Summary
Микроваскулярная vasomotion поджелудочной островок регулирует распределение крови островок и поддерживает физиологические функции β островковых клеток. Этот протокол описывает использование лазера Doppler монитора для определения функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в естественных условиях и оценить вклад поджелудочной островок микроциркуляции для заболеваний поджелудочной железы.
Abstract
Как функциональное состояние микроциркуляции микрососудистой vasomotion имеет важное значение для доставки кислорода и питательных веществ и удаление углекислого газа и отходов. Обесценение микрососудистой vasomotion может быть важным шагом в развитии заболеваний, связанных с микроциркуляции. Кроме того весьма васкуляризированной поджелудочной островок адаптирована для поддержки эндокринной функции. В этом отношении представляется возможным сделать вывод, что функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion могут повлиять на функцию поджелудочной островок. Анализ патологических изменений функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion могут быть возможные стратегии для определения взносов что поджелудочной островок микроциркуляции делает для заболеваний, как сахарный диабет, панкреатит, и т.д. Таким образом этот протокол описывает использование лазера Doppler крови потока монитора для определения функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion и установить параметры (включая средняя крови перфузии, амплитуды, частоты и относительной скорость поджелудочной островок микрососудистой vasomotion) для оценки функционального состояния микроциркуляции. В модели Стрептозотоцин индуцированной сахарным диабетом мыши мы наблюдали нарушение функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion. В заключение этот подход для оценки поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в естественных условиях может выявить механизмы, связанные с заболеваниями поджелудочной островок.
Introduction
Как параметр функционального состояния микроциркуляции микрососудистой vasomotion берет на себя ответственность за доставку и обмена кислорода, питательных веществ и гормонов и имеет решающее значение для удаления продуктов обмена, как двуокись углерода и клеток отходы 1. Микроваскулярная vasomotion также регулирует распределение потока крови и перфузии тканей, влияя тем самым на местных микроциркуляторного кровяного давления и ответы на воспаление, которое может вызвать отек во многих заболеваний. Таким образом микрососудистой vasomotion является чрезвычайно важным для поддержания физиологических функций органов2,3,4, тканей и клеток компонента. Обесценение микрососудистой vasomotion может быть одним из ключевых шагов в развитии заболеваний, связанных с микроциркуляции5.
Лазерная допплеровская была первоначально разработана для наблюдения и количественной оценки в области исследования микроциркуляции6. Эта техника, а также другие технические подходы (например, лазерной спекл7, транскутанное кислород, и т.д.), рассматривается как золотой стандарт для оценки потока крови в микроциркуляции. Обоснование, что перфузии крови местных микроциркуляции (то есть, капилляров, артериол, венулы и т.д.) могут определяться Аппарат оснастили лазера Doppler, основана на принципе доплеровского сдвига. Волны и частота простимулированное излучение света изменения когда легкие частицы сталкиваются движущихся клетки крови в микрососудов, или они остаются неизменными. Таким образом микроциркуляции, количество и скорость кровяных клеток являются ключевыми факторами, касающимся масштабов и распределения частоты Doppler смещается света, в то время как направление потока микрососудистой крови не имеет значения. С помощью различных методов, различных тканей были использованы для микроциркуляторного исследований, в том числе мезентерии и спинной складки палаты мыши, крысы, хомяки и даже люди8. Однако, текущий протокол, мы ориентируемся на функциональный статус микрососудистой vasomotion поджелудочной островок, который вычисляется с помощью лазера Doppler и домашние оценки параметров системы.
Поджелудочной островок микроциркуляцию в основном состоит из микрососудов поджелудочной островок и экспонаты отличительные черты. Поджелудочной островок капиллярной сети показывает пять раз выше плотность чем капиллярной сети своей экзокринных коллегой9. Предоставление каналом для доставки ввода глюкозы и инсулина, распространение, эндотелиальные клетки островка доставить кислород метаболически активные клетки в Иле β-клеток. Кроме того новые данные также демонстрирует что островок микрососудов участвуют не только в регулировании экспрессии гена инсулина и β-клеток выживания, но и в затрагивающих функция β-клеток; поощрение распространения β-клеток; и производит ряд вазоактивных, ангиогенных веществ и факторов роста10. Таким образом в этом отношении, мы сделать вывод, что функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion могут повлиять на функцию островок β-клеток и участвовать в патогенезе заболеваний, таких, как острый/хронический панкреатит, сахарный диабет и другие заболеваний, связанных с поджелудочной железы.
Анализ патологических изменений функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion может быть осуществимо стратегией для определения вклада поджелудочной островок микроциркуляции к заболеваниям, упомянутых выше. Здесь предоставляют подробную пошаговую процедуру, описывающих подход для определения поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в естественных условиях . Типичные измерения отображаются в Представитель результаты. Наконец преимущества и ограничения метода будут выделены в ходе обсуждения, наряду с дальнейшей приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были казнены во исполнение всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов. Настоящий протокол продемонстрировал была выполнена под руководством и утверждения из Института из микроциркуляции животных этики Комитета (IMAEC) в Peking союза медицинский колледж (фактические).
1. Животные
- Перед началом эксперимента держите три мышей BALB/c в клетку, с контролируемой температурой (24 ± 1 ° C) и влажности (55 ± 5%), под 12-h свето тени цикла. Разрешить мышей свободный доступ к регулярному питанию и воде.
- Случайным образом разделите мышей на не диабетиков контроля группы и диабетической группы. Точно взвесить каждый индивидуальный мыши и вычислить объем впрыска, с использованием массы тела каждой мыши.
- Быстрая мышей за 4 ч до инъекции Стрептозотоцин (СТЗ) и регулярных водой как нормальный экспериментальный день 1.
- Подготовка буфера цитрата натрия 0,1 М при pH 4,3. Положите 1 мл раствора в 1,5 мл microcentrifuge трубку и завернуть пробки microcentrifuge в алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света.
- Растворите СТЗ в буфере (рН 4,3) цитрат натрия к окончательной рабочей концентрации 5 мг/мл перед использованием.
- Дать мышей диабетической группы внутрибрюшинной инъекции СТЗ в дозе 40 мг/кг 1 мл шприца и иглы 25-G. Придать мышей не диабетиков контроля с такой же объем буфера цитрата натрия (рН 4,3).
- Вернуть мышей в клетки и поставлять их с регулярной еды и воды 10% сахарозы.
- Повторите шаги 1,3-1,7 на экспериментальных дни 2-5 (т.е., следующих 4 дней подряд).
- Замените воду 10% сахарозы с регулярной водой после последней инъекции СТЗ.
- Быстро мышей для 6 h, но дать им свободный доступ к воде и измерить их уровень глюкозы в крови девять дней спустя (экспериментальный день 14). Сбор крови из Вены хвост для подтверждения гипергликемии, используя систему мониторинга глюкозы крови.
Примечание: Мышей с крови глюкозы уровни > 200 мг / дл считается диабетическая.
2. Подготовка документа
- Чистота поверхности оптических наконечника пробоотборника и зонд лазера Doppler аппарата с тканью мягкие, неабразивные соединителю удалите пыль и частицы. Подключите кабель к порту инструмента (рис. 1A).
- Соберите стенд калибровки, позволяя поток стандартных в термодинамическом равновесии с экспериментальной окрестности (комнатной температуры, обычно в течение 30 мин). Встряхнуть поток стандартных нежно за 10 s и пусть отдых на 2 мин.
- Позиция потока стандартного контейнера в середине основания калибровки. Отрегулируйте зажим на максимальную высоту и закрепите зонд в зажим, таким образом, что он вниз указывает на контейнер. Убедитесь, что поток стандарт правильно расположены под зонд.
- Медленно вниз зонд, пока кончик правильно погружен в стандарте потока. Выберите и нажмите кнопку «Калибровка» на лазерные доплеровские аппарат и выбирать рабочий канал, что зонд подключен к. Запустите программу калибровки, до тех пор, пока «Калибровка успешно» извещения отображается на экране Лазерные доплеровские аппарат.
- Закрепите зонд, с помощью держателей зонда. Вручную зафиксируйте зонд, чтобы избежать движения.
- Поддерживать экспериментальные номер при постоянной температуре (24 ± 1 ° C) и влажности (~ 50-60%).
- Выключите любой внешний свет (например, флуоресцентные и спот лампы) перед выполнением эксперимент, чтобы избежать внешних свет индуцированных изменений.
3. Подготовка животных
- Автоклав, хирургические инструменты и дать им остыть до комнатной температуры перед использованием.
- Дать мышей 10 мин для акклиматизации в экспериментальной среде до обнаружения поджелудочной островок микрососудистой vasomotion лазера Doppler.
- Залейте 1 мл шприц 1 мл 3% Пентобарбитал натрия. Придать Пентобарбитал натрия раствор (75 мг/кг и.п.) чтобы анестезировать мышей.
- Покрытие мыши с предварительно смачивают марлевые для предотвращения сухости глаз.
- Убедитесь, что полностью теряет сознание и больше не реагирует на хвост мыши или hindfoot щепотки пинцетом. Следить за анестезию во обезболивающий и интраоперационная каждые 15 минут поддержания анестезии, дополняя с 10% от объема первоначального впрыска Пентобарбитал решения при необходимости.
- Место грелку с полу изолирующий слой ниже животных и место животного в лежачем положении и передать его на рабочей станции лазера Doppler аппарат. Исправьте мыши рабочей платформы с хирургическая лента.
- Тампоном брюшной кожу мыши с betadine, а затем 75% этанол используется для тампоном брюшной области чистой.
- Внедрить 2% lidocaine/0.5% бупивакаин (50/50) смесь подкожно. Вырезать ~ 3 см-диаметр отверстие в центре губкой марлей. Обложка области живота с губкой марлей.
- Поднимите брюшной кожи пинцетом и сделать первоначальный вертикальный разрез вдоль средней линии живота, с помощью скальпеля или кожи ножницы.
- Понять основные мышцы с щипцами и надрезать для проникновения в брюшную полость. Не травмировать любого из органов. Сложите кожи и основные мышцы груди раскрыть брюшной полости. Аккуратно разоблачить тела поджелудочной железы и селезенки, используя пару Блант носом щипцов.
4. сбор данных для анализа
- Запуск программного обеспечения лазера Doppler аппарата, нажав на «Файл» → «Новый» для создания нового файла измерения. Для настройки подключенных мониторов, на вкладке «Общие», настройте контролирующую продолжительность «Бесплатно запустить». Использовать заводские на закладке «МСО монитор» нажмите кнопку «Далее».
- Настройка отображения графа в «экран диалоговом окне Параметры.» Выберите «Скорость потока, Conc,» каналы, установив соответствующие флажки. Выберите следующие параметры: «Источник данных для канала» и «Label, единицы и цвет». Нажмите кнопку «Далее».
- Введите пользователя сведения о теме и измерения (то есть, имя и номер, оператор, контроль времени, комментарии и т.д.) в «диалоговом окне файла информации» и нажмите «Далее», чтобы завершить настройку измерения.
Примечание: Окно измерения автоматически создается программным обеспечением (рис. 1B). - Вручную заранее электрода поджелудочной железы. Убедитесь, что расстояние между зондом и поджелудочной железы ткани находится в пределах 1 мм. Неуместным расстояние дает искусственно увеличение или снижение крови поток чтение.
- Нажмите значок панели инструментов «Старт», чтобы начать запись данных единиц (ПУ) перфузии микрососудистой крови. Сбор данных пу непрерывно в течение 1 мин каждого прогона. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы остановить измерение. Выберите «Файл» → «Сохранить как» имя и сохраните файл готовой измерения.
- Вручную переместить зонд после каждого запуска, чтобы избежать аддитивные эффекты и локализованного истощения сократительной и релаксации. Повторите шаги 4.1-4.4 урожай микрососудистой пу данных многоточечный (т.е., три произвольно выбранных пунктов из ткани поджелудочной железы) для каждой мыши. Измерьте пу данных антибликовое плиты как базовый элемент управления.
- Закройте брюшной мышцы слой и слой кожи с швом. Место животных в клетках, чистый после экспериментов.
- Держите животных тепло, поместив восстановления Кейдж половина на грелку.
Примечание: Обратите внимание на тепло, гигиены, жидкости и пищи и инфекции. Администрировать мышей с 2 мг/кг Carprofen для 48 h как послеоперационной боли. Выполняют euthanasia путем инъекций 150 мг/кг Пентобарбитал натрия и.п., когда мышь наблюдаются в состоянии сильной боли или страдания, которые не могут быть решены.
5. Расчет параметров микрососудистой Vasomotion
- Используйте команду «Экспорт» лазера Doppler программное обеспечение для экспорта время и ПУ необработанные данные в формате *.xlsx и открыть этот файл в таблицу.
- Рассчитать средний базовый блок перфузии (ПУb) (см. шаг 4.6).
- Рассчитать средний крови перфузии (ПУ) за 1 мин измерения следующим: средняя перфузии крови (ПУ) = ПУ - ПУb (уравнение 1).
- Рассчитайте частоту (циклов/мин) для каждого 1 мин измерений.
Примечание: Частота микрососудистой vasomotion определяется как количество вершин, которые произошли в волне микрососудистой vasomotion в минуту. - Рассчитайте амплитуду (ΔPU) для каждого 1 мин измерений.
- Рассчитать амплитуду микрососудистой vasomotion как разница между (ПУМакс) максимальная и минимальная (ПУмин): амплитуда (ΔPU) = пуМакс - пумин (уравнение 2).
- Вычислите относительную скорость (PU) для каждого 1 мин измерений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фотография микрососудистой vasomotion измерение лазера Doppler Аппарат оснастили полупроводникового лазерного диода показана на рисунке 1A. Пользовательский интерфейс программного обеспечения представлена на рисунке 1B. С помощью метода, упомянутых выше, были обнаружены гемодинамики поджелудочной островок микрососудистой vasomotion для не диабетиков контроля и диабетических мышей. Различные методы, включая Лазерная доплеровская флоуметрия, отражение и рассеянного света, инфракрасной спектроскопии и изображений техники, были использованы для изучения микрососудистой vasomotion, поскольку он впервые был определен. В таблице 1 приведены исследовательских групп и опубликованных статей, которые используют Лазерные доплеровские технологии для определения роли микроциркуляции в диабета и связанных с ним заболеваний.
В целом состояние микроциркуляторного поджелудочной островок представлены функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion с использованием микрососудистых параметров, включая средний крови перфузии, амплитуда, частота, относительная скорость (рис. 2). Представитель микрососудистой vasomotion схема состоит из периодических сокращение и расслабление фаз (рис. 2A). Гемодинамические явления представляют шаблон потока перфузии крови в микрососудистой сети. Пу, собираемые лазера Doppler аппарата были заняты точечной диаграммы диаграммы и показать распределение микрососудистой крови перфузии. В протоколе текущей структуры распределения поджелудочной островок микрососудистой крови перфузии в не диабетиков и диабетических мышей были совершенно разные (рис. 2B). Нижняя шкала перфузии крови поджелудочной островок микрососудистой vasomotion наблюдалось в диабетических мышей, по сравнению с не диабетиков контроля. Ритм сокращений и релаксациями поджелудочной островок микрососудистой vasomotion была хаотичной и нерегулярных в СТЗ индуцированной сахарным диабетом мышах, тогда как не диабетиков контроля ритмических колебаний (рис. 2 c и Рисунок 2D). Мы извлекали данные 5-s поджелудочной островок микрососудистой крови перфузии в пределах пунктирной линии в рисунке 2 c и 2D фигура и продемонстрировал, что хаотические колебания поджелудочной островок микрососудистой крови перфузии в диабетических мышей потерял способность регулировать функциональное состояние поджелудочной островок микрососудистой vasomotion, которое должно произойти в ответ на крови глюкозы fluctuation (рис. 2е).
Кроме того чтобы реагировать гипергликемии, панкреатических островков нужно недостато и biorhythmic крови поток перфузии для перевозки инсулина. Микроваскулярная vasomotion поджелудочной островок параметров (включая средняя крови перфузии, амплитуды, частоты и относительной скорости) были затем рассчитывается и количественно проанализированы на основе пу профилей. Как показано на рисунке 3, по сравнению с не диабетиков контроля, средняя крови перфузии микроциркуляции поджелудочной островок уменьшилось в СТЗ индуцированной сахарным диабетом мышах (рис. 3A). Тем временем были значительному уменьшается отметил амплитуды (рис. 3B) и частоты (рис. 3 c) поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в СТЗ индуцированной сахарным диабетом мышах. Относительная скорость перфузии крови поджелудочной островок значительно сократилось в СТЗ индуцированной сахарным диабетом группе по сравнению с не диабетиков контроля (рис. 3D). Как упоминалось выше, функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion был поврежден в диабетических мышей. Мы предположить, что нарушения ритма, вместе со снижением частоты, амплитуды и относительной скорости поджелудочной островок микрососудистой vasomotion, может привести к deficiency перфузии микрососудистой крови, который может повредить β островковых клеток и уменьшить секреции инсулина.
Рисунок 1. Аппарат для определения поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в естественных условиях. A. фотография измерения аппарат используется для определения поджелудочной островок микрососудистой vasomotion мышей. В левой панели розетки зонд и переключатель лазера. Жидкокристаллический дисплей находится в средней панели. В правой панели кнопок меню (например, вверх, вниз и введите кнопки) и светоизлучающих диодов мощности. Периферийные устройства (например, компьютеры и кабели), не отображаются. Б. скриншот, иллюстрирующие типичные элементы и граф каналы лазера Doppler аппарат программного обеспечения. «Flux,» «Conc,» «DC,» и «Скорость» измерения чтений отображаются в каналах, граф. «Потока» представляет микрососудистой крови перфузии тканей, «Conc» представляет концентрацию микрососудистой кровяных клеток ткани, «DC» представляет средней интенсивности отражающей свет, а «Скорость» представляет относительную скорость микрососудистой кровотока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Функциональное состояние поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в мышах. Перфузии крови микрососудистой vasomotion поджелудочной островок был оценен лазера Doppler аппарат, и анализ функционального состояния. A. схема параметров, касающихся микрососудистой vasomotion. AC представляет амплитуды микрососудистой vasomotion сжатия, Ar представляет амплитуды микрососудистой vasomotion релаксации, Tc представляет продолжительность времени сокращение микрососудистой vasomotion и Tr представляет продолжительность времени Микроваскулярная vasomotion релаксации. B. распределение поджелудочной островок микрососудистой крови перфузии в не диабетиков и диабетических мышей. Красные точки: не диабетиков мышей. Синие точки: диабетических мышей. Пунктирная зеленая линия показывает демаркации между не диабетиков и диабетической микрососудистой крови перфузии шаблон. C. поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в контрольной группе была оценена на основе динамического микрососудистой перфузии крови поток. D. микрососудистой vasomotion поджелудочной островок в диабетических мышей оценивалась на основе динамического микрососудистой перфузии крови поток. Е. схема представитель (диапазон 5-s) поджелудочной островок микрососудистой vasomotion между не диабетиков контроля и диабетических мышей. Красная линия: не диабетиков контроля. Синяя линия: диабетических мышей. Пу: перфузии единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Ные параметров поджелудочной островок микрососудистой vasomotion. Поджелудочной островок микрососудистой vasomotion параметров, включая средний крови перфузии, амплитуды, частоты и относительной скорости были проанализированы и сравнении между не диабетиков контроля и диабетических мышей. A. ные средний крови перфузии (ПУ/мин) поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в не диабетиков и диабетических мышей. Б. амплитуда (ΔPU), C. частоты (циклов/мин) и D. относительную скорость (ПУ) поджелудочной островок микрососудистой vasomotion были ниже в диабетических мышей, чем в не диабетиков контроля мышей. Амплитуда микрососудистой vasomotion была рассчитана как разница между (ПУМакс) максимальная и минимальная (ПУмин). Частота микрососудистой vasomotion был определен как число пиков и долин, которые произошли в волне микрососудистой vasomotion в минуту. Данные были представлены как среднее ± SD (n = 6 в каждой группе). P < 0,05, **P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Заболевания | Объект | Аппарат | РЭС № |
| Эндотелиальная функция | H | LDF, LSCI | 11, 12, и т.д. |
| DN | H, R | ФМР | 13, 14, 15, и т.д. |
| Д-Р | H | ФМР | 16, 17, 18, и т.д. |
| Кожа/кожных микроциркуляции | H | ФМР | 11, 19, 20, и т.д. |
| Сердца микроциркуляции | R | ФМР | 21 |
| Нарушения слуха | M | ФМР | 22 |
| DN, диабетической невропатии. DR, диабетическая ретинопатия. LDF, Лазерная доплеровская флоуметрия. | |||
| LSCI, лазерной спекл контраст изображения. R, крыса. H, человека, M, мышь. | |||
Таблицы 1. Роль микроциркуляции в диабета и его осложнений. Исследовательские группы использовали лазера Doppler для определения роли микроциркуляции в диабета и его осложнений на протяжении десятилетий. Связанные статьи в последние годы перечислены здесь. Эти опубликованных статей главным образом сосредоточиться на эндотелиальной дисфункции, диабетической нейропатии (DN), диабетической ретинопатии (DR), кожи и кожных микрососудистой обесценения и сравнительно редких осложнений, таких как дисфункция сердечной микроциркуляцию и слуха обесценение. DN: диабетической невропатии. Д.Р.: диабетическая ретинопатия. Сол: Лазерная доплеровская флоуметрия. LSCI: лазерной спекл контраст изображения. R: Крыса. H: человека. МЕТЕЛЬСКИЙ: мышь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В случаях, которые связаны Микроваскулярная дисфункция (например, диабет, острый панкреатит, заболевания периферических микрососудистой и т.д.) некоторых заболеваний привести к снижением кровотока. Помимо изменений в поток крови являются важными показателями, такие как микрососудистой vasomotion, которые отражают функциональное состояние микроциркуляции. Конкретный показатель, микрососудистой vasomotion, обычно определяется как колебание микрососудистой тон в микрососудистой кровати. В текущем протоколе микрососудистой крови перфузии, система мониторинга позволяет прямой визуализации и количественный анализ функционального состояния микрососудистой vasomotion. Наш микроциркуляторного оценки подход может быть применен выборочно к целевой тканей и органов путем определения динамических изменений в перфузии крови. Доклады опубликованы другими группами об использовании лазера Doppler для определения роли микрососудистой крови перфузии в диабета и его осложнений были кратко изложены в таблице 1. В текущем исследовании чтобы продемонстрировать наш подход, оценку функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion диабетических мышей.
Микроваскулярная vasomotion признается в качестве параметра функционального состояния микроциркуляции и способен регулирования потока перфузии крови, регулируя распределение в23местных тканей. Microvasculature поджелудочной железы, которые могут быть разделены островков, Ацинусы и воздуховодов, изучался на протяжении десятилетий. В основном это разделение поджелудочной железы в различных частях предназначен для удобства только потому, что microvasculature на самом деле взаимосвязанных и однородной как органические сущности24. Эта сеть microvasculature поддерживает регулирование потока крови поджелудочной островок. Следовательно мы использовали параметры функционального состояния, определяется лазера Doppler, представлять поджелудочной островок microvasculature vasomotion. Однако из-за характеристики поджелудочной железы архитектуры, мы еще не смогли сделать суждение после применения текущего метода определить, является ли перфузии крови является производным от эндокринная часть или части экзокринной поджелудочной железы. С помощью островок конкретных маркировки красителей, например Дитизон и нейтрального красного, может стать одним из возможных способов понять этот вопрос, по крайней мере до некоторой степени.
Важным аспектом измерения шаг является расстояние между зондом и тканей поджелудочной железы. Неуместным расстояние дает искусственно повышенный приток крови чтения. Физическая сила, применяемых к ткани и орган кончик зонда уменьшит микрососудистой кровотока. Таким образом минимальное давление должно применяться при проведении измерений. Еще один момент отметить это мощности лазеров. Мощных лазеров обычно легко ранить микрососудов в поджелудочной островок, поэтому частота лазерного луча необходимо контролировать, в пределах ограничений. Для общего и временных измерений рекомендуется частотой 1 Гц или меньше. Чтобы избежать локализованного истощения микрососудистой vasomotion потенциала (включая сократительной и релаксации) и аддитивный эффект, в любые эксперименты предложены многоточечные решимость и репозиционирования сайта после каждого измерения.
В текущем методе пу данных используются для представления потока крови микрососудистой кровотока. Из-за характеристик микрососудистой кровотока в микроциркуляции не представляется возможным определить абсолютного потока единиц (например, мл/мин/100 g конкретных органов или тканей). Таким образом параметр системы оценки, используемые здесь основана на относительной крови поток перфузии единиц. Вейвлет-анализ, быстрое преобразование Фурье и другие алгоритмы спектрального анализа являются общие методы, которые проводят доплеровских сигналов лазера. В настоящем протоколе мы создали подход, использующий гемодинамики (т.е., перфузии крови, амплитуды, частоты и относительной скорости) чтобы показать функционального состояния микрососудистой vasomotion. Кроме того точность измерения связаны с глубины цели и Конструкция зонда, которая, как правило, около 1 мм. Таким образом толще или компактный органы и ткани могут не подходить для применения лазера Doppler и для текущего метода. Кроме того потому, что данные, полученные от потока перфузии крови могут быть затронуты другие условия, которые вызывает заметные изменения, включая температуру, влажность, внешний свет и изменения в положении, мышей, некоторые правила должны соблюдаться в ходе экспериментальной. Лаборатория нуждается для поддержания постоянной температуры и влажности, и внешнего освещения должны быть защищены. Рекомендуется исправить мышей, чтобы избежать изменений в позиции. Считается, что эти стратегии можно преодолеть ограничения, упомянутые выше и повысит точность данных перфузии крови поток.
Преимущество по сравнению с другими в литератур настоящего Протокола является учитывали местные микрососудистой vasomotion тканей и органов и. Это будет способствовать более широкое применение метода оценки или расследования микроциркуляции, особенно функционального состояния микрососудистой vasomotion, клинических и лабораторных исследований. Приложения включают, но не ограничиваются: Визуализация ишемии, оценки перфузии крови и оценки функционального состояния микрососудистой vasomotion. В заключение наш метод может использоваться для изучения и оценки функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в мышах в естественных условиях и может быть в состоянии встретиться с клинической необходимости оценки микроциркуляции функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантов от Peking союза медицинский колледж фонд молодежи и фундаментальные исследования средств для университетов Центральной (Грант № 3332015200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoorVMS-LDF2 | Moor Instruments | GI80 | PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data |
| MoorVMS-PC Software | Moor Instruments | GI80-1 | Software of MoorVMS-LDF2 |
| Calibration stand | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration base | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration flux standard | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| One Touch UltraEasy glucometer | Johnson and Johnson | #1955685 | Confirm hyperglycemia |
| One Touch UltraEasy strips | Johnson and Johnson | #1297006 | Confirm hyperglycemia |
| Streptozotocin | Sigma-Aldrich | S0130 | Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3) |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Working concentration 3 % |
| Ethanol | Sinopharm Inc. | 200121 | Working concentration 75 % |
| Sucrose | Amresco | 335 | Working concentration 10 % |
| Medical gauze | China Health Materials Co. | S-7112 | Surgical |
| Blunt-nose forceps | Shang Hai Surgical Instruments Inc. | N-551 | Surgical |
| Surgical tapes | 3M Company | 3664CU | Surgical |
| Gauze sponge | Fu Kang Sen Medical Device CO. | BB5447 | Surgical |
| Scalpel | Yu Lin Surgical Instruments Inc. | 175C | Surgical |
| Skin scissor | Carent | 255-17 | Surgical |
| Suture | Ning Bo Surgical Instruments Inc. | 3325-77 | Surgical |
| Syringe and 25-G needle | MISAWA Inc. | 3731-2011 | Scale: 1 ml |
References
- Aalkjaer, C., Nilsson, H. Vasomotion: cellular background for the oscillator and for the synchronization of smooth muscle cells. Br J Pharmacol. 144 (5), 605-616 (2005).
- Serne, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., IJzerman, R. G., Stehouwer, C. D. Microvascular dysfunction: a potential pathophysiological role in the metabolic syndrome. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
- Carmines, P. K. Mechanisms of renal microvascular dysfunction in type 1 diabetes: potential contribution to end organ damage. Curr Vasc Pharmacol. 12 (6), 781-787 (2014).
- Holowatz, L. A. Human cutaneous microvascular ageing: potential insights into underlying physiological mechanisms of endothelial function and dysfunction. J Physiol. 586 (14), 3301 (2008).
- De Boer, M. P., et al. Microvascular dysfunction: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Microcirculation. 19 (1), 5-18 (2012).
- Nilsson, G. E., Tenland, T., Oberg, P. A. Evaluation of a laser Doppler flowmeter for measurement of tissue blood flow. IEEE Trans Biomed Eng. 27 (10), 597-604 (1980).
- Chen, D., et al. Relationship between the blood perfusion values determined by laser speckle imaging and laser Doppler imaging in normal skin and port wine stains. Photodiagnosis Photodyn Ther. 13 (1), 1-9 (2016).
- Fuchs, D., Dupon, P. P., Schaap, L. A., Draijer, R. The association between diabetes and dermal microvascular dysfunction non-invasively assessed by laser Doppler with local thermal hyperemia: a systematic review with meta-analysis. Cardiovasc Diabetol. 16 (1), 11-22 (2017).
- Yaginuma, N., Takahashi, T., Saito, K., Kyoguku, M. The microvasculature of the human pancreas and its relation to Langerhans islets and lobules. Pathol Res Pract. 181 (1), 77-84 (1986).
- Brissova, M., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes beta cell regeneration. Cell Metab. 19 (3), 498-511 (2014).
- de Moraes, R., Van Bavel, D., Gomes Mde, B., Tibirica, E. Effects of non-supervised low intensity aerobic excise training on the microvascular endothelial function of patients with type 1 diabetes: a non-pharmacological interventional study. BMC Cardiovasc Disord. 16 (1), 23-31 (2016).
- Humeau-Heurtier, A., Guerreschi, E., Abraham, P., Mahe, G. Relevance of laser Doppler and laser speckle techniques for assessing vascular function: state of the art and future trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 659-666 (2013).
- Park, H. S., Yun, H. M., Jung, I. M., Lee, T. Role of Laser Doppler for the Evaluation of Pedal Microcirculatory Function in Diabetic Neuropathy Patients. Microcirculation. 23 (1), 44-52 (2016).
- Sun, P. C., et al. Microcirculatory vasomotor changes are associated with severity of peripheral neuropathy in patients with type 2 diabetes. Diab Vasc Dis Res. 10 (3), 270-276 (2013).
- Pan, Y., et al. Effects of PEMF on microcirculation and angiogenesis in a model of acute hindlimb ischemia in diabetic rats. Bioelectromagnetics. 34 (3), 180-188 (2013).
- Jumar, A., et al. Early Signs of End-Organ Damage in Retinal Arterioles in Patients with Type 2 Diabetes Compared to Hypertensive Patients. Microcirculation. 23 (6), 447-455 (2016).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25-33 (2016).
- Forst, T., et al. Retinal Microcirculation in Type 1 Diabetic Patients With and Without Peripheral Sensory Neuropathy. J Diabetes Sci Technol. 8 (2), 356-361 (2014).
- Hu, H. F., Hsiu, H., Sung, C. J., Lee, C. H. Combining laser-Doppler flowmetry measurements with spectral analysis to study different microcirculatory effects in human prediabetic and diabetic subjects. Lasers Med Sci. 31 (1), 1-8 (2016).
- Klonizakis, M., Manning, G., Lingam, K., Donnelly, R., Yeung, J. M. Effect of diabetes on the cutaneous microcirculation of the feet in patients with intermittent claudication. Clin Hemorheol Microcirc. 61 (3), 439-444 (2015).
- Khazraei, H., Shafa, M., Mirkhani, H. Effect of ranolazine on cardiac microcirculation in normal and diabetic rats. Acta Physiol Hung. 101 (3), 301-308 (2014).
- Fujita, T., et al. Increased inner ear susceptibility to noise injury in mice with streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61 (11), 2980-2986 (2012).
- Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14 (4-5), 403-438 (2007).
- Chawla, L. S., et al. Vascular content, tone, integrity, and haemodynamics for guiding fluid therapy: a conceptual approach. Br J Anaesth. 113 (5), 748-755 (2014).
