Summary
Pancreas islet mikrovaskulære hjerte regulerer islet blod distribution og vedligeholder den fysiologiske funktion af holmen β celler. Denne protokol beskriver ved hjælp af en laser Doppler skærm til at bestemme den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte i vivo og at vurdere bidragene fra pancreas islet mikrocirkulationen pancreas-relaterede sygdomme.
Abstract
Som funktionelle status af mikrocirkulationen er mikrovaskulære hjerte vigtigt for levering af ilt og næringsstoffer, og fjernelse af kuldioxid og affaldsprodukter. Værdiforringelse af mikrovaskulære hjerte kan være et afgørende skridt i udviklingen af mikrocirkulationen-relaterede sygdomme. Derudover er meget vaskulariserede pancreas Holmen tilpasset til at støtte endokrine funktion. I denne henseende forekommer det muligt at udlede, at den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte kan påvirke pancreas islet funktion. Analysere de patologiske ændringer af den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte kan være en mulig strategi at bestemme bidrag at pancreas islet mikrocirkulationen gør til relaterede sygdomme som diabetes mellitus, pancreatitis, osv. Derfor, denne protokol beskriver ved hjælp af en laser Doppler blod flow skærm til at bestemme den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte, og at fastsætte parametre (herunder gennemsnitlige blod perfusion, amplitude, frekvens og relativ hastigheden af pancreas islet mikrovaskulære hjerte) til evaluering af microcirculatory funktionelle status. I en streptozotocin-induceret diabetisk musemodel konstaterede vi en nedsat funktionel status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte. Afslutningsvis kan denne tilgang til vurdering af pancreas islet mikrovaskulære hjerte i vivo afsløre mekanismer vedrørende pancreas islet sygdomme.
Introduction
Som en parameter i den funktionelle status af mikrocirkulationen, mikrovaskulære hjerte tager ansvar for levering og udveksling af ilt, næringsstoffer og hormoner og er afgørende for fjernelse af metaboliske produkter, såsom kuldioxid og celle affald 1. mikrovaskulære hjerte også regulerer blod flow distribution og væv perfusion, derved påvirker lokale microcirculatory blodtryk og svar til inflammation, som kan fremkalde ødem i mange sygdomme. Mikrovaskulære hjerte er derfor yderst vigtigt at opretholde den fysiologiske funktion af organer2,3,4, væv og celler, komponent. Værdiforringelse af mikrovaskulære hjerte kan være en af de vigtigste skridt i udviklingen af mikrocirkulationen-relaterede sygdomme5.
Laser Doppler blev oprindeligt udviklet til observation og kvantificering i feltet af mikrocirkulationen forskning6. Denne teknik, sammen med andre tekniske tilgange (f.eks. laser speckle7, transkutan ilt, osv.) er blevet betragtet som den gyldne standard for vurdering af blodgennemstrømningen i mikrocirkulationen. Rationalet at blod perfusion af lokale mikrocirkulationen (dvs. kapillærer, arterioler, venules, etc.) kan bestemmes ved apparatet udstyret med laser Doppler, er baseret på Doppler Skift princip. Bølgelængde og frekvens af stimuleret emission lys ændre når lys partikler støder bevægelige blodlegemer i microvessels, eller de forbliver uændrede. Derfor, i mikrocirkulationen, antallet og hastigheden af blodlegemer er de vigtigste faktorer vedrørende omfang og hyppighed distribution af Doppler-skiftet lyset, mens retningen af mikrovaskulære blodgennemstrømningen er irrelevant. Ved hjælp af forskellige metoder, en bred vifte af væv har været brugt i microcirculatory undersøgelser, herunder mesenteries og dorsal skinfold kamre af mus, rotter, hamstere, og endda mennesker8. Men i den nuværende protokol, vi fokuserer på den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte, som evalueres ved hjælp af laser Doppler og en hjemmelavet parameter evalueringssystem.
Pancreas islet mikrocirkulationen er hovedsageligt sammensat af pancreas Holmen microvessels og udstiller særpræg. En bugspytkirtlen islet kapillære netværk viser en fem gange højere tæthed end den kapillære netværk af dens eksokrine modstykke9. At give en kanal for levering af input glukose og udbrede insulin, levere Holmen endotelceller ilt til metabolisk aktive celler i Holmen β celler. Desuden viser nye beviser også at Holmen microvessels er involveret i reguleringen af insulin Gen-ekspression og β-celle overlevelse, men også i påvirker β-celle funktion; fremme af β-celle spredning; og producerer en række vasoaktive, angiogene stoffer og vækstfaktorer10. Derfor i denne henseende udlede vi at den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte kan påvirke islet β-celle funktion og blive involveret i patogenesen af sygdomme som akut/kronisk betændelse i bugspytkirtlen, diabetes og andre bugspytkirtel-relaterede sygdomme.
Analysere de patologiske ændringer af den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte kan være en mulig strategi at bestemme bidrag af pancreas islet mikrocirkulationen til de sygdomme, der er nævnt ovenfor. En detaljeret, trinvis fremgangsmåde beskriver den tilgang til at bestemme i bugspytkirtlen islet mikrovaskulære hjerte i vivo give her. Typiske målinger vises derefter i Repræsentative resultater. Endelig, fordele og begrænsninger af metoden, der er fremhævet i diskussionen, sammen med yderligere programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev henrettet i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, regler og reguleringsorganer. Denne protokol bliver demonstreret blev udført under vejledning og godkendelse af de Institute af mikrocirkulationen dyr etiske udvalg (IMAEC) på Peking Union Medical College (PUMC).
1. dyr
- Før starten af eksperimentet, holde tre BALB/c mus pr. bur med kontrolleret temperatur (24 ± 1 ° C) og fugtighed (55 ± 5%), under en 12-h lys-mørke cyklus. Give musene gratis adgang til almindelig mad og vand.
- Tilfældigt opdele musene i en ikke-diabetisk kontrol og en diabetisk gruppen. Præcist vejer hver individuelle mus og beregne Injektionsvolumen bruger kroppen massen af hver mus.
- Hurtig mus til 4 h før streptozotocin (STZ) injektion og levere regelmæssig vand som normalt på eksperimenterende dag 1.
- Forberede 0,1 M natrium citratbuffer pH-værdi på 4,3. Iværksætte en 1,5 mL microcentrifuge tube 1 mL af opløsningen, og wrap microcentrifuge tube i aluminiumsfolie at undgå lys eksponering.
- Opløse STZ i natrium citratbuffer (pH 4.3) til en slutkoncentration arbejder på 5 mg/mL før brug.
- Give mus af diabetisk gruppe intraperitoneal injektioner af STZ i en dosis på 40 mg/kg ved hjælp af en 1-mL sprøjte og en 25-G kanyle. Injicere mus i kontrolelementet ikke-diabetikere med den samme mængde natrium citratbuffer (pH 4.3).
- Sætte mus tilbage i bure og forsyne dem med almindelig mad og 10% saccharose vand.
- Gentag trin 1.3-1.7 på eksperimentelle dage 2 til 5 (dvs. de næste 4 dage i træk).
- Erstatte 10% saccharose-vand med almindeligt vand efter den sidste STZ injektion.
- Hurtig mus til 6 h, men give dem fri adgang til vand, og måle deres blodsukker ni dage senere (eksperimentel dag 14). Indsamle en blodprøve fra hale vene at bekræfte hyperglykæmi ved hjælp af en blod glucose overvågningssystem.
Bemærk: Mus med blod glucose niveauer > 200 mg / dL betragtes diabetisk.
2. forberedelse af instrumentet
- Ren de optiske overflader af sonden tip og sonde stik af laser Doppler apparater med en blød, ikke-slibende klud til at fjerne støv eller partikler. Sæt kablet i porten på instrument (figur 1A).
- Samle kalibrering stå ved at tillade flux standard til at være i termisk ligevægt med eksperimentelle omgivelser (stuetemperatur, normalt for 30 min). Ryste flux standard blidt i 10 s og lad det hvile i 2 min.
- Anbring flux standard container i midten af kalibrering base. Justere klemme til den maksimale højde og sikre sonden i klemme, så det peger nedad på beholder. Kontroller, at flux standard er korrekt placeret nedenunder sonden.
- Langsomt flytte sonden, indtil spidsen er korrekt nedsænkes i flux-standarden. Vælg og tryk på "kalibrering" på laser Doppler apparater og vælge den arbejdende kanal, at sonden er forbundet til. Køre programmet kalibrering, indtil en meddelelse om "Kalibrering vellykket" vises på skærmen på laser Doppler apparater.
- Sikre sonden ved hjælp af sonde indehavere. Manuelt sikre sonde for at undgå bevægelser.
- Opretholde den eksperimentelle rum ved konstant temperatur (24 ± 1 ° C) og fugtighed (~ 50-60%).
- Slukke enhver ekstern lys (f.eks. lysstofrør og spot lamper) før du udfører eksperiment for at undgå ekstern lys-induceret ændring.
3. forberedelse af dyrene
- Autoklave den kirurgiske instrumenter og lad dem afkøle til stuetemperatur før anvendelse.
- Give musene 10 min at akklimatisere til de eksperimenterende miljø før afsløring i bugspytkirtlen islet mikrovaskulære hjerte af laser Doppler.
- Fyld en 1-mL sprøjte med 1 mL 3% pentobarbital natrium. Injicere pentobarbital natrium løsning (75 mg/kg i.p.) for at bedøver musene.
- Dække mus med pre fugtede medicinsk gaze til at forhindre tørhed øjne.
- Sikre at musen helt mister bevidstheden og ikke længere reagerer på hale eller bagfod klemmer med pincet. Overvåge anæstesi i hele den bedøvende og intra-operative begivenhed hver 15 min. vedligehold anæstesi ved at supplere med 10% af den oprindelige Injektionsvolumen pentobarbital opløsning når det er nødvendigt.
- Placer en varmepude med en semi-isolerende lag under dyret og placere dyret i liggende stilling og overføre det til arbejds station af laser Doppler apparater. Lave mus hen til arbejde platform med kirurgisk tape.
- Vatpind abdominal huden af mus med betadine, og derefter 75% ethanol bruges til svaber maveregionen ren.
- Injicere 2% lidocaine/0.5% bupivacaine (50/50) blanding subkutant. Skære en ~ 3 cm-diameter hul i midten af en gaze svamp. Dække bughulen med gaze svamp.
- Løft den abdominale hud med pincet og foretage en indledende lodrette indsnit langs midterlinjen i maven ved hjælp af en skalpel eller hud saks.
- Forstå de underliggende muskler med pincet og incise for at komme ind i bughulen. Ikke såre nogen organer. Fold huden og underliggende muskler over brystet til at afsløre i bughulen. Forsigtigt udsætte den pancreas krop og milten ved hjælp af en stump-næse pincet.
4. dataindsamling til analyse
- Opstille programmet af laser Doppler apparatet ved at klikke på "File" → "New" for at oprette en ny måling fil. Hvis du vil konfigurere de tilsluttede skærme under fanen "Generelt" oprette overvågning varighed "Gratis køre." Bruge fabriksindstilling for "LDF skærm" tab. falde i hak "Næste".
- Oprettet grafvisning i "display installationsdialogboksen." Vælg "Flux, konc, hastighed" kanaler ved at kontrollere de respektive bokse. Vælg følgende parametre: "Datakilde for kanalen" og "etiket, enheder og farve." Klik på "Næste".
- Indtast brugeroplysninger om emnet og måling (dvs. navn og emne nummer, operatør, overvågning tid, kommentarer, osv.) i "fil information dialog boks" og klik på "Næste" for at afslutte konfigurationen af måling.
Bemærk: En måling vindue oprettes automatisk af software (figur 1B). - Manuelt rykke elektroden på bugspytkirtlen. Kontroller afstanden mellem sonde og bugspytkirtlen væv er inden for 1 mm. En uhensigtsmæssig afstand giver et kunstigt øget eller nedsat blod flow læsning.
- Klik på "Start" værktøjslinjen ikonet for at starte optagelsen mikrovaskulære blod perfusion enheder (PU) data. Indsamle PU data kontinuerligt i 1 min. hvert løb. Klik på "Stop" for at standse målingen. Vælg "Fil" → "Gem som" at navn og gemme det færdige måling.
- Manuelt flytte sonden efter hvert løb at undgå additiv effekt og lokaliserede konsumption af kontraktile og afslapning kapacitet. Gentag trin 4.1-4.4 for at høste multi-point (dvs. tre tilfældigt valgte punkter fra pancreas væv) mikrovaskulære PU data for hver mus. Måle PU data fra en ikke-reflekterende plade som en baseline kontrol.
- Luk mavemuskel lag og huden lag med en sutur. Placer dyrene i ren bure efter forsøgene.
- Holde den animalske varme ved at placere opsving bur halv-på den hede afrivningsblok.
Bemærk: Opmærksomme på varme, hygiejne, væske og fødeindtagelse og infektion. Administrere mus med 2 mg/kg Carprofen for 48 h som postoperativ smertebehandling. Udføre eutanasi ved at indsprøjte 150 mg/kg pentobarbital natrium i.p., når musene er observeret for at være i en tilstand af svære smerter eller nød, der ikke kan afhjælpes.
5. beregning af parametre af mikrovaskulære hjerte
- Brug kommandoen "Eksport" af laser Doppler software til at eksportere tid og PU rå data som *.xlsx fil og åbne filen i et regneark.
- Beregner den gennemsnitlige baseline perfusion enhed (PUb) (Se trin 4.6).
- Beregner den gennemsnitlige blod perfusion (PUen) for 1 min af en måling som følger: gennemsnitlig blod perfusion (PUen) = PU - PUb (ligning 1).
- Beregne frekvens (cyklusser/min.) i hver 1 minut af måling.
Bemærk: Hyppigheden af mikrovaskulære hjerte er defineret som antallet af toppe, der fandt sted i en mikrovaskulære hjerte bølge pr. minut. - Beregne amplitude (ΔPU) for hver 1 min af måling.
- Beregne amplitude af mikrovaskulære hjerte som forskellen mellem den maksimale (PUmax) og minimum (PUmin): Amplitude (ΔPU) = PUmax - PUmin (ligning 2).
- Beregne den relative hastighed (PU) i hver 1 minut af måling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et fotografi af mikrovaskulære hjerte måling laser Doppler apparatet udstyret med en halvleder laserdiode er vist i figur 1A. Bruger interface software er præsenteret i figur 1B. Ved hjælp af den metode nævnt ovenfor, blev de hæmodynamiske parametre af pancreas islet mikrovaskulære hjerte opdaget for både ikke-diabetisk kontrol og diabetisk mus. En række teknikker, herunder laser Doppler flowmetry, afspejles og spredt lys, infrarød spektroskopi, og billedbehandling teknikker, er blevet brugt til at studere mikrovaskulære hjerte, da det først blev defineret. Tabel 1 sammenfatter forskningsgrupper og publicerede artikler, bruger laser Doppler teknologi til at fastslå rollen af mikrocirkulationen i diabetes og beslægtede sygdomme.
Generelt, er de microcirculatory betingelser af pancreas Holmen repræsenteret ved den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte ved hjælp af mikrovaskulære parametre, herunder gennemsnitlige blod perfusion, amplitude og frekvens slægtning hastighed (figur 2). Repræsentative mikrovaskulære hjerte skematisk diagram består hovedsageligt af periodiske sammentrækning og afslapning faser (figur 2A). De hæmodynamiske fænomener præsentere et mønster af blod flow perfusion i mikrovaskulære netværk. PU data indsamlet ved hjælp af laser Doppler apparater var ansat diagram scatter diagrammer og vise fordeling mønster af mikrovaskulære blod perfusion. I den nuværende protokol var spredningsmønstre for pancreas islet mikrovaskulære blod perfusion i ikke-diabetes og diabetisk mus helt anderledes (figur 2B). En lavere skala af blod perfusion af pancreas islet mikrovaskulære hjerte blev observeret i diabetisk mus i forhold til kontrolelementet ikke-diabetikere. Rytme af sammentrækninger og lempelser af pancreas islet mikrovaskulære hjerte var kaotisk og uregelmæssig i STZ-induceret diabetisk mus, mens ikke-diabetikere kontrol havde rytmiske svingninger (figur 2 c og figur 2D). Vi udtrukket de 5-s data af pancreas islet mikrovaskulære blod perfusion inden for de stiplede linjer i figur 2 c og figur 2D og demonstreret, at de kaotiske udsving af pancreas islet mikrovaskulære blod perfusion i diabetisk mus mistet evnen til at regulere den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte, som skulle opstå svar blod glukose fluctuation (figur 2E).
Endvidere, for at reagere på hyperglykæmi, pancreas Holme nødvendigt yderkablerne og biorhythmic blod trykforøgelsesanlæg perfusion at transportere insulin. Pancreas islet mikrovaskulære hjerte parametre (herunder gennemsnitlige blod perfusion, amplitude, frekvens og relativ hastighed) blev derefter beregnet og analyseret kvantitativt baseret på PU profiler. Som vist i figur 3, sammenlignet med ikke-diabetisk kontrol, faldt den gennemsnitlige blod perfusion af pancreas islet mikrocirkulationen i STZ-induceret diabetisk mus (figur 3A). I mellemtiden var der betydelig falder i amplitude (figur 3B) og frekvens (figur 3 c) af pancreas islet mikrovaskulære hjerte i STZ-induceret diabetisk mus. Den relative hastighed af pancreas islet blod perfusion faldt betydeligt i STZ-induceret diabetisk gruppen sammenlignet med ikke-diabetisk kontrol (figur 3D). Som nævnt ovenfor, blev den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte nedsat i diabetisk mus. Vi spekulere at rytme abnormiteter, sammen med en nedsat frekvens og amplitude, relative hastighed af pancreas islet mikrovaskulære hjerte, kan resultere i en deficiency af mikrovaskulære blod perfusion, som kan skade ø β-celler og reducere insulinsekretion.
Figur 1. Apparater, der anvendes til at bestemme i bugspytkirtlen islet mikrovaskulære hjerte i vivo. A. fotografi af måling apparatet bruges til at bestemme i bugspytkirtlen islet mikrovaskulære hjerte af mus. Sonden sockets og laser switch knap er i panelet til venstre. Flydende krystaldisplay er i det midterste panel. Menu-knapperne (dvs. op, ned, og Angiv knapper) og power light - emitting diode er i højre panel. De perifere enheder (dvs., computere og kabler) er ikke vist. B. Screenshot illustrerer de typiske elementer og graf kanaler af laser Doppler apparater software. "Flux", "Konc,", "DC," og "Hastighed" måling aflæsninger vises i graf-kanaler. "Flux" repræsenterer væv mikrovaskulære blod perfusion, "Konc" repræsenterer væv mikrovaskulære blodlegemer koncentration, "DC" repræsenterer den gennemsnitlige intensitet er reflekterende, og "Hastighed" repræsenterer den relative hastighed af mikrovaskulære blodgennemstrømningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte i mus. Blod perfusion af pancreas islet mikrovaskulære hjerte blev vurderet af en laser Doppler apparater, og den funktionelle status blev analyseret. A. skematisk af parametre vedrørende mikrovaskulære hjerte. AC repræsenterer amplitude af en mikrovaskulære hjerte sammentrækning, Ar repræsenterer amplitude af en mikrovaskulære hjerte afslapning, Tc repræsenterer varigheden af en mikrovaskulære hjerte sammentrækning og Tr repræsenterer længden af tid af en mikrovaskulære hjerte afslapning. B. fordeling mønster af pancreas islet mikrovaskulære blod perfusion i ikke-diabetes og diabetisk mus. Røde prikker: ikke-diabetiske mus. Blå prikker: diabetisk mus. Den stiplede grønne linje viser afgrænsningen mellem ikke-diabetes og diabetisk mikrovaskulære blod perfusion mønster. C. i bugspytkirtlen islet mikrovaskulære hjerte i kontrolgruppen blev vurderet på grundlag af den dynamiske mikrovaskulære perfusion af blod trykforøgelsesanlæg. D. i bugspytkirtlen islet mikrovaskulære hjerte i diabetisk mus blev vurderet på grundlag af den dynamiske mikrovaskulære perfusion af blod trykforøgelsesanlæg. E. Diagram af repræsentant (5-s række) i bugspytkirtlen islet mikrovaskulære hjerte mellem ikke-diabetisk kontrol og diabetisk mus. Rød linje: ikke-diabetisk kontrol. Blå linje: diabetisk mus. PU: perfusion enheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Quantification af parametrene for pancreas islet mikrovaskulære hjerte. Pancreas islet mikrovaskulære hjerte parametre, herunder gennemsnitlige blod perfusion, amplitude, hyppighed og relativ hastighed blev analyseret og sammenlignet mellem ikke-diabetisk kontrol og diabetisk mus. A. Quantification af gennemsnitlige blod perfusion (PU/min) af pancreas islet mikrovaskulære hjerte hos ikke-diabetiske og diabetisk mus. B. amplitude (ΔPU), C. frekvens (cyklusser/min.) og D. relative hastighed (PU) af pancreas islet mikrovaskulære hjerte var lavere i diabetisk mus end hos ikke-diabetiske kontrol mus. Amplituden af mikrovaskulære hjerte blev beregnet som forskellen mellem den maksimale (PUmax) og minimum (PUmin). Hyppigheden af mikrovaskulære hjerte var defineret som antallet af toppe og dale, der fandt sted i en mikrovaskulære hjerte bølge pr. minut. Dataene blev præsenteret som den gennemsnit ± SD (n = 6 i hver gruppe). P < 0,05, **P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Sygdomme | Objekt | Apparater | Refs nr. |
| Endotelfunktion | H | LDF, LSCI | 11, 12, osv. |
| DN | H, RASMUSSEN | LDF | 13, 14, 15, osv. |
| DR | H | LDF | 16, 17, 18, osv. |
| Hud/kutane mikrocirkulationen | H | LDF | 11, 19, 20, osv. |
| Hjerte mikrocirkulationen | RASMUSSEN | LDF | 21 |
| Nedsat hørelse | M | LDF | 22 |
| DN, diabetisk neuropati. DR, diabetisk retinopati. LDF, laser Doppler flowmetry. | |||
| LSCI, laser speckle kontrast billeddannelse. Rasmussen, rotte. Hansen, menneskelige, M, mus. | |||
Tabel 1. Rollen af mikrocirkulationen i diabetes og dens komplikationer. Forskergrupper har brugt laser Doppler til at bestemme rollen af mikrocirkulationen i diabetes og dens komplikationer i årtier. Relaterede artikler i de seneste år er listet her. Disse offentliggjorte artikler fokusere hovedsagelig på endotel dysfunktion, diabetisk neuropati (DN), diabetisk retinopati (DR), hud og kutane mikrovaskulære værdiforringelse og relativt sjældne komplikationer såsom hjerte mikrocirkulationen dysfunktion og høring værdiforringelse. DN: diabetisk neuropati. DR: diabetisk retinopati. LDF: laser Doppler flowmetry. LSCI: laser speckle kontrast billeddannelse. R: rotte. H: menneskelige. M: mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de tilfælde, der involverer mikrovaskulære dysfunktion (f.eks. diabetes, akut pancreatitis, perifere mikrovaskulære sygdomme, osv.), føre visse sygdomme til nedsat blodgennemstrømning. Bortset fra ændringer i blodgennemstrømningen er der vigtige indikatorer, såsom mikrovaskulære hjerte, der afspejler den funktionelle status af mikrocirkulationen. Den specifikke indikator, mikrovaskulære hjerte, defineres normalt som svingningerne i mikrovaskulære tonen i mikrovaskulære senge. I den nuværende protokol, en mikrovaskulære blod perfusion overvågningssystem giver mulighed for direkte visualisering og kvantitativ analyse af de funktionelle status af mikrovaskulære hjerte. Vores microcirculatory evaluering tilgang kan anvendes selektivt til målrettet væv og organer ved at identificere dynamiske ændringer i blod perfusion. Rapporter udgivet af andre grupper om at bruge laser Doppler til at bestemme rollen af mikrovaskulære blod perfusion i diabetes og dens komplikationer er opsummeret i tabel 1. I den aktuelle undersøgelse, for at demonstrere vores tilgang, blev funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte af diabetisk mus evalueret.
Mikrovaskulære hjerte er anerkendt som en parameter i den funktionelle status af mikrocirkulationen og er i stand til at regulere blod flow perfusion ved at justere fordelingen i lokale væv23. Microvasculature i bugspytkirtlen, som kan opdeles i Holme, acini og kanaler, er blevet undersøgt i årtier. Dybest set, denne adskillelse af bugspytkirtlen i forskellige dele er for nemheds skyld kun fordi microvasculature er faktisk sammenkoblede og ensartet som en organisk enhed24. Denne microvasculature netværk understøtter regulering af pancreas islet blodgennemstrømning. Dermed, vi brugte parametre af funktionelle status, som bestemmes af laser Doppler, til at repræsentere i bugspytkirtlen Holmen microvasculature hjerte. Men på grund af pancreas arkitektur egenskaber vi stadig undladt at gøre en dom efter anvendelse af den nuværende metode for at fastslå, om blod perfusion er afledt fra den endokrine del eller den eksokrine del af bugspytkirtlen. Ved hjælp af holmen-specifik kan mærkning farvestoffer, som dithizone og neutral red, blive en af de mulige måder at forstå dette problem, i det mindste til en vis grad.
Et vigtigt aspekt af trinnet måling er afstanden mellem sonden og bugspytkirtlen væv. En uhensigtsmæssig afstand giver et kunstigt øget blodgennemstrømning læsning. Den fysiske kraft til væv og orgel af en sonde tip vil reducere mikrovaskulære blodgennemstrømningen. Minimal tryk skal derfor anvendes, når måltagning. Et andet punkt at bemærke er magten af lasere. Bølgelængde lasere generelt skade let microvessels i bugspytkirtlen Holmen, så hyppigheden af laserstrålen skal kontrolleres, inden for begrænsninger. For generelle og tidsmæssige målinger anbefales en frekvens på 1 Hz eller derunder. For at undgå den lokaliserede konsumption af mikrovaskulære hjerte kapacitet (herunder kontraktile og afslapning) og den additive effekt, er multipoint beslutsomhed og repositionering websted efter hver måling foreslog i eksperimenter.
I den aktuelle metode bruges PU data til at repræsentere blod flux af mikrovaskulære blodgennemstrømningen. På grund af mikrovaskulære blodgennemstrømningen i mikrocirkulationen egenskaber er det ikke muligt at fastslå absolutte flow enheder (f.eks., mL/min/100 g af specifikke organer eller væv). Derfor, den parameter evalueringssystem bruges her er baseret på relative blod flow perfusion enheder. Wavelet analyse, hurtig Fouriertransformation og andre spektralanalyse algoritmer er almindelige metoder, der udfører laser Doppler signaler. I denne protokol etableret vi en tilgang, der bruger hæmodynamiske parametre (dvs. blod perfusion, amplitude, frekvens og relativ hastighed) til at vise den funktionelle status af mikrovaskulære hjerte. Derudover er nøjagtighed i målingen relateret til dybden af målet og sonde-design, som er generelt omkring 1 mm. Derfor, tykkere eller kompakt organer og væv muligvis ikke er relevant for anvendelsen af laser Doppler og for den nuværende metode. Derudover, fordi de data der stammer fra blod flow perfusion kunne påvirkes af andre forhold, der forårsager mærkbare ændringer, herunder temperatur, luftfugtighed, lys udefra, og ændringer i placeringen af mus, skal nogle regler adlydes under de eksperimenterende sagen. Laboratoriet skal opretholde konstant temperatur og fugtighed, og eksterne belysning skal være Afskærmet. Det anbefales at lave mus for at undgå ændringer i position. Det menes, at disse strategier kan overvinde de begrænsninger, der er nævnt ovenfor og vil øge nøjagtigheden af blod flow perfusion data.
Fordelen ved denne protokol sammenligne med andre rapporteret i litteratur er, at det er følsomme og lydhøre over for de lokale mikrovaskulære hjerte væv og organer. Dette vil lette den bredere anvendelse af metoden til vurdering eller undersøgelse af mikrocirkulationen, især den funktionelle status af mikrovaskulære hjerte, i både klinisk og laboratorial forskning. Programmerne omfatter, men er ikke begrænset til: iskæmi visualisering, blod perfusion vurdering og evaluering af den funktionelle status af mikrovaskulære hjerte. Afslutningsvis, vores metode kan bruges til at undersøge og evaluere den funktionelle status af pancreas islet mikrovaskulære hjerte i mus i vivo og kan være i stand til at opfylde de kliniske behov for at vurdere mikrocirkulationen funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Peking Union Medical College Ungdom fonden og den grundlæggende forskningsmidler til Central universiteter (Grant nr. 3332015200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoorVMS-LDF2 | Moor Instruments | GI80 | PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data |
| MoorVMS-PC Software | Moor Instruments | GI80-1 | Software of MoorVMS-LDF2 |
| Calibration stand | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration base | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration flux standard | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| One Touch UltraEasy glucometer | Johnson and Johnson | #1955685 | Confirm hyperglycemia |
| One Touch UltraEasy strips | Johnson and Johnson | #1297006 | Confirm hyperglycemia |
| Streptozotocin | Sigma-Aldrich | S0130 | Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3) |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Working concentration 3 % |
| Ethanol | Sinopharm Inc. | 200121 | Working concentration 75 % |
| Sucrose | Amresco | 335 | Working concentration 10 % |
| Medical gauze | China Health Materials Co. | S-7112 | Surgical |
| Blunt-nose forceps | Shang Hai Surgical Instruments Inc. | N-551 | Surgical |
| Surgical tapes | 3M Company | 3664CU | Surgical |
| Gauze sponge | Fu Kang Sen Medical Device CO. | BB5447 | Surgical |
| Scalpel | Yu Lin Surgical Instruments Inc. | 175C | Surgical |
| Skin scissor | Carent | 255-17 | Surgical |
| Suture | Ning Bo Surgical Instruments Inc. | 3325-77 | Surgical |
| Syringe and 25-G needle | MISAWA Inc. | 3731-2011 | Scale: 1 ml |
References
- Aalkjaer, C., Nilsson, H. Vasomotion: cellular background for the oscillator and for the synchronization of smooth muscle cells. Br J Pharmacol. 144 (5), 605-616 (2005).
- Serne, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., IJzerman, R. G., Stehouwer, C. D. Microvascular dysfunction: a potential pathophysiological role in the metabolic syndrome. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
- Carmines, P. K. Mechanisms of renal microvascular dysfunction in type 1 diabetes: potential contribution to end organ damage. Curr Vasc Pharmacol. 12 (6), 781-787 (2014).
- Holowatz, L. A. Human cutaneous microvascular ageing: potential insights into underlying physiological mechanisms of endothelial function and dysfunction. J Physiol. 586 (14), 3301 (2008).
- De Boer, M. P., et al. Microvascular dysfunction: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Microcirculation. 19 (1), 5-18 (2012).
- Nilsson, G. E., Tenland, T., Oberg, P. A. Evaluation of a laser Doppler flowmeter for measurement of tissue blood flow. IEEE Trans Biomed Eng. 27 (10), 597-604 (1980).
- Chen, D., et al. Relationship between the blood perfusion values determined by laser speckle imaging and laser Doppler imaging in normal skin and port wine stains. Photodiagnosis Photodyn Ther. 13 (1), 1-9 (2016).
- Fuchs, D., Dupon, P. P., Schaap, L. A., Draijer, R. The association between diabetes and dermal microvascular dysfunction non-invasively assessed by laser Doppler with local thermal hyperemia: a systematic review with meta-analysis. Cardiovasc Diabetol. 16 (1), 11-22 (2017).
- Yaginuma, N., Takahashi, T., Saito, K., Kyoguku, M. The microvasculature of the human pancreas and its relation to Langerhans islets and lobules. Pathol Res Pract. 181 (1), 77-84 (1986).
- Brissova, M., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes beta cell regeneration. Cell Metab. 19 (3), 498-511 (2014).
- de Moraes, R., Van Bavel, D., Gomes Mde, B., Tibirica, E. Effects of non-supervised low intensity aerobic excise training on the microvascular endothelial function of patients with type 1 diabetes: a non-pharmacological interventional study. BMC Cardiovasc Disord. 16 (1), 23-31 (2016).
- Humeau-Heurtier, A., Guerreschi, E., Abraham, P., Mahe, G. Relevance of laser Doppler and laser speckle techniques for assessing vascular function: state of the art and future trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 659-666 (2013).
- Park, H. S., Yun, H. M., Jung, I. M., Lee, T. Role of Laser Doppler for the Evaluation of Pedal Microcirculatory Function in Diabetic Neuropathy Patients. Microcirculation. 23 (1), 44-52 (2016).
- Sun, P. C., et al. Microcirculatory vasomotor changes are associated with severity of peripheral neuropathy in patients with type 2 diabetes. Diab Vasc Dis Res. 10 (3), 270-276 (2013).
- Pan, Y., et al. Effects of PEMF on microcirculation and angiogenesis in a model of acute hindlimb ischemia in diabetic rats. Bioelectromagnetics. 34 (3), 180-188 (2013).
- Jumar, A., et al. Early Signs of End-Organ Damage in Retinal Arterioles in Patients with Type 2 Diabetes Compared to Hypertensive Patients. Microcirculation. 23 (6), 447-455 (2016).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25-33 (2016).
- Forst, T., et al. Retinal Microcirculation in Type 1 Diabetic Patients With and Without Peripheral Sensory Neuropathy. J Diabetes Sci Technol. 8 (2), 356-361 (2014).
- Hu, H. F., Hsiu, H., Sung, C. J., Lee, C. H. Combining laser-Doppler flowmetry measurements with spectral analysis to study different microcirculatory effects in human prediabetic and diabetic subjects. Lasers Med Sci. 31 (1), 1-8 (2016).
- Klonizakis, M., Manning, G., Lingam, K., Donnelly, R., Yeung, J. M. Effect of diabetes on the cutaneous microcirculation of the feet in patients with intermittent claudication. Clin Hemorheol Microcirc. 61 (3), 439-444 (2015).
- Khazraei, H., Shafa, M., Mirkhani, H. Effect of ranolazine on cardiac microcirculation in normal and diabetic rats. Acta Physiol Hung. 101 (3), 301-308 (2014).
- Fujita, T., et al. Increased inner ear susceptibility to noise injury in mice with streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61 (11), 2980-2986 (2012).
- Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14 (4-5), 403-438 (2007).
- Chawla, L. S., et al. Vascular content, tone, integrity, and haemodynamics for guiding fluid therapy: a conceptual approach. Br J Anaesth. 113 (5), 748-755 (2014).
