Summary
Bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion regulerer Holme blod distribusjon og opprettholder fysiologiske funksjon Holme β celler. Denne protokollen beskriver hvordan du bruker en laser Doppler skjerm til å finne funksjonell status for bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i vivo og vurdere bidrag av bukspyttkjertelen Holme mikrosirkulasjonen bukspyttkjertelen-relaterte sykdommer.
Abstract
Som en funksjonell status mikrosirkulasjonen er mikrovaskulær vasomotion viktig for levering av oksygen og næringsstoffer og fjerning av karbondioksid og avfallsprodukter. Svekkelse av mikrovaskulær vasomotion kan være et viktig skritt i utviklingen av mikrosirkulasjonen-relaterte sykdommer. I tillegg er til svært vascularized bukspyttkjertelen Holme tilpasset for å støtte endokrine funksjon. I denne forbindelse synes det mulig å antyde at funksjonell status bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion kan påvirke bukspyttkjertelen Holme funksjon. Analysere patologiske forandringer av funksjonell status for bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion kan være en mulig strategi å bestemme bidrag som bukspyttkjertelen Holme mikrosirkulasjonen gjør relaterte sykdommer som diabetes mellitus, pankreatitt, etc. Derfor beskriver denne protokollen bruker en laser Doppler blod gassStrømning overvåker kontrollere funksjonelle av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion, og å etablere parametrene (inkludert gjennomsnittlig perfusjon, amplitude, frekvens og relativ hastigheten av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion) for evaluering av microcirculatory funksjonell status. I en streptozotocin-indusert diabetiker musemodell observerte vi en svekket funksjonell status bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion. Som konklusjon, kan denne fremgangsmåten for å vurdere bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i vivo avsløre mekanismer knyttet til bukspyttkjertelen Holme sykdommer.
Introduction
Som en parameter av funksjonell status for mikrosirkulasjonen, mikrovaskulær vasomotion tar ansvar for levering og utveksling av oksygen og næringsstoffer, hormoner og er avgjørende for fjerning av metabolske produkter som karbondioksid og celle avfall 1. mikrovaskulær vasomotion også regulerer blod flyte distribusjon og vevsperfusjon, og dermed påvirke lokale microcirculatory blodtrykk og Svar å betennelse, noe som kan føre til ødem i mange sykdommer. Mikrovaskulær vasomotion er derfor svært viktig å opprettholde fysiologiske funksjon organer2,3,4, vev og komponent celler. Svekkelse av mikrovaskulær vasomotion kan være en av de viktigste trinnene i utviklingen av mikrosirkulasjonen-relaterte sykdommer5.
Laser Doppler ble opprinnelig utviklet for observasjon og kvantifisering i feltet mikrosirkulasjonen forskning6. Denne teknikken, sammen med andre tekniske tilnærminger (f.eks laser speckle7transkutan oksygen, osv.), har vært ansett som den gylne standarden for å vurdere blodstrømmen i mikrosirkulasjonen. Begrunnelsen at blodperfusjon av lokale mikrosirkulasjonen (dvs. kapillærer, arterioler, venules, etc.) kan bestemmes av apparatet utstyrt med laser Doppler, er basert på prinsippet om Doppler SKIFT. Bølgelengde og hyppigheten av tilsvarende lys endres når lyset partikler møte bevegelige blodlegemer i microvessels, eller de forblir uendret. Derfor i mikrosirkulasjonen er nummeret og hastigheten av blod celler de viktigste faktorene knyttet til størrelsen og fordelingen av Doppler-forskjøvet lyset, mens retning av mikrovaskulær blodstrøm er irrelevant. Bruker ulike metoder, ulike vev er brukt for microcirculatory studier, inkludert mesenteries og dorsal skinfold kamre av mus, rotter, hamstere, og selv mennesker8. Men i gjeldende protokollen, fokuserer vi på den funksjonelle status for bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion, som er evaluert med laser Doppler og en hjemmelaget parameteren vurderingssystem.
Bukspyttkjertelen Holme mikrosirkulasjonen består hovedsakelig av bukspyttkjertelen Holme microvessels og utstillinger særtrekk. En bukspyttkjertelen Holme capillary nettverket viser en fem ganger høyere tetthet enn capillary nettverket av sin exocrine motpart9. Som en kanal for levering av input glukose og formidle insulin, leverer Holme endotelceller oksygen til metabolsk aktive celler i Holme β celler. Videre viser nye bevis også at Holme microvessels er involvert ikke bare i å regulere insulin genuttrykk og β-celle overlevelse, men også i påvirker β-celle funksjon; fremme β-celle spredning; og produserer en rekke vasoactive, angiogenic stoffer og vekstfaktorer10. Derfor i denne forbindelse antyde vi at funksjonell status for bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion kan påvirke Holme β-celle funksjon og engasjere seg i patogenesen av sykdommer som akutt/kronisk pankreatitt, diabetes og andre bukspyttkjertelen-relaterte sykdommer.
Analysere patologiske forandringer av funksjonell status for bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion kan være en mulig strategi for å finne ut bidrag av bukspyttkjertelen Holme blodsirkulasjonen til sykdommer nevnt ovenfor. En detaljert fremgangsmåte som beskriver tilnærming for å fastslå bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i vivo gir her. Typiske mål vises deretter i Representant resultater. Til slutt, fordelene og ulempene av metoden utheves i diskusjon, sammen med videre søknader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med alle relevante retningslinjer, regler og regulerende instanser. Nåværende protokollen blir demonstrert ble utført under veiledning og godkjenning av den Institute av mikrosirkulasjonen dyr etikk Committee (IMAEC) ved Peking Union Medical College (PUMC).
1. dyr
- Før eksperimentet, holde tre BALB/c mus per bur, med kontrollert temperatur (24 ± 1 ° C) og luftfuktighet (55 ± 5%), under en 12-h lys og mørke syklus. Kan mus gratis tilgang til vanlig mat og vann.
- Tilfeldig del mus i en ikke-diabetikere kontrollgruppe og en diabetiker gruppe. Nøyaktig veie hver individuelle musen og beregne injeksjon volumet med kroppen massen av hver musen.
- Rask musene 4 h før streptozotocin (STZ) injeksjon og gi vanlig vann som normalt på eksperimentell dag 1.
- Forberede 0.1 M natriumsitrat buffer ved pH 4.3. Sett 1 mL av løsningen i en 1.5-mL microcentrifuge rør og pakk microcentrifuge røret i aluminiumsfolie å unngå lyseksponering.
- Løs opp STZ i natriumsitrat buffer (pH 4.3) til en siste arbeider konsentrasjon av 5 mg/mL før bruk.
- Gi musene av diabetiker gruppe intraperitoneal injeksjoner av STZ på en dose av 40 mg/kg med en 1-mL sprøyte og en 25-G nål. Injisere musene i kontrollen ikke-diabetikere med samme volum natriumsitrat bufferen (pH 4.3).
- Sett musene tilbake i merdene og levere dem med vanlig mat og 10% sukrose vann.
- Gjenta trinn 1.3-1.7 på eksperimentell dager 2 til 5 (dvs. de neste 4 dagene).
- Erstatt 10% sukrose vannet med vanlig vann etter siste STZ injeksjon.
- Fort mus for 6 h, men gi dem gratis tilgang til vann, og måle sitt blodsukker ni dager senere (eksperimentell dag 14). Samle en blodprøve fra halen venen å bekrefte hyperglykemi bruker et blod glukose overvåkingssystem.
Merk: Mus med blod glukose nivå > 200 mg / dL regnes diabetiker.
2. forberedelse av apparatet
- Rengjør optisk overflater fra probespissen og sonde kontakt av laser Doppler apparatet med en myk, myk klut for å fjerne støv eller partikler. Plugg kabelen til porten på maskinen (figur 1A).
- Samle kalibrering stå ved at fluks standard i termisk likevekt med eksperimentelle omgivelser (romtemperatur, vanligvis i 30 min). Riste fluks standard forsiktig i 10 s og la den hvile i 2 min.
- Plasser beholderen flux standard i kalibrering basen. Juster klemmen til maksimal høyde og sikre sonde i klemmen slik at den peker nedover til beholderen. Kontroller flux standarden er riktig plassert under sonden.
- Sakte flytter sonden til spissen er riktig neddykket i flux standarden. Velg og trykk "kalibrering" laser Doppler apparater og velg arbeider kanalen som proben er koblet til. Kjør kalibreringsprogrammet til en «Kalibrering vellykket»-melding vises på skjermen på laser Doppler apparater.
- Sikre sonden bruker sonde holdere. Manuelt sikre sonden å unngå bevegelse.
- Opprettholde den eksperimentelle rom på konstant temperatur (24 ± 1 ° C) og luftfuktighet (~ 50-60%).
- Slå av alle eksterne lys (som fluorescerende og spot-lamper) før forsøket å unngå eksterne lys-indusert endring.
3. forberedelse av dyrene
- Autoclave den kirurgiske instrumenter og la dem avkjøles til romtemperatur før bruk.
- Gi musene 10 min til acclimatize for eksperimentell miljøet før du oppdager bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion av laser Doppler.
- Fyll en 1-mL sprøyte med 1 mL av 3% pentobarbital natrium. Injiser pentobarbital natrium løsning (75 mg/kg IP) for å bedøve musene.
- Dekk øynene til musen med pre-fuktet medisinsk gasbind å hindre tørrhet.
- Sikre musen helt mister bevisstheten og ikke lenger reagerer på halen eller hindfoot klyper med tang. Overvåke anestesi hele hendelsen anestesi og intra operativ hver 15 min. opprettholde av bedøvelsen ved supplere med 10% av første injeksjon volumet av pentobarbital løsning når det er nødvendig.
- Plasser en heten pute med en semi isolerende lag under dyret og plassere dyret i supine posisjon og overføre den til arbeider stasjonen av laser Doppler apparater. Fikse musen arbeider plattformen med kirurgisk tape.
- Vattpinne abdominal huden av musen med betadine, og 75% etanol brukes å swab mageområdet ren.
- Sette inn 2% lidocaine/0.5% bupivacaine (50/50) blanding subcutaneously. Kutte en ~ 3 cm-diameter hull i midten av en gasbind svamp. Dekk mageregionen med gasbind svamp.
- Løft abdominal huden med tang og foreta en første loddrette snitt langs midtlinjen av mage ved hjelp av en skalpell eller hud saks.
- Forstå underliggende muskler med tang og incise for å angi bukhulen. Ikke skade noen organer. Kast hud og underliggende muskel over brystet å avsløre bukhulen. Forsiktig avsløre bukspyttkjertelen kroppen og milten med en butt-nosed tang.
4. datainnsamling for analyse
- Kjøre programvaren til laser Doppler apparatet ved å klikke på "Fil" → "Ny" for å opprette en ny måling-fil. Hvis du vil konfigurere tilkoblede skjermer, under kategorien "Generelt" sette opp overvåking varigheten til "Gratis kjøre." Bruk standard fabrikkinnstilling for kategorien "LDF Monitor" Klikk "Neste".
- Definert i diagramvisningen i "Vis installasjonsdialogboksen." Velg "Flux Kons, Speed" kanalene ved å kontrollere de respektive boksene. Velg følgende parametere: "Datakilde for kanalen" og "Label, enheter og farge" Klikk "Neste".
- Angi brukerinformasjon om emnet og måling (dvs. navn og emnet tall, operatør, overvåking tid, kommentarer, etc.) i "informasjon fildialogboksen" og klikk "Neste" for å fullføre mål konfigurasjonen.
Merk: Et mål vindu opprettes automatisk av programvaren (figur 1B). - Manuelt gå videre elektroden til bukspyttkjertelen. Kontroller avstanden mellom sonde og bukspyttkjertelen vev er innen 1 mm. En upassende avstand gir en kunstig økt eller redusert blod flyte lesing.
- Klikk på "Start" ikon å starte innspillingen mikrovaskulær blod perfusjon enheter (PU) data. Samle PU data kontinuerlig for 1 min hver kjører. Velg "Stopp" for å stoppe målingen. Velg "Fil" → "Lagre som" navn og lagre filen ferdig mål.
- Manuelt flytte proben etter hver å unngå additiv effekter og lokaliserte konsumpsjon av kontraktile og avslapning. Gjenta 4.1-4,4 å høste multi-Point (dvs. tre tilfeldig valgt poeng fra bukspyttkjertelen vev) mikrovaskulær PU data for hver musen. Måle PU data fra en ikke-reflekterende plate som en opprinnelig plan.
- Lukk bukmuskel laget og huden laget med en Sutur. Plasser dyrene i ren bur etter forsøkene.
- Holde dyr varme ved å plassere utvinning buret halv-på oppvarming pad.
Merk: Ta hensyn til varme, hygiene, væske og matinntaket og infeksjon. Administrere mus med 2 mg/kg Carprofen 48 h som postoperativ smerte ledelse. Utføre euthanasia ved å injisere 150 mg/kg pentobarbital natrium IP når mus er observert for å være i en tilstand av alvorlig smerte eller ubehag som ikke kan lindres.
5. beregning av parameterne for mikrovaskulær Vasomotion
- Bruk kommandoen "Eksporter" av laser Doppler programvare eksportere tid og PU rådata som *.xlsx fil og åpne filen i et regneark.
- Beregne den gjennomsnittlige planlagte perfusjon enheten (PUb) (se trinn 4.6).
- Beregne den gjennomsnittlig perfusjonen (PUen) for 1 min for en måling som følger: gjennomsnittlig blodperfusjon (PUen) = PU - PUb (formel 1).
- Beregne frekvensen (sykluser/min) for hver 1 minutt av målenheten.
Merk: Frekvensen av mikrovaskulær vasomotion er definert som antall topper som skjedde i en mikrovaskulær vasomotion bølge per minutt. - Beregne amplituden (ΔPU) for hver 1 min måling.
- Beregne amplituden til mikrovaskulær vasomotion som differansen mellom maksimum (PUMaks) og minimum (PUmin): amplituden (ΔPU) = PUMaks - PUmin (ligning 2).
- Beregne relative hastigheten (PU) for hver 1 min måling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et fotografi av mikrovaskulær vasomotion måling laser Doppler apparatet utstyrt med en laserdiode av halvleder vises i figur 1A. Brukergrensesnittet programvaren er presentert i figur 1B. Med metoden ovenfor ble hemodynamic parametere av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion oppdaget for både ikke-diabetikere kontroll og diabetiker mus. En rekke teknikker, inkludert laser Doppler flowmetry, reflektert spredt lys, infrarød spektroskopi og imaging teknikker, har blitt brukt til å studere mikrovaskulær vasomotion siden det først ble definert. Tabell 1 oppsummerer forskningsgrupper og publiserte artikler bruke laser Doppler teknologi til å fastslå rollen mikrosirkulasjonen i diabetes og sykdommer.
Generelt, representeres de microcirculatory forholdene i bukspyttkjertelen Holme av funksjonell status bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion med de mikrovaskulær parameterne, inkludert gjennomsnittlig perfusjon, amplitude, frekvens, relativ hastighet (figur 2). Representant mikrovaskulær vasomotion skjematisk diagram består hovedsakelig av periodiske Sammentrekningen og avslappingen faser (figur 2A). Hemodynamic fenomener presenterer et mønster av blod flyte perfusjon i mikrovaskulær nettverk. PU data innsamlet av laser Doppler apparatet ble brukt til diagrammet scatter diagrammer og viser fordelingen mønsteret av mikrovaskulær blodperfusjon. I den gjeldende protokollen var distribusjon mønstre av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær blodperfusjon i ikke-diabetikere og diabetiker mus helt annerledes (figur 2B). En lavere skala fra blodperfusjon av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion ble observert i diabetiker mus sammenlignet med kontrollen ikke-diabetikere. Rytmen av sammentrekninger og relaxations av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion var kaotisk og uregelmessig i STZ-indusert diabetiker mus, mens ikke-diabetikere kontroller hadde rytmisk svingninger (figur 2C og figur 2D). Vi pakket ut 5-s data bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær blodperfusjon i de stiplede linjene i figur 2C og figur 2D og viste at svingningene kaotiske i bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær blod perfusjon i diabetiker mus mistet evnen til å regulere funksjonell status bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion, noe som skulle skje svar på blod glukose fluctuation (figur 2E).
Videre, for å svare på hyperglykemi, bukspyttkjertelen holmer trenger sufficient og biorhythmic blodperfusjon flow å transportere insulin. Bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion parametere (inkludert gjennomsnittlig perfusjon, amplitude, frekvens og relativ hastighet) var så beregnet og kvantitativt analyseres basert på PU profilene. Som vist i Figur 3, sammenlignet med ikke-diabetikere kontroller, ble gjennomsnittlig perfusjon av bukspyttkjertelen Holme mikrosirkulasjonen redusert i STZ-indusert diabetiker mus (figur 3A). I mellomtiden var significant nedgang i amplituden (figur 3B) og frekvens (Figur 3 c) av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i STZ-indusert diabetiker mus. Relative hastigheten av bukspyttkjertelen Holme blodperfusjon betydelig redusert i STZ-indusert diabetiker gruppen sammenlignet med ikke-diabetikere kontrollen (figur 3D). Som nevnt ovenfor, ble funksjonell status bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion nedsatt i diabetiker mus. Vi spekulere at rytmen unormalt, sammen med en relativ hastighet av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion, med redusert frekvens og amplitude kan resultere i en deficiency av mikrovaskulær blodperfusjon, som kan skade Holme β celler og redusere insulinsekresjon.
Figur 1. Apparatet brukes til å bestemme bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i vivo. A. fotografi av måling apparater å bestemme bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion mus. Sonden stikkontakter og bryteren laserknapp er i venstre panel. LCD-displayet er i midtre panelet. Menyknapper (dvs. opp, ned og angi knapper) og power light - emitting diode er i panelet til høyre. De eksterne enhetene (dvs. datamaskiner og kabler) vises ikke. B. skjermbilde illustrerer den typiske elementer og graf kanaler av laser Doppler apparat programvare. "Forandring," "Kons," "DC," og "Speed" måling målinger vises i grafen kanaler. "Forandring" representerer vevsperfusjon mikrovaskulær blod, "Kons" representerer vev mikrovaskulær blodlegemer konsentrasjonen, "DC" representerer mener intensiteten av reflektert lys og "Speed" representerer den relative hastigheten av mikrovaskulær blodstrøm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Funksjonell status bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i mus. Blodperfusjon av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion ble vurdert av en laser Doppler apparater og funksjonell status ble analysert. A. skjematisk av parameterne knyttet til mikrovaskulær vasomotion. AC representerer amplituden til en mikrovaskulær vasomotion sammentrekning, Ar representerer amplituden av mikrovaskulær vasomotion avslapning, Tc representerer lengden på tidspunktet for en mikrovaskulær vasomotion sammentrekning og St representerer tiden av mikrovaskulær vasomotion avslapning. B. distribusjon mønster av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær blodperfusjon i ikke-diabetikere og diabetiker mus. Røde prikkene: ikke-diabetikere mus. Blå prikker: diabetiker mus. En stiplet grønn linje viser avgrensning mellom ikke-diabetikere og diabetiker mikrovaskulær blod perfusjon mønsteret. C. bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i kontrollgruppen ble vurdert på grunnlag av den dynamiske mikrovaskulær perfusjonen av blod-flow. D. bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i diabetiker mus ble vurdert på grunnlag av den dynamiske mikrovaskulær perfusjonen av blod-flow. E. Diagram av representant (5-s område) bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion mellom ikke-diabetikere kontroll og diabetiker mus. Rød linje: ikke-diabetikere kontroll. Blå linje: diabetiker mus. PU: perfusjon enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Quantification parameterne i bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion. Bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion parametere, inkludert gjennomsnittlig perfusjon, amplitude, frekvens og relativ hastighet ble analysert og forhold mellom ikke-diabetikere kontrollen og diabetiker mus. A. Quantification av gjennomsnittlig perfusjon (PU/min) av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i ikke-diabetikere og Diabetiske mus. B. amplituden (ΔPU), C. frekvens (sykluser/min) og D. relativ hastighet (PU) av bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion var lavere i diabetiker mus enn i ikke-diabetikere kontroll mus. Amplituden til mikrovaskulær vasomotion ble beregnet som differansen mellom maksimum (PUMaks) og minimum (PUmin). Hyppigheten av mikrovaskulær vasomotion ble definert som antall topper eller daler som skjedde i en mikrovaskulær vasomotion bølge per minutt. Dataene blir presentert som den gjennomsnittlig ± SD (n = 6 i hver gruppe). P < 0,05, **P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sykdommer | Objekt | Apparatet | Refs nr. |
| Endothelial funksjon | H | LDF, LSCI | 11, 12, osv. |
| DN | H, R | LDF | 13, 14, 15, osv. |
| DR | H | LDF | 16, 17, 18, osv. |
| Hud/kutan mikrosirkulasjonen | H | LDF | 11, 19, 20, osv. |
| CARDIAC mikrosirkulasjonen | R | LDF | 21 |
| Hørselsskader | M | LDF | 22 |
| DN, diabetisk nevropati. DR, diabetisk retinopati. LDF, laser Doppler flowmetry. | |||
| LSCI, laser speckle kontrast bildebehandling. R, rotte. H, menneske, M, musen. | |||
Tabell 1. Rollen mikrosirkulasjonen i diabetes og sin komplikasjonene. Forskningsgrupper har brukt laser Doppler for å bestemme rollen mikrosirkulasjonen i diabetes og dens komplikasjoner i flere tiår. Relaterte artikler i de siste årene er oppført her. Disse publiserte artikler fokusere hovedsakelig på endotelial dysfunksjon, diabetisk nevropati (DN), diabetisk retinopati (DR), hud og kutan mikrovaskulær verdifall og relativt sjeldne komplikasjoner som cardiac mikrosirkulasjonen dysfunksjon og hørsel verdifall. DN: diabetiker neuropathy. DR: diabetisk retinopati. LDF: laser Doppler flowmetry. LSCI: laser speckle kontrast bildebehandling. R: rotte. H: menneskelig. M: musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I tilfeller som involverer mikrovaskulær dysfunksjon (f.eks diabetes, Akutt pankreatitt, perifere mikrovaskulær sykdommer, osv.), føre noen sykdommer til redusert blodstrøm. Annet enn endringer i blodstrømmen er det viktige indikatorer, som mikrovaskulær vasomotion, som speil mikrosirkulasjonen funksjonell status. Bestemt indikatoren, mikrovaskulær vasomotion, er vanligvis definert som oscillation av mikrovaskulær tonen i mikrovaskulær senger. Gjeldende protokoll kan en mikrovaskulær blodperfusjon overvåkingssystem for direkte visualisering og kvantitativ analyse av funksjonell status mikrovaskulær vasomotion. Vår microcirculatory evaluering tilnærming kan brukes selektivt til målrettet vev og organer ved å identifisere dynamiske endringer i blodperfusjon. Rapporter utgitt av andre grupper om bruk av laser Doppler for å bestemme rollen mikrovaskulær blodperfusjon i diabetes og sin komplikasjonene var oppsummert i tabell 1. I denne studien, for å demonstrere vår tilnærming, ble funksjonell status bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion diabetiker mus evaluert.
Mikrovaskulær vasomotion gjenkjennes som en parameter av funksjonell status mikrosirkulasjonen og er i stand til å regulere blod flyte perfusjon ved å justere fordelingen i lokale vev23. Microvasculature i bukspyttkjertelen, som kan deles i holmer, acini og kanaler, har vært studert i flere tiår. I utgangspunktet er dette separasjon av bukspyttkjertelen i ulike deler for bekvemmelighet bare fordi microvasculature er faktisk sammen og homogen som en organisk enhet24. Dette microvasculature nettverket støtter regulering av bukspyttkjertelen Holme blodstrøm. Derfor brukte vi parametere av funksjonell status, bestemmes av laser Doppler, representerer bukspyttkjertelen Holme microvasculature vasomotion. Imidlertid egenskapene bukspyttkjertelen arkitektur, vi fortsatt ikke å gjøre en vurdering etter anvender det aktuelle metoden for å fastslå om blodperfusjon er avledet fra endokrine del eller fra exocrine del av bukspyttkjertelen. Bruke Holme-spesifikke kan merking fargestoffer, som dithizone og nøytral rød, bli en av de mulige måtene å forstå dette problemet, i hvert fall til en viss grad.
Et viktig aspekt av måling trinnet er avstanden mellom sonden og bukspyttkjertelen vev. En upassende avstand gir en kunstig økt blodstrøm lesing. Fysisk kraften til vev og organ som en probespissen vil redusere mikrovaskulær blodstrøm. Minimal trykk bør derfor brukes når tar målinger. Et annet punkt å merke seg er makt lasere. Kraftige lasere generelt skade lett microvessels i bukspyttkjertelen Holme, så frekvensen av laserstrålen må kontrolleres, i begrensninger. For generelle og tidsmessige målinger anbefales en frekvens på 1 Hz eller mindre. For å unngå lokaliserte konsumpsjon av mikrovaskulær vasomotion kapasitet (inkludert kontraktile og avslapning) og additiv effekt, foreslås multipunkt besluttsomhet og flytte området etter hver måling i eksperimenter.
I gjeldende metoden brukes PU dataene til å representere blod fluks av mikrovaskulær blodstrøm. Egenskapene av mikrovaskulær blodstrøm i mikrosirkulasjonen er det ikke mulig å fastslå den absolutte flyt enheten (f.eks mL/min/100 g av bestemte organer eller vev). Derfor er vurdering parameteren systemet brukes her basert på den relative blod flyt perfusjon enheten. Wavelet analyse, rask Fourier transform og andre spektral analysealgoritmer er vanlige metoder utføre laser Doppler signaler. I den nåværende protokollen etablerte vi en tilnærming som bruker hemodynamic parametere (dvs. blodperfusjon, amplitude, frekvens og relativ hastighet) for å vise funksjonell status mikrovaskulær vasomotion. Videre er at målingen knyttet til dybden av målet og sonde design, som er generelt ca 1 mm. Dermed kan tykkere eller kompakt organer og vev ikke være passende for bruk av laser Doppler og for den gjeldende. I tillegg, fordi dataene fra blodet flyt perfusjon kan bli påvirket av andre forhold som fører til merkbare endringer, inkludert temperatur, fuktighet, ytre lys og endringer i plasseringen av musene, skal noen regler følges under eksperimentelle forhandlingene. Laboratoriet må opprettholde konstant temperatur og fuktighet, og ekstern belysning må være skjermet. Det anbefales å fikse mus for å unngå endringer i posisjon. Det antas at disse strategiene kan overvinne begrensningene ovenfor og vil øke nøyaktigheten av blod flyte perfusjon data.
Fordelen av nåværende protokollen sammenligning med andre i litteratur er at det er følsom og responsive til den lokale mikrovaskulær vasomotion av vev og organer. Dette vil lette bredere anvendelse av metoden til vurdering eller undersøkelse av mikrosirkulasjonen, spesielt funksjonell status mikrovaskulær vasomotion, i både klinisk og laboratorial forskning. Programmene inkluderer men er ikke begrenset til: iskemi visualisering, blod perfusjon vurdering og evaluering av funksjonell status mikrovaskulær vasomotion. Avslutningsvis våre metoden kan brukes til å undersøke og evaluere bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær vasomotion i mus i vivo funksjonell status og kunne møte klinisk måtte vurdere mikrosirkulasjonen funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Peking Union Medical College Youth fondet og grunnleggende forskning midlene sentral universitetene (Grant nr. 3332015200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoorVMS-LDF2 | Moor Instruments | GI80 | PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data |
| MoorVMS-PC Software | Moor Instruments | GI80-1 | Software of MoorVMS-LDF2 |
| Calibration stand | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration base | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration flux standard | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| One Touch UltraEasy glucometer | Johnson and Johnson | #1955685 | Confirm hyperglycemia |
| One Touch UltraEasy strips | Johnson and Johnson | #1297006 | Confirm hyperglycemia |
| Streptozotocin | Sigma-Aldrich | S0130 | Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3) |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Working concentration 3 % |
| Ethanol | Sinopharm Inc. | 200121 | Working concentration 75 % |
| Sucrose | Amresco | 335 | Working concentration 10 % |
| Medical gauze | China Health Materials Co. | S-7112 | Surgical |
| Blunt-nose forceps | Shang Hai Surgical Instruments Inc. | N-551 | Surgical |
| Surgical tapes | 3M Company | 3664CU | Surgical |
| Gauze sponge | Fu Kang Sen Medical Device CO. | BB5447 | Surgical |
| Scalpel | Yu Lin Surgical Instruments Inc. | 175C | Surgical |
| Skin scissor | Carent | 255-17 | Surgical |
| Suture | Ning Bo Surgical Instruments Inc. | 3325-77 | Surgical |
| Syringe and 25-G needle | MISAWA Inc. | 3731-2011 | Scale: 1 ml |
References
- Aalkjaer, C., Nilsson, H. Vasomotion: cellular background for the oscillator and for the synchronization of smooth muscle cells. Br J Pharmacol. 144 (5), 605-616 (2005).
- Serne, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., IJzerman, R. G., Stehouwer, C. D. Microvascular dysfunction: a potential pathophysiological role in the metabolic syndrome. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
- Carmines, P. K. Mechanisms of renal microvascular dysfunction in type 1 diabetes: potential contribution to end organ damage. Curr Vasc Pharmacol. 12 (6), 781-787 (2014).
- Holowatz, L. A. Human cutaneous microvascular ageing: potential insights into underlying physiological mechanisms of endothelial function and dysfunction. J Physiol. 586 (14), 3301 (2008).
- De Boer, M. P., et al. Microvascular dysfunction: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Microcirculation. 19 (1), 5-18 (2012).
- Nilsson, G. E., Tenland, T., Oberg, P. A. Evaluation of a laser Doppler flowmeter for measurement of tissue blood flow. IEEE Trans Biomed Eng. 27 (10), 597-604 (1980).
- Chen, D., et al. Relationship between the blood perfusion values determined by laser speckle imaging and laser Doppler imaging in normal skin and port wine stains. Photodiagnosis Photodyn Ther. 13 (1), 1-9 (2016).
- Fuchs, D., Dupon, P. P., Schaap, L. A., Draijer, R. The association between diabetes and dermal microvascular dysfunction non-invasively assessed by laser Doppler with local thermal hyperemia: a systematic review with meta-analysis. Cardiovasc Diabetol. 16 (1), 11-22 (2017).
- Yaginuma, N., Takahashi, T., Saito, K., Kyoguku, M. The microvasculature of the human pancreas and its relation to Langerhans islets and lobules. Pathol Res Pract. 181 (1), 77-84 (1986).
- Brissova, M., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes beta cell regeneration. Cell Metab. 19 (3), 498-511 (2014).
- de Moraes, R., Van Bavel, D., Gomes Mde, B., Tibirica, E. Effects of non-supervised low intensity aerobic excise training on the microvascular endothelial function of patients with type 1 diabetes: a non-pharmacological interventional study. BMC Cardiovasc Disord. 16 (1), 23-31 (2016).
- Humeau-Heurtier, A., Guerreschi, E., Abraham, P., Mahe, G. Relevance of laser Doppler and laser speckle techniques for assessing vascular function: state of the art and future trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 659-666 (2013).
- Park, H. S., Yun, H. M., Jung, I. M., Lee, T. Role of Laser Doppler for the Evaluation of Pedal Microcirculatory Function in Diabetic Neuropathy Patients. Microcirculation. 23 (1), 44-52 (2016).
- Sun, P. C., et al. Microcirculatory vasomotor changes are associated with severity of peripheral neuropathy in patients with type 2 diabetes. Diab Vasc Dis Res. 10 (3), 270-276 (2013).
- Pan, Y., et al. Effects of PEMF on microcirculation and angiogenesis in a model of acute hindlimb ischemia in diabetic rats. Bioelectromagnetics. 34 (3), 180-188 (2013).
- Jumar, A., et al. Early Signs of End-Organ Damage in Retinal Arterioles in Patients with Type 2 Diabetes Compared to Hypertensive Patients. Microcirculation. 23 (6), 447-455 (2016).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25-33 (2016).
- Forst, T., et al. Retinal Microcirculation in Type 1 Diabetic Patients With and Without Peripheral Sensory Neuropathy. J Diabetes Sci Technol. 8 (2), 356-361 (2014).
- Hu, H. F., Hsiu, H., Sung, C. J., Lee, C. H. Combining laser-Doppler flowmetry measurements with spectral analysis to study different microcirculatory effects in human prediabetic and diabetic subjects. Lasers Med Sci. 31 (1), 1-8 (2016).
- Klonizakis, M., Manning, G., Lingam, K., Donnelly, R., Yeung, J. M. Effect of diabetes on the cutaneous microcirculation of the feet in patients with intermittent claudication. Clin Hemorheol Microcirc. 61 (3), 439-444 (2015).
- Khazraei, H., Shafa, M., Mirkhani, H. Effect of ranolazine on cardiac microcirculation in normal and diabetic rats. Acta Physiol Hung. 101 (3), 301-308 (2014).
- Fujita, T., et al. Increased inner ear susceptibility to noise injury in mice with streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61 (11), 2980-2986 (2012).
- Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14 (4-5), 403-438 (2007).
- Chawla, L. S., et al. Vascular content, tone, integrity, and haemodynamics for guiding fluid therapy: a conceptual approach. Br J Anaesth. 113 (5), 748-755 (2014).
