundo daquele de uma banda de Western blot, dando a densidade de fundo-subtraído banda da proteína de interesse.
- Repita as etapas de 8,2-8,6 para todas as bandas de borrão ocidental de interesse.
- Dividir a densidade de fundo-subtraído banda da proteína de interesse pela densidade banda fundo-subtraído de um produto de gene das tarefas domésticas, tais como a α-tubulina; Esta etapa produz o valor normalizado da proteína de interesse.
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Representative Results
Usar o procedimento detalhado apresentado aqui, um choque elétrico (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) entregues via orelha-clip eletrodos induzidos não recorrente estágio 4-5 convulsões tônico-clônicas em ratos (Figura 1A-B). Um total de 8 de ratos recebeu aguda indução ECS e exibido convulsões tônico-clônicas fase 4-5. As convulsões duraram cerca de 10 s e todos os ratos recuperados dentro de 1-2 min de cessação de apreensão. Sham "nenhuma apreensão" ratos não recebeu um choque elétrico e, portanto, não exibir as convulsões. Um total de 4 ratos de Souza foram usados. Para indução de ECS crônica, os ratos receberam um choque elétrico por dia durante 7 dias consecutivos e exibido as convulsões tônico-clônicas fase 4-5, após cada choque elétrico (Figura 1A-B). Um total de 8 de ratos recebeu crônica indução ECS e um total de 4 ratos de Souza foram usados como ratos "nenhuma apreensão". Embora a maioria dos ratos que receberam ECS crônica foram comportamentalmente indistinguíveis de sham a ratos "nenhuma apreensão", alguns tremores de corpo desenvolvido e reduzida atividade exploratória pelo 7th choque elétrico.
Para examinar se induzida por ECS elevação global da atividade altera a expressão da proteína no hipocampo, ratos foram sacrificados às 3 h e 24 h depois da ECS aguda e em 24 h e 96 h após o ECS final no tratamento crônico de ECS (Figura 1B). Dois hipocampo de cada rato rapidamente foram dissecados e submetido ao nosso protocolo otimizado de fraccionamento em pequena escala (Figura 2). O homogenate inicial de dois hipocampo livre de tecido insolúvel e núcleos (fração de S1) re-foi centrifugado a 13.800 x g durante 10 minutos separar o sobrenadante contendo proteínas citoplasmáticas solúveis (fração S2) da membrana bruta da pelota contendo sinaptossomas (fração P2) (Figura 2). Nosso borrão ocidental detectada proteína citoplasmática α-tubulina em frações S2, mas não as frações de P2, do hipocampo de ratos tratados com ECS aguda e crônica (Figura 3 e Figura 4), demonstrando o sucesso fracionamento de proteínas solúveis citosólica da membrana bruto Pelotas.
PSD95 é um membro da família de membrana-associado guanilato quinase (MAGUK) e um componente do núcleo do PSD12,18,25. PSD95 e o subunit do receptor NMDA GluN2B foram detectados exclusivamente em frações P2, mas não as frações S2 (Figura 3 e Figura 4). Mais forte expressão de outra glutamatérgico α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic ácido (Leandro) receptor subunidade GluA2 foi detectada nas fracções P2 em comparação com as frações de S2 no hipocampo (Figura 3 e Figura 4), indicando que as proteínas de membrana pós-sináptica são enriquecidas em pellets de fração da membrana bruto P2. Curiosamente, vesícula sináptica Sinaptofisina de proteína e proteína integral de membrana Striatal enriquecido tirosina fosfatase 61 (etapa61)26 foram detectados igualmente em frações S2 e P2 (Figura 3 e Figura 4). Considerando o pequeno tamanho das vesículas sinápticas-com um diâmetro médio de 39 nm27 e endossomos, a centrifugação para isolar a pelota crua de membrana (fração P2) pode não ter sido suficiente para todas as vesículas sinápticas e endossomos de Pelotas. Juntos, estes resultados indicam que nosso protocolo de fracionamento de petróleo pode enriquecer as proteínas de membrana-limite e proteínas transmembrana que não estão associadas com vesículas sinápticas e, possivelmente, com endossomos na fração P2 membrana bruto.
Para examinar se induzida por ECS elevação global da atividade altera a expressão de proteínas pós-sinápticas no hipocampo, a fração de membrana bruto P2 foi lysed em água gelada, resuspended no tampão HEPES e centrifugada a 25.000 x g por 20 min isolar o lisados pelota (LP1) (Figura 2). A pelota LP1 foi resuspended no tampão HEPES contendo 1% de detergente de Triton X-100 e centrifugada a 25.000 x g mais de 3h para obter o sedimento do PSD (Figura 2). Western blot subsequente das frações PSD detectado PSD95, GluN2B e GluA2 (Figura 3 e Figura 4), que são conhecidos proteínas pós-sinápticas17,25,28. No entanto, as frações PSD carecia de α-tubulina e, importante, marcador pré-sináptica Sinaptofisina (Figura 3 e Figura 4). PASSO61, que dephosphorylates GluN2B e GluA2 e atua como seu regulador negativo29,30,31, não foi encontrado nas fracções PSD (Figura 3 e Figura 4), consistente com o recente relatório demonstrando a exclusão sináptica de passo61, mediada por PSD95 enriquecido com o PSD de26. No total, estes resultados indicam que o nosso método de fracionamento de pequena escala com êxito isola proteínas PSD da fracção bruto membrana P2.
A quantificação da mancha ocidental revelou que GluN2B expressão foi inalterada na fração P2 mas exibido uma tendência crescente na fração de PSD em 3 h e 24 h depois da ECS aguda (n = 4) (Figura 3B). Expressão de GluA2 não foi alterado em fracções a P2 e o PSD às 3 h e 24 h após ECS aguda (Figura 3C). Em 24 h e 96 h após crônica ECS, GluN2B expressão exibida uma tendência decrescente na fração P2 e foi significativamente reduzida na fração de PSD (24 h: p < 0.05, n = 4; 48 h: p < 0,01, n = 4) (Figura 4B). Em contraste, ECS crônica não afetou GluA2 expressão nas fracções P2 e PSD (n = 4) (Figura 4C).
Figura 1 : Esquema para a indução do ECS aguda e crônica ECS. (A), A ratazana estava ligada a um gerador de pulso através de eletrodos clip de orelha e um choque elétrico (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) foi aplicado para provocar convulsões tônico-clônicas fase 4-5. (B) aguda ECS foi induzido por um choque elétrico. ECS crônica foi provocada por um choque elétrico por dia durante 7 dias consecutivos. Os pontos de tempo indicados representam a duração após a indução da ECS aguda ou o último ECS para indução de ECS crônica antes da dissecação do hipocampo. Não Sham "nenhuma apreensão" (NS) controle de ratos foram manipulados de maneira idêntica, mas não recebeu um choque elétrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Fluxo de trabalho de fracionamento subcelular de isolar o S2, P2 e PSD fracções do hipocampo de um único rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exame de proteínas sináptica no hipocampo S2, P2 e PSD fracções dos ratos que receberam NS ou ECS aguda. (Um) representante borrões ocidentais mostram a expressão da proteína de subunidade de receptor NMDA GluN2B, Leandro do receptor GluA2 e passo61 em S2, P2, e frações do PSD do hipocampo de sham "nenhuma apreensão" (NS) ratos e ratos que receberam ECS aguda. A proteína citoplasmática solúveis α-tubulina é enriquecido na fração de S2. Sinaptofisina é uma proteína de vesícula pré-sináptica e é enriquecida na membrana bruta fração P2, mas não na fração de PSD. PSD-95 é enriquecida em fracções a P2 e o PSD. (B-C) Quantificação de GluN2B (B) e GluA2 (C) nas fracções P2 e PSD no 3 e 24 h depois da ECS aguda (n = 4 ratos por ponto de tempo). Expressão GluN2B e GluA2 na fração P2 foi normalizada para α-tubulina na fração de S2. Expressão GluN2B e GluA2, na fração de PSD foi normalizada para o PSD-95 na fração de PSD. Os dados são apresentados como a porcentagem ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exame de proteínas sináptica no hipocampo S2, P2 e PSD fracções dos ratos que receberam NS ou ECS crônica. Borrões ocidentais de representante da α-tubulina; Sinaptofisina; PASSO61; e proteínas pós-sinápticas, incluindo PSD95, GluN2B e GluA2, nas fracções S2, P2 e PSD do hipocampo de sham "nenhuma apreensão" (NS) ratos e ratos que receberam ECS crônica. A proteína citoplasmática solúveis α-tubulina é enriquecido na fração de S2. Sinaptofisina é uma proteína de vesícula pré-sináptica e é enriquecida na membrana bruta fração P2, mas não na fração de PSD. PSD-95 é enriquecida em fracções a P2 e o PSD. (B-C) Quantificação de GluN2B (B) e GluA2 (C) nas fracções P2 e PSD em 24 e 96 h após ECS crônica (n = 4 ratos por ponto de tempo). Expressão GluN2B e GluA2 na fração P2 foi normalizada para a α-tubulina na fração de S2. Expressão GluN2B e GluA2, na fração de PSD foi normalizada para o PSD-95 na fração de PSD. Os dados são apresentados como porcentagem ± SEM; * p < 0.05, * * p < 0,01 comparado com controle (ANOVA e Tukey teste post-hoc ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Fração | Fração proteica | Marcador de proteína |
| P1 | Nuclear | Histon H1 |
| S1 | Citosol/membrances | a-tubulina (citoesqueleto) e GAPDH (citosol) |
| P2 | Sinaptossomas brutas | Subunidades de receptores GABA e NMDA |
| S2 | Citosol/luz membrances | GAPDH (citosol) e LAMP1 (lisossomo) |
| Membrana synaptosomal | Synaptosome/mitocôndria | Leandro e NMDAR subunidades do receptor, Sinaptofisina (marcador pré-sináptica) |
| PSD | PSD | Subunidades do receptor GABA e NMDA, PSD95, PICK1, CaMKII |
Tabela 1: Lista de marcadores de proteína e anticorpos para distinguir frações subcelulares.
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Discussion
Aqui, descrevemos um método de indução de ECS em ratos que provoca a estimulação global da atividade neuronal em seu hipocampo. ECS é um modelo animal de eletroconvulsoterapia, que clinicamente é usada para tratar transtornos depressivos refratários de drogas em seres humanos1,2,3. Apesar do uso da terapia electroconvulsive para tratar a depressão grave, o mecanismo preciso subjacente permanece obscuro. Porque ECS induz comportamentos anti-depressant-como em roedores e estimula a neurogênese hippocampal4,32, ECS tem sido extensivamente usada para investigar se novos neurônios adulto-nascido no giro denteado do hipocampo contribui para o comportamento de anti-depressivo5,32.
ECS induz leve a grave convulsões tônico-clônica generalizadas em roedores na atual entrega através de stereotaxically implantados eletrodos, eletrodos corneais ou orelha-clip eletrodos33,34. Gravações de EEG em pacientes revelaram que bilateral estimulação elétrica provoca convulsões mais proeminentes e mais generalizadas do que estimulação unilateral faz35,36. Em nosso método de indução de ECS, convulsões tônico-clônicas são induzidas pela atual entrega através de eletrodos clip de orelha não-invasiva, ligado a ambas as orelhas, simulando ataques em seres humanos evocados pela estimulação bilateral36. Embora não procuramos a eficácia da ECS nos ratos aos quais é aplicada a sedação ou anestesia, é viável que dar drogas anestésicas para os ratos poderia reduzir o grau de convulsões induzidas por estimulação elétrica, que pode ser devido ao fato de que Estado de anestesia é fisiologicamente associado com Tom excitatório inibitório e umedecido reforçada na rede de cérebro. Além disso, o passo crítico no método de indução de ECS é discar experimentalmente a intensidade de corrente para eliciar a fase 4-5 generalizada tônico - clônica convulsões com base na idade, peso e as espécies de roedores. Nosso método de indução de ECS foi otimizado para induzir convulsões fase 4-5 segundos depois de acordado ratos Sprague-Dawley machos, pesando 200-250 g. Se os ratos sob estado de anestesia são utilizados para indução de ECS, a intensidade, duração e frequência de fornecimento de corrente devem ser modificados para indução bem-sucedida de apreensão, que vão desde a fase de 4 a 5.
ECS também oferece a vantagem de estimular a hiperatividade em neurônios e causando convulsões transitórias agudas com baixíssima mortalidade33, em contraste com o chemoconvulsants, incluindo pilocarpina e cainite, que induzir o estado de mal epiléptico e causar crônica manifestação espontâneas convulsões recorrentes e graves alterações histológicas37,38. Embora a ECS tem sido utilizada rotineiramente a tela droga anti-epiléptica33,34, ECS aguda e crônica ECS não resultar na geração de epilepsia crônica e, portanto, não pode ser usado em um modelo animal para estudar epileptogenesis. Em vez disso, ECS tem sido amplamente empregado para examinar a extensão a que a ampla elevação da atividade cerebral altera expressão e/ou modificações posttranslational de proteínas sinápticas na vivo, que contribuem para alterações persistentes no synaptic força e estruturas (Figura 3 e Figura 4)10,40. Neste estudo, só usamos ratos machos para excluir os efeitos inesperados de estro a fase do ciclo de ratos fêmeas na quantidade de proteína do PSD depois da ECS. No entanto, observou-se que não há nenhuma diferença de sexo nas proteínas de andaimes, incluindo PSD-95 e SAP102 na região do córtex frontal e hipocampo39, sugerindo que as mudanças hormonais que regulam o ciclo estro não podem afetar o basal de PSD quantidade de proteínas do PSD.
Vários métodos têm sido empregados para examinar a extensão a que a ECS induz mudanças na neurogênese, sinaptogênese e plasticidade sináptica5,6,7,8,9, 11 , 40. eletrofisiológicas gravações de corrente pós-sináptico excitatório (EPSC) são amplamente utilizadas para detectar as alterações na força sináptica de excitatório glutamatérgico sinapses21. Por exemplo, gravações de EPSC miniatura revelaram que a redução de escala homeostática da força sináptica excitatória nos neurônios piramidais corticais de camadas II-III de ratos seguindo aguda ECS41. No entanto, a identificação das proteínas sinápticas que contribuem para a plasticidade sináptica induzida por ECS é desafiador porque gravações eletrofisiológicas devem ser emparelhadas com o nocaute genético ou knock-down de proteínas sinápticas candidato específico. Alterações no nível dos receptores de glutamato na membrana pós-sináptica e proteínas sinápticas enriquecidas no PSD regulam a força e a eficácia da transmissão sináptica excitatória17,18,25. Apesar de imuno-histoquímica pode ser usado para examinar o ECS induzido por alterações na expressão de proteínas sinápticas, esta técnica pode examinar apenas 1-2 candidato sináptica proteínas em um tempo e requer bem validados anticorpos que reconhecem especificamente sem causar coloração não específica.
O fraccionamento subcelular do tecido cerebral em combinação com mancha ocidental oferece vantagens em eletrofisiologia e imuno-histoquímica na identificação de proteínas sinápticas que são alteradas pela ECS. O fraccionamento subcelular do tecido cerebral é um método rápido e bruto de bioquímico para separar proteínas citosólica solúveis (fração S2) de membranas brutas (fração P2), incluindo membranas ER e Golgi, membrana-limite organelles, membranas de plasma, e membranas de terminais sinápticas que selar novamente a forma sinaptossomas42,,43,44. A fração PSD pode ainda ser isolado da fração P2 para enriquecer a proteínas sinápticas42,,43,44. A análise proteômica imparcial da fração PSD poderia identificar todas as proteínas do PSD, cujos níveis são alterados por ECS. Mancha ocidental pode ser realizada rapidamente para examinar as alterações de expressão das proteínas do PSD, que podem ser facilmente identificadas de faixas não específicas.
O método anterior de fracionamento do cérebro requer uma grande quantidade de cérebro de roedor tecido42,,43,44, tornando esta técnica desafiadora para uso ao examinar solúvel ou proteínas de membrana de um indivíduo cérebro de roedor ou uma região específica do cérebro de um único cérebro. Há uma crescente demanda para comparar quantitativamente a proteoma da região do cérebro de um para outro e de um animal de controle para um animal geneticamente modificado ou de um animal que foi submetida a um tratamento específico. Portanto, temos revisto e aperfeiçoado o método de fracionamento de cérebro tradicional para isolar brutas frações solúveis e membrana de duas hipocampo de rato único. Nosso protocolo de fracionamento de petróleo em pequena escala com sucesso isolado bruto P2 fracções de membrana de citosólica S2 frações solúveis, como indicado pela falta de proteínas citoplasmáticas α-tubulina em frações P2, Considerando que a membrana-limite PSD95 foi detectada na P2 mas não S2 frações (Figura 3A e 4 figuraA). Usando o método descrito aqui, quantitativamente demonstrámos que ECS aguda significativamente aumenta a expressão de61 etapa e diminui a fosforilação da tirosina de seus substratos, GluN2B e a extracelular sinal-regulado da quinase 1/2 em petróleo fração de membrana P2 do hipocampo de rato a 48 h após aguda ECS10.
Inesperadamente, as frações de S2 continham Sinaptofisina; PASSO61; e, em menor medida, GluA2 (Figura 3A e 4 figuraA). PASSO61 é um glicosilados integral de membrana proteínas26 associados com o retículo endoplasmático (ER) e PSD45. É possível que a centrifugação para isolar a pelota crua de membrana (fração P2) pode não ter sido suficiente para todas as vesículas sinápticas contendo sinaptossomas, bem como os endossomos de pelotas e lisossomos contendo GluA2 e passo61. Claro, no entanto, enriquecimento de GluN2B, GluA2 e PSD95 e a falta de α-tubulina nas fracções P2 indicam que nosso protocolo de fracionamento pode enriquecer as proteínas de membrana-limite e proteínas transmembrana que não estão associadas com vesículas sinápticas e endossomos na fração de membrana bruto P2.
Embora a fração de P2 bruto membrana contém sinaptossomas, uma limitação de examinar alterações de atividade-dependente de proteínas sinápticas na fração P2 é que não pode ser determinada a localização exata de suas alterações. Se determinado proteínas sinápticas enriquecidas no PSD, mais bioquímico fracionamento pode ser usado para isolar o PSD. O método anterior de fracionamento PSD requer uma grande quantidade de tecido cerebral de roedores (i.e., cérebro de roedor de 10-20) e4443,42,, gradientes de sacarose. Porque esse método tradicional é insuficiente para isolar uma quantidade suficiente da fração de dois hipocampo de rato único PSD, adaptámos um método mais simples que isola diretamente a fração do PSD, sem uma sacarose gradiente20,21 . Este método produz sobre 30-50 µ g da proteína do PSD, suficiente para vários ensaios bioquímicos, incluindo a mancha ocidental. Nosso método enriquece, PSD95, GluN2B e GluA2, que são sabidos para ser concentrada na fração de PSD e detecta alterações na expressão de GluN2B, na fração do PSD após indução de ECS crônica (Figura 3 e Figura 4).
Aqui, nossa análise quantitativa Western blot não revelou nenhuma mudança significativa na expressão de GluA2 nas fracções P2 e PSD às 3 h e 24 h após ECS aguda (Figura 3C). A expressão GluN2B foi inalterada na fração P2 mas exibido uma tendência crescente na fração de PSD em 3 h e 24 h depois da ECS aguda (Figura 3B), sugerindo a possível regulação diferencial da sináptica contra extrasynaptic GluN2B-contendo receptores NMDA. Observou-se também que GluN2B expressão exibida uma tendência decrescente na fração P2 depois ECS crônica e foi significativamente reduzida na fração PSD a 24 e 96 h após ECS crônica (Figura 4B). Embora altamente especulativos, tal remoção de GluN2B do PSD após indução repetitiva de ECS pode ser mediada por vários mecanismos, incluindo internalização direta de difusão de membrana ou lateral do PSD para sites extrasynaptic. Considerar nosso relatório anterior essa melhoria prolongada de atividade neuronal marcadamente aumenta a expressão de61 passo e reduz Tyr-fosforilação de GluN2B nas fracções P2 de neurônios hippocampal cultivadas46, nossos resultados sugerem que uma diminuição na expressão de GluN2B em P2 e as frações do PSD depois ECS crônica pode ser provável devido ao avançado passo61 expressão e a posterior remoção de GluN2B da membrana extrasynaptic.
Em resumo, temos demonstrado que nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala, em combinação com um protocolo de indução de ECS, nos permite diferenciar na vivo o Regulamento dependente da atividade dos receptores de glutamato na membrana pós-sináptica contra membranas de plasma totais, incluindo as membranas extrasynaptic. Este protocolo pode facilmente ser aplicado a qualquer proteínas sinápticas em sinapses excitatórias e pode ser modificado para outros roedores hipocampo ou outras regiões do cérebro, ajustando o volume de cada solução com base no peso do tecido. Assim, nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala é versátil e pode ser adotado para futuros aplicativos examinar as alterações na vivo nas proteínas pós-sinápticas em cada animal após tratamento genético, farmacológico ou mecânico.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores agradecer Dr. Eric C. Bolton por nos permitir usar sua centrífuga para fracionamento e Dr. Graham H. Diering no laboratório do Dr. Richard L. Huganir Universidade de John Hopkins, nos fornecer o protocolo de pequena escala para o fraccionamento do PSD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
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