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Developmental Biology

मच्छर के लार्वा में जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक जीन वितरण वेक्टर के रूप में एक संयोजक मच्छर Densovirus का प्रयोग

Published: October 6, 2017 doi: 10.3791/56121
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

Summary

हम vivo डिलिवरी सिस्टम में एक गैर दोषपूर्ण संयोजक एडीज aegypti densovirus (AaeDV) विकसित करने के लिए एक कृत्रिम intronic लघु आरएनए अभिव्यक्ति रणनीति का उपयोग कर रिपोर्ट । निर्माण, पैकेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया है, और rAaeDV वैक्टर के मात्रात्मक विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में लार्वा संक्रमण के लिए वर्णित है ।

Abstract

vivo में microinjection व्यक्तिगत मच्छरों में जीन कार्यों का विश्लेषण करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जीन हस्तांतरण तकनीक है । हालांकि, इस विधि एक और अधिक तकनीकी रूप से मांग आपरेशन की आवश्यकता है और जटिल प्रक्रियाओं, खासकर जब उनके छोटे आकार, अपेक्षाकृत पतली और नाजुक छल्ली, और उच्च मृत्यु दर, जो अपने आवेदन की सीमा के कारण लार्वा में इस्तेमाल किया शामिल है । इसके विपरीत, जीन वितरण के लिए वायरल वैक्टर extracellular और intracellular बाधाओं को दुर्गम विकसित किया गया है । इन प्रणालियों आसान हेरफेर, उच्च जीन transduction दक्षता, जीन अभिव्यक्ति की दीर्घकालिक रखरखाव, और vivo मेंलगातार प्रभाव का उत्पादन करने की क्षमता के फायदे हैं । मच्छर densoviruses (MDVs) मच्छर-विशिष्ट, छोटे एकल असहाय डीएनए वायरस है कि प्रभावी रूप से मच्छर कोशिकाओं में विदेशी न्यूक्लिक एसिड उद्धार कर सकते हैं; हालांकि, प्रतिस्थापन या संयोजक वायरस बनाने के लिए विदेशी जीन की प्रविष्टि आम तौर पर पैकेजिंग और/या प्रतिकृति क्षमताओं, जो वितरण वैक्टर के रूप में इन वायरस के विकास के लिए एक बाधा है की एक हानि का कारण बनता है ।

साथ ही, हम vivo डिलिवरी सिस्टम में एक गैर-दोषपूर्ण संयोजक एडीज aegypti densovirus (AaeDV) विकसित करने के लिए एक कृत्रिम intronic लघु-आरएनए एक्सप्रेशन स्ट्रैटेजी का इस्तेमाल करते हुए रिपोर्ट करते हैं । rAaeDV वैक्टर के निर्माण, पैकेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं, और लार्वा संक्रमण के लिए वर्णित हैं ।

इस अध्ययन को दर्शाता है, पहली बार के लिए, एक गैर दोषपूर्ण संयोजक MDV माइक्रो आरएनए (miRNA) अभिव्यक्ति प्रणाली के विकास की व्यवहार्यता, और इस प्रकार मच्छर में जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने और के लिए एक आधार की स्थापना मच्छर जनित रोगों को नियंत्रित करने के लिए वायरल paratransgenesis के आवेदन । हमने दिखाया है कि एडीज albopictus 1सेंट instar लार्वा आसानी से और प्रभावी रूप से लार्वा प्रजनन स्थल के पानी के शरीर में वायरस शुरू करने से संक्रमित हो सकता है और विकसित rAaeDVs को व्यक्त करने या नीचे दस्तक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लार्वा में एक विशिष्ट लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति, मच्छर जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक उपकरण उपलब्ध कराने ।

Introduction

मलेरिया, डेंगू बुखार, zika बुखार, और पीले बुखार जैसे मच्छर जनित रोगों, प्रमुख अंतरराष्ट्रीय सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्याओं है कि वैश्विक संक्रामक रोग का बोझ1,2के एक महत्वपूर्ण अंश के लिए खाते में जारी कर रहे हैं । पारंपरिक कीटनाशकों, जो वैक्टर के जवाब में इस्तेमाल किया गया है, मच्छर जनित रोगों की रोकथाम के लिए स्थाई एकीकृत मच्छर नियंत्रण रणनीति का एक प्रमुख घटक हैं । हालांकि, इस तरह की रणनीतियों के लिए अपेक्षाकृत अप्रभावी या अवांछनीय कारण जुड़े नकारात्मक पर्यावरणीय प्रभावों के रूप में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मच्छर आबादी में प्रतिरोध के विकास में साबित हो3,4। इन कारणों के लिए, वहाँ मच्छर नियंत्रण के वैकल्पिक तरीकों के लिए एक तत्काल की जरूरत है, और बाँझ पुरुष मच्छरों की रिहाई और रोगजनक प्रतिरोधी मच्छरों का उत्पादन करने के लिए ट्रांसजेनिक तरीकों का उपयोग नई नियंत्रण रणनीतियों के रूप में आशाजनक पैदा हुई है । के लिए प्रभावी नए नियंत्रण विधियों, जैसे सुरक्षित और प्रभावी दृष्टिकोण विकसित करने के लिए vivo में जीन डिलिवरी, मच्छर जीन समारोह के व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता है ।

प्लाज्मिड डीएनए, डबल कतरा आरएनए (dsRNA) या छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) के प्रत्यक्ष microinjection मच्छरों में vivo जीन वितरण विधि में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाता है । वास्तव में, मच्छरों के ट्रांसजेनिक उपभेदों के उत्पादन में अभी भी भ्रूण microinjection की एक प्रक्रिया5,6,7पर भरोसा करते हैं । हालांकि, microinjection कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, इस तकनीक तकनीकी तौर पर मांग है और जटिल प्रक्रियाओं शामिल है । दूसरा, इंजेक्शन भ्रूण, लार्वा, कोषस्थों, और वयस्क, जो सीधे लक्ष्य जीव की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है के लिए एक शारीरिक अपमान का कारण बनता है । तीसरा, यह microinjection के लिए मच्छर के लार्वा को स्थिर करना मुश्किल है क्योंकि ज्यादातर एक जलीय निवास स्थान में रहते है और एक विशेषता wriggling आंदोलन के अधिकारी हैं । चौथा, 1st-2एन डी instar लार्वा के आकार में 4th instar और पुराने लार्वा की तुलना में 10-से 20 गुना छोटे होते हैं, और पूर्व के cuticles अधिक नाजुक होते हैं । इन सुविधाओं के पुराने चरणों में उन लोगों की तुलना में 1st-2एनडी instar लार्वा में हेरफेर करने के लिए मुश्किल बना । संयुक्त, इन कारकों लार्वा के लिए एक कम पोस्ट इंजेक्शन जीवित रहने की दर में योगदान (लगभग 5%)8वयस्कों की तुलना में । एसोसिएटेड extracellular और intracellular बाधाओं को दूर करने के लिए वायरल आधारित डिलिवरी सिस्टम विकसित किया गया है । इन प्रणालियों आसान हेरफेर, उच्च transduction दक्षता, दीर्घकालिक और अभिव्यक्ति की मजबूत स्तर, और vivo मेंलगातार प्रभाव का उत्पादन करने की क्षमता के फायदे हैं । इसलिए, जीन वितरण प्रणाली का उपयोग retroviruses, lentiviruses, और एडिनोवायरस व्यापक रूप से सेल लाइनों और मॉडल प्रजातियों inmammalian इस्तेमाल किया गया है । Sindbis वायरल अभिव्यक्ति प्रणाली पहले वयस्क मच्छर में जीन समारोह का विश्लेषण किया गया था; इसके अलावा, सुरक्षा चिंताओं, हालांकि, इंजेक्शन अभी भी वायरल संक्रमण के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है9। हालांकि, dsRNA समाधान में लार्वा सोख द्वारा मौखिक प्रसव पहले एक व्यवहार्य वितरण पद्धति के रूप में बताया गया है, यह छोटी आरएनए समारोह विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त है10। तो, प्रभावी वायरल प्रसव के तरीकों अभी भी मच्छरों के लिए विकसित किया जाना चाहिए ।

मच्छर densoviruses (MDVs) Parvoviridaeके Densovirinae उपपरिवार का हिस्सा हैं, और जीनस Brevidensovirus11के भीतर सभी लेकिन एक गिर जाते हैं । MDV virions गैर-ढंक रहे है और एक एकल फंसे डीएनए (ssDNA) जीनोम और एक icosahedral कैप्सिड (व्यास में 20 एनएम) से मिलकर बनता है । वायरल जीनोम आकार में लगभग 4 केबी है और मेजबान कोशिकाओं के नाभिक के भीतर की प्रतिकृति है । MDVs पर्यावरण में अपेक्षाकृत स्थिर है और मच्छरों के लिए उच्च विशिष्टता के साथ एक संकीर्ण मेजबान रेंज दिखा । इन वायरस के प्रसार और मच्छर आबादी में स्वाभाविक रूप से जारी रखने की क्षमता है और लगभग सभी अंगों और इन कीड़ों के ऊतकों midgut, Malpighian नलिकाओं, वसा शरीर, पेशियां, न्यूरॉन्स, और लार ग्रंथियों सहित, आक्रमण कर सकते हैं12.

बरकरार MDV जीनोम प्लाज्मिड वैक्टर में उपक्लोन किया जा सकता है प्लाज्मिड-आधारित संक्रामक क्लोन का उत्पादन; जब इन क्लोनों मच्छर कोशिकाओं में वितरित कर रहे हैं, वायरल जीनोम प्लाज्मिड वेक्टर से निकाला जाता है, और संक्रामक वायरल कणों का उत्पादन कर रहे हैं । क्योंकि MDV एक छोटे ssDNA जीनोम है, संक्रामक क्लोन आसानी से निर्माण कर रहे है और वायरल जीनोम आसानी से हेरफेर किया जा सकता है11,13। इन विशेषताओं MDV मच्छर जीवविज्ञान की जांच के लिए एक मूल्यवान एजेंट बनाते हैं । हालांकि, क्योंकि लगभग वायरल जीनोम अनुक्रम के सभी वायरल प्रसार के लिए आवश्यक है, प्रतिस्थापन या विदेशी जीन की प्रविष्टि के माध्यम से संयोजक वायरस के निर्माण वायरल पैकेजिंग में एक नुकसान का कारण बनता है और/या प्रतिकृति क्षमता है, जो बनाता है एक जीन वितरण वैक्टर के रूप में MDVs के विकास के लिए बाधा । इस के साथ साथ, हम एक कृत्रिम intronic लघु-आरएनए अभिव्यक्ति रणनीति का उपयोग कर vivo आरएनए वितरण प्रणाली है कि आसान प्लाज्मिड निर्माण के फायदे है और एक कार्यात्मक वायरस है कि उत्पादन कर सकते है के रखरखाव में एक गैर दोषपूर्ण rAaeDV विकसित करने के लिए रिपोर्ट जंगली प्रकार के वायरस की आवश्यकता के बिना मेजबान कोशिकाओं में स्थिर और दीर्घकालिक अभिव्यक्ति । इसके अतिरिक्त, इस विधि के लिए लार्वा की आसान transduction के लिए अनुमति देता है ।

निंनलिखित चरणों के लिए प्रोटोकॉल इस अध्ययन में वर्णित हैं: 1) एक intronic छोटी-आरएनए अभिव्यक्ति कैसेट, 2) संयोजक वायरस के उत्पादन की rAaeDVs एंकोडिंग के डिजाइन-सी 6/36 पैकेजिंग सेल लाइन, 3) सेल के मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग कर मुक्त rAaeDV जीनोम कॉपी नंबर, और 4) लार्वा वास के जल शरीर में वायरस का सीधा परिचय द्वारा एई. albopictus लार्वा के संक्रमण । कुल मिलाकर, इस काम का प्रदर्शन किया है कि विशिष्ट छोटे RNAs या लक्ष्य जीन को व्यक्त या मच्छर के लार्वा में नीचे खटखटाया विकसित MDV वितरण प्रणाली का उपयोग कर सकते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > सभी प्रोटोकॉल को दक्षिणी आयुर्विज्ञान विश्वविद्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

< p class = "jove_title" > 1. डिजाइनिंग एक आर्टिफिशियल Intron

< p class = "jove_content" > नोट: इस काम में इस्तेमाल होने वाले आर्टिफिशियल Intron की लंबाई में ६५ बीपी होता है, और सीक्वेंस 5 & #39;-GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG-3 & #39;.

  1. जगह Hpa मैं कृत्रिम intron के दोनों छोर पर पाबन्दी साइट ताकि Hpa i पाचन intron से plasmids जारी कर सकता है (see < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ A ).
  2. जगह दो Xba i के intron पर प्रतिबन्ध करेल ताकि Xba i पाचन छोटी-आरएनए अभिव्यक्ति अनुक्रम डालने के लिए किया जा सकता है ।
  3. एक डीएनए निर्माता से कृत्रिम intron की पूरी लंबाई डीएनए दृश्यों के रासायनिक संश्लेषण का आदेश । सिंथेटिक डीएनए बनाया एक मानक pUC19 प्लाज्मिड.
    में क्लोनिंग से है नोट: कृत्रिम intron के आवश्यक घटकों में कई आम सहमति न्यूक्लियोटाइड तत्व शामिल हैं, जिनमें एक 5 & #39; दाता ब्याह साइट (डी एस) अनुक्रम GUAAGAGU के साथ, एक संरक्षित शाखा-बिंदु अनुक्रम (बीपीएस) अनुक्रम UACUAAC, एक पाली के साथ-न्यूक्लियोटाइड पथ (PPT) के साथ अनुक्रम UCUUC (U) 10 , और एक 3 & #39;-स्वीकारर ब्याह स्थल (यथा) अनुक्रम GAUAUCCUGCAG के साथ (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 अ ). दो Xba मैं प्रतिबंध साइटों DS और बीपीएस कि छोटे-आरएनए अभिव्यक्ति दृश्यों डालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बीच पेश किया गया । स्तनधारी और मच्छर कोशिकाओं से इस कृत्रिम intron को प्रभावी ढंग से ब्याह करने की क्षमता पहले से पुष्टि की गई है < सुप वर्ग = "xref" > १४ .
< p class = "jove_title" > 2. डिजाइनिंग एक कृत्रिम Intronic लघु आरएनए एक्सप्रेशन कैसेट्स

< p class = "jove_content" > नोट: व्यक्ती या अंतर्जात miRNA के पछाड़ना के लिए, अनुक्रम एंकोडिंग प्रणेता miRNA या एक miRNA स्पंज डी एस और बीपीएस के बीच डाला गया । एक उदाहरण के रूप में सेवा करने के लिए, एक अंतर्जात प्रणेता miRNA से Ae. albopictus aal-let-7 संयोजक के लिए miRNA वायरल वैक्टर का निर्माण करने के लिए चुना गया था और पछाड़ना । एक विरोधी-7 स्पंज पहले वर्णित तरीकों < सुप वर्ग = "xref" > 15 के अनुसार डिजाइन किया गया था । लार्वा में लक्ष्य जीन नीचे दस्तक करने के लिए, हम विशिष्ट कृत्रिम miRNA (amiRNA) या लघु कांटा आरएनए (shRNA) ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग अनुक्रम डिजाइन < सुप वर्ग = "xref" > १६ , < सुप वर्ग = "xref" > १७ ; एक उदाहरण के रूप में सेवा करने के लिए, वी-ATPase उपइकाई A mRNA (प्रवेश सं. AY864912) को इस अध्ययन में लक्ष्य जीन के रूप में चुना गया. amiRNA को amiVTP के बाद भेजा जाएगा । प्री-miRNA, स्पंज, amiRNA, और shRNA के सभी जुगाड़ विवरण पूरक सारणी 1 में बताए गए हैं ।

  1. के प्रणेता miRNAs, miRNA स्पंज की पूर्ण लंबाई सीडीएनए दृश्यों के रासायनिक संश्लेषण का क्रम, और shRNA Xba के साथ मैं एक डीएनए निर्माता से दोनों सिरों पर प्रतिबंध साइटों ।
  2. का आदेश दिया डीएनए प्राप्त करने के बाद, 1 मिनट के लिए 10000-14000 x g पर डीएनए ब्लॉक युक्त ट्यूबों स्पिन सुनिश्चित करें कि सभी सूखे डीएनए ट्यूब के तल पर है ।
  3. DNase-मुक्त पानी में सूखे डीएनए को पुनर्स्थगित 10 एनजी के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए/& #181; L.
  4. पच प्लाज्मिड रीढ़ और डीएनए जुगाड़ के साथ Xba I पर ३७ & #176; ग 1 ज के लिए, और उसके बाद dephosphorylate 5 & #39; के सिरों के साथ रेखीय प्लाज्मिड रीढ़ की आंत क्षारीय फॉस्फेट (CIAP) के अनुसार निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल .
  5. सूचनाको CIAP ताप द्वारा ६० मिनट पर ६५ & #176; ग.
  6. एक १.०% agarose जेल चलाने के लिए और रैखिक रीढ़ की कटौती । फिर जेल टुकड़ा से डीएनए निकालें एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर निर्माता & #39 के बाद; s निर्देश.
  7. Ligate में डीएनए टुकड़ा backboneby टी-4 डीएनए ligase (5 U/& #181; L) पर 22 & #176; ग के लिए 1 ज.
  8. सक्षम ई कोलाई में २.७ कदम से बंधाव प्रतिक्रिया के उत्पादों को बदलने ( ई. कोलाई ) कोशिकाओं और प्लेट एक Lysogeny शोरबा पर (पौंड) एम्पीसिलीन युक्त प्लेट आगर (१०० & #181 की एकाग्रता पर; g/एमएल).
    1. एक हीट शॉक विधि के माध्यम से रूपांतरण प्रदर्शन < सुप वर्ग = "xref" > १८ , आणि उपयुक्त ई. कोलाई तनाव का उपयोग करें. उदाहरण के लिए, ई. कोलाई तनाव DH5 & #945; गर्मी सदमे परिवर्तन के लिए उपयोग करें ।
  9. कदम से एक एकल कॉलोनी उठाओ २.८ और 3 मिलीलीटर समृद्ध एम्पीसिलीन युक्त मध्यम (१०० के एक एकाग्रता में एक संस्कृति में मशीन की गर्मी & #181; जी/
  10. जीवाणु संस्कृति से प्लाज्मिड डीएनए निकालें एक मिनी-तैयारी निर्माता & #39 के बाद किट; एस निर्देश का उपयोग कर । एक डीएनए sequencing कंपनी के लिए नमूना भेजें.
    नोट: अंतर्जात miRNA के एक् सप्रेस या पछाड़ना के लिए, जुगाड़ एंकोडिंग के प्रणेता miRNA या एक miRNA स्पंज को दो Xba I साइट्स के बीच डाला गया । सभी miRNA अभिव्यक्ति या स्पंज constructs से कम होना चाहिए ४०० bp (वायरल जीनोम की लंबाई का 10%) वायरस की पैकेजिंग सीमा के कारण < सुप वर्ग = "xref" > १९ .
< p class = "jove_title" > 3. एक प्लाज्मिड रीढ़ में एक miRNA या shRNA अभिव्यक्ति कैसेट क्लोनिंग द्वारा एक rAeaDV निर्माण सृजन

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: pUCA, एक संक्रामक क्लोन एक pUCA प्लाज्मिड युक्त AaeDV जीनोम से मिलकर (३,९८१ nt) < सुप क्लास = "xref" > १९ , कृपया प्रो योनातन कार्लसन द्वारा प्रदान की गई थी और पहले विस्तार में वर्णित किया गया है < सुप वर्ग = "xref" > ११ . p7NS1-DsRed एक गैर संरचनात्मक प्रोटीन 1 (NS1) व्यक्त-रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (DsRed) p7 प्रमोटर से फ्यूजन प्रोटीन और विस्तार में वर्णित किया गया है कहीं < सुप क्लास = "xref" > 14 . एक मानव-विशिष्ट मीर-941-1 के प्रणेता < सुप वर्ग = "xref" > 20 और इसके स्पंज, एक तले shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में AaeDV में भी उपक्लोन थे ।

  1. Ligate पूर्व miRNA, स्पंज, shRNA या amiVTP Hpa मैं AaeDV की साइट में एक NS1 अभिव्यक्ति कैसेट pUCA प्लाज्मिड रीढ़ के रूप में प्रोटोकॉल २.४ २.७ के लिए कदम में वर्णित के रूप में कोडन ।
  2. Stbl3 सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में डीएनए बदलने और २.१०.
    3. करने के लिए चरण २.८ में वर्णित के रूप में एक सकारात्मक क्लोन का चयन करें
  3. के बाद, जीवाणु कोशिकाओं से rAaeDV प्लाज्मिड निकालें एक मैक्सी तैयारी किट का उपयोग कर निर्माता & #39 के बाद; एस निर्देश.
    नोट: Stbl3 या Stbl4 ई. कोलाई कोशिकाओं अवांछित आईटीआर पुनर्संयोजन को कम करने के लिए rAaeDV डीएनए परिवर्तन के लिए उपयोग किया जाना चाहिए । एक मैक्सी प्रस्तुत करने के लिए डीएनए की एक बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए rAaeDV प्लाज्मिड निकालने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए (& #62; १०० & #181; छ) । वायरस पैदा करने से पहले, rAaeDV प्लाज्मिड के अनुक्रम अखंडता हमेशा डीएनए अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए < सुप वर्ग = "xref" > २१ .
< p class = "jove_title" > 4. Transfecting सी 6/rAaeDV Plasmids

  1. कल्चर 6/रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) में 36 कक्षों १६४० मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin में एक 28 & #176; C मशीनर.
    2. 0 दिन पर
  2. , १० २५ cm में कक्षों को प्लेट करें < सुप क्लास = "xref" > 2 कल्चर कुप्पी 18-20 ज ने अभिकर्मक से पहले एक 1:2 कमजोर पड़ने 90-95% धाराप्रवाह कोशिकाओं में विभाजन ।
    नोट: 1 दिन तक, कोशिकाओं 90-95% संगम तक पहुंच जाना चाहिए ।
  3. पर दिन 1, transfect की श्रृंखला के साथ कोशिकाओं rAaeDV plasmids < सुप वर्ग = "xref" > २२ .
    1. पतला 10 & #181; जी DNA in ६०० & #181; RPMI के एल-१६४० मीडियम में एक microcentrifuge ट्यूब और धीरे से मिक्स करें. इस बीच, तैयार ६०० & #181; RPMI के एल-१६४० मीडियम और 25 & #181; l के अभिकर्मक रिएजेंट प्रति अभिकर्मक.
      2. कमरे के तापमान (आरटी) में 5-10 मिनट के लिए
    2. मशीन । फिर, ६२५ & #181; १६४०-अभिकर्मक रिएजेंट मिश्रण के १६४०-प्लाज्मिड डीएनए मिश्रण के एल जोड़ें.
    3. भ में 20-30 मिनट के लिए इस मिश्रण की मशीन । अभिकर्मक से पहले, RPMI-१६४० मध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
    4. (स्टेप 4.3.3) के बाद, the1640-अभिकर्मक रिएजेंट डीएनए प्लाज्मिड मिक्सचर को 25 सेमी 2 कल्चर कुप्पी और मशीन के लिए 6 ज पर 28 & #176; C.
      5. में जोड़ें
    5. पर लगभग 6 ज पद-अभिकर्मक, कालना अभिकर्मक मीडिया, RPMI-१६४० मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने, और फिर 10% FBS के साथ RPMI-१६४० मध्यम जोड़ें ।
      नोट: rAaeDV संक्रमण के उच्च दर से पता चलता है (९५%) Ae. albopictus लार्वा; हालांकि, हमारे अनुभव में, लगभग ५०% संक्रमित लार्वा में, संक्रमण प्राथमिक संक्रमण साइटों ( जैसे , गुदा पपिले और बाल खड़े कोशिकाओं) तक सीमित था । प्रसार < सुप वर्ग = "xref" > २३ . इसलिए, यदि एक से अधिक ऊतकों में लार्वा को संक्रमित करने के लिए एक की जरूरत है, एक दोषपूर्ण संयोजक वायरस व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन संक्रमण साइटों के दृश्य को सक्षम करने के लिए सह संक्रमित होना चाहिए । उदाहरण के लिए, दोषपूर्ण संयोजक DsRed व्यक्त वायरस का उत्पादन करने के लिए, p7NS1-DsRed (transfected एकाग्रता अनुपात 2:1 होना चाहिए) ऊपर वर्णित प्रक्रिया के अनुसार सी 6/36 कोशिकाओं में एक हेल्पर प्लाज्मिड के साथ सह cotransfection होना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 5. हार्वेस्टिंग rAaeDV Virions से Transfected सी 6/36 कोशिकाएं

  1. के बाद कोशिकाओं को 5 दिन अभिकर्मक । एक 5 मिलीलीटर गिलास ड्रॉपर द्वारा बर्तन में कोशिकाओं को हटाना और निलंबित, संस्कृति माध्यम के साथ ऊपर और नीचे pipetting । 15-एमएल ट्यूबों बाँझ करने के लिए सभी सेल निलंबन स्थानांतरण
  2. फ्रीज at-८० & #176; c या में 30 मिनट के लिए एक सूखी बर्फ/इथेनॉल स्नान और फिर गल ३७ & #176; c. भंवर के लिए 1 min. फ्रीज़-और-गल प्रक्रिया 3 बार दोहराएँ ।
  3. ४,८०० x g पर नमूना 20 मिनट के लिए 4 & #176; C. supernatant इकट्ठा और गोली त्यागें । फिर, एक ०.२२ & #181 के माध्यम से supernatant पारित; एम डिस्पोजेबल सिरिंज फिल्टर. Aliquot और स्टोर अंतिम शुद्ध विरिअन स्टॉक्स at-८० & #176; C.
    नोट: दोहराया फ्रीज-गल चक्र से बचें.
< p class = "jove_title" > 6. यों तो rAaeDV

  1. डीएनए मानकों को तैयार करते हैं. Linearize सभी rAaeDV plasmids के साथ Hpa मैं, और एक जेल निष्कर्षण किट के साथ पचा उत्पादों को शुद्ध < सुप वर्ग = "xref" > २४ .
  2. निरपेक्ष मात्रात्मक मानक वक्र का निर्माण और पहले वर्णित तरीकों के अनुसार वायरस के titer उपाय < सुप वर्ग = "xref" > २५ .
< p class = "jove_title" > 7. मच्छर Transduction

  1. वाश १०० १ st instar Ae. albopictus लार्वा तीन बार पानी का उपयोग करते हुए, और फिर, लार्वा को एक चोंच में ९५ मिलीलीटर पानी से युक्त करने के लिए स्थानांतरित करें । rAaeDV स्टॉक्स के 5 मिलीलीटर जोड़ें (१.०० x 10 10 प्रतियां/
    2. के अंतिम एकाग्रता)
  2. के लिए 24 ज पर 28 & #176; ग, लार्वा को तीन बार धोकर पानी से धो लें और फिर लार्वा को प्लेटों में वापस ले जाएं और नियमित रूप से खिलाएं ।
  3. मॉनिटर qPCR या वेस्टर्न ब्लाट के साथ लार्वा में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के स्तर (प्रतिनिधि परिणाम आंकड़े 3 और 4 में दिखाए जाते हैं).
    नोट: प्रतिदीप्ति सिग्नल डिटेक्शन पद्धति का उपयोग संक्रमित लार्वा को अधिक सटीकता से अलग करने के लिए किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, संयोजक वायरस व्यक्त DsRed से संक्रमित लार्वा से फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने के लिए, लार्वा को एक गुहा स्लाइड पर रखा जा सकता है और 2 दिनों के बाद संक्रमण होने तक हर 8 घंटे में एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है । एक बार फ्लोरोसेंट लार्वा का पता लगाया है, वे व्यक्तिगत प्लास्टिक टेस्ट कप में अलग किया जाना चाहिए बाद में निरंतर अवलोकन के लिए अनुमति देते हैं । कई ऊतकों के साथ लार्वा संक्रमित इस विधि का उपयोग कर पहचाना जा सकता है ।

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Representative Results

rAaeDV निर्माण के लिए रणनीतियाँ
मच्छर के लार्वा में DsRed जीन व्यक्त करने के लिए एक दोषपूर्ण rAaeDV वेक्टर उत्पन्न किया गया । जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड एक NS1-DsRed संलयन प्रोटीन के साथ कैसेट शामिल वीपी प्रोटीन (चित्रा 1ए) नष्ट कर दिया । rAaeDV plasmids युक्त अभिव्यक्ति construction for miRNA, miRNA स्पंज, shRNA और amiRNA डिजाइन किए गए ( चित्रा 1बीमें दिखाया गया है) । उदाहरण के लिए, एक rAaeDV वेक्टर aal-let-7 मच्छर के लार्वा में व्यक्त करने के लिए उत्पंन किया गया था । परिणामस्वरूप प्लाज्मिड वायरल NS1 एक्सॉन में एक intronic पूर्व aal-चलो-7 कैसेट निहित (चित्रा 1बी) । एक rAaeDV वेक्टर एक intronic aal युक्त-चलो-वायरल NS1 एक्सॉन में 7 स्पंज अभिव्यक्ति कैसेट aal नीचे दस्तक करने के लिए उत्पंन किया गया था-चलो-मच्छर के लार्वा में 7 अभिव्यक्ति (चित्रा 1बी और चित्रा 2बी) । एक rAaeDV shRNA वेक्टर और एक rAaeDV amiRNA वेक्टर युक्त intronic shRNA और प्री-amiRNA एक्सप्रेशन कैसेट्स, क्रमशः, मच्छर के लार्वा (चित्रा 2) में वी-ATPase mRNA नीचे दस्तक करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

rAaeDV titers रेखीय प्रतीपगमन विश्लेषण के साथ जनरेट किया गया कोई मानक वक्र पर आधारित परिकलित कर रहा है
y-अक्ष मानक डीएनए आणविक एकाग्रता के Log10 मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है, और एक्स-अक्ष सीटी मूल्य इंगित करता है । सीटी संख्या (x-अक्ष) और Log10 (एकाग्रता) मान (y-अक्ष) एक अच्छा सहसंबंध (R2 = ०.९९८८) प्रदर्शित किया और समीकरण y =-0.288 x + १३.८७ (चित्र 3) को पूरा । रेखीय समीकरण (तालिका 1) का उपयोग करके नमूनों की rAaeDV titers की गणना करें । प्रोटोकॉल (चरण ६.२ और तालिका 1) में वर्णित विधि का उपयोग करते हुए, उच्च titers rAaeDV (4 मिलीलीटर, & #62; ७.६५ x 1010 कणों/एमएल) की कटाई की गई । संयोजक वायरस (VrepUCA-7, VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s, और VrepUCA-shct) transfecting द्वारा उत्पन्न किए गए इसी संक्रमण क्लोन pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, pUCA-shct में सी 6/36 कोशिकाओं (वर्गों 3, 4 और 5) ।

rAaeDV वैक्टर के miRNA और पछाड़ना कुशलता का निर्धारण
उदाहरण में, १०० १ सेंट instar लार्वा बराबर मात्रा (१.०० x 10 10 कणों/एमएल) युक्त rAaeDV के साथ इलाज किया गया intronic पूर्व-let-7 अभिव्यक्ति वेक्टर, intronic चलो-7 स्पंज अभिव्यक्ति वेक्टर, मानव-विशिष्ट पूर्व मीर-941-1 अभिव्यक्ति वेक्टर या मीर-941-1 स्पंज अभिव्यक्ति वेक्टर लार्वा वास के जल शरीर में वायरस जोड़कर । पांच दिनों के संक्रमण के बाद, aal की अभिव्यक्ति-let-7 qPCR द्वारा निर्धारित किया गया था (चित्रा 4, n = 3; पूरक तालिका 2) । आईए-7 स्तरों कि लार्वा में तीन जैविक प्रतिकृति का मतलब ± एसडी के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं, काफी वृद्धि हुई है या पूर्व-let-7-व्यक्त rAaeDV द्वारा कमी आई (२,८४३.३१ ± ८०.७२%, p & #60; ०.०००१, t-परीक्षण) द्वारा व्यक्त और आईए-7-स्पंज-एक्सप्रेस rAaeDV (downregulated द्वारा ७४.७८ ± १.६०%, पी & #60; ०.०००१, टी-टेस्ट) क्रमशः ।

rAaeDV वैक्टर के वी-ATPase mRNA पछाड़ना दक्षता की निगरानी
कुल १०० १ सेंट instar लार्वा समान मात्रा (१.०० x 10 10 कणों/एमएल) के intronic amiRNA-व्यक्त rAaeDV, intronic shRNA-व्यक्त rAaeDV, मानव-विशिष्ट पूर्व मीर-941-1-व्यक्त rAaeDV orscramble के साथ इलाज किया गया लार्वा वास के जल शरीर में विषाणु को जोड़कर shRNA-व्यक्त rAaeDV. संक्रमण के पांच दिन बाद वी-ATPase mRNA की अभिव्यक्ति qPCR द्वारा निर्धारित की गई थी (चित्र 5, n = 3; पूरक तालिका 2) । वि ATPase स्तर लार्वा में तीन जैविक प्रतिकृति के अर्थ ± एसडी के रूप में प्रदर्शित amiRNA-व्यक्त rAaeDV द्वारा काफी कम था (downregulated द्वारा ४३.०१ ± ६.३७%, पी = ०.००११, टी परीक्षण) और intronic shRNA-व्यक्त rAaeDV (downregulated द्वारा ७२.८८ ± ५.७४%, पी = ०.०००१, टी परीक्षण) ।

Figure 1
चित्र 1 : योजनाबद्ध संगठन संयोजक AaeDV plasmids. (क) पीएन और pVP वायरल प्रमोटरों NS1/NS2 जीन और उपाध्यक्ष जीन, क्रमशः की अभिव्यक्ति ड्राइव । p7NS1-DsRed प्लाज्मिड में, DsRed जीन NS1 जीन से जुड़े थे । (ख) pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-941-1, pUCA-941-1s, pUCA-shct, pUCA-shVTP और pUCA-amiVTP में कृत्रिम introns होते हैं, जिनमें aal-let-7, aal-चलो-7 स्पंज, is-मीर-941-1, है-मीर-941-1 स्पंज, तले हुए shRNA, वी-ATPase shRNA और आर्टिफिशियल miRNA, क्रमशः, जो NS1 जीन की Hpaसाइट में क्लोन किया गया । कृत्रिम intron एक ब्याह दाता (डी एस) और एक स्वीकारकर्ता साइट (के रूप में) द्वारा flanked दिखाया गया है और एक शाखा बिंदु डोमेन (BrP), एक पाली-न्यूक्लियोटाइड पथ (PPT) और पूर्व miRNA । miRNA स्पंज या कृत्रिम miRNA अनुक्रम 5 ब्याह साइट और BrP के बीच intron के अंदर डाला जाता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : कृत्रिम intronic microRNA (miRNA) और miRNA स्पंज और कृत्रिम miRNAs पैदा करने के लिए रणनीति की उत्पत्ति । (क) Intronic miRNA NS1 के एक प्रणेता दूत आरएनए (प्री-mRNA) के भीतर सह-लिखित है, जो pNS1 प्रवर्तक द्वारा संचालित किया जाएगा और आरएनए ब्याह करके पूर्व mRNA से बाहर सट गया. यद्यपि exons NS1 प्रोटीन संश्लेषण के लिए एक परिपक्व दूत आरएनए (mRNA) बनाने के लिए ligated हैं, पूर्व intron के साथ ब्याह miRNA आगे miRNA द्वारा परिपक्व Dicer में संसाधित है. (ख) विरोधी आईए-7 और मीर-941-1 construction को पैदा करने की रणनीति । विरोधी के संरेखण-7 और विरोधी मीर-aal के साथ 941-1 दृश्यों-चलो 7 और है-मीर-941-1, क्रमशः । विरोधी miRNA अनुक्रम और पूंछ क्षेत्रों के साथ बीज क्षेत्रों का पूरा मिलान दिखाया गया है । दोनों दो-7 और मीर-941-1 स्पंज तीन दोहराने antisense निर्माण (लाल पत्र) है कि aal को बांध कर सकते है-चलो 7 और है-मीर-941-1, क्रमशः । (ग) इस अध्ययन में प्रयुक्त miRNA-आधारित कृत्रिम miRNAs और shRNA के लिए अनुक्रम और पूर्वानुमानित प्रणेता संरचनाओं की भविष्यवाणी की गई है । परिपक्व कृत्रिम miRNAs और shRNA लाल रंग में दिखाया गया है, और उनके संबंधित लक्ष्य mRNA अनुक्रम नीले में हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : rAaeDV अनुमापन और परिकलित conce के लिए मानक वक्रntrations of MDVs. (a) वास्तविक समय qPCR एक pUCA मानक है कि 10 गुना बढ़ाई अनुपात से पतला था के साथ प्रदर्शन किया गया था, और सीटी मूल्य एक अबी ७५०० पर एक्सके रूप में मापा गया था । प्रतिलिपि संख्या चरण ६.२ और ६.३ के अनुसार निम्न सूत्र के साथ परिकलित किया गया था: प्रतिलिपि संख्या (y) =-०.२८८x + १०.८७; R2 = ०.९९८८ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : संयोजक MDV-मध्यस्थता aal-आईए-7 का इजहार और पछाड़ना में एई. albopictus लार्वा। (क) संयोजक विषाणु युक्त aal-let-7 एक्सप्रेशन कैसेट (बाएँ पैनल) के साथ संक्रमण के बाद लार्वा में अंतर्जात miRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण. (ख) एंटी-7 के निर्माण की दक्षता लार्वा (दायां पैनल) में निर्धारित की गई थी । है-मीर-941-1 और है-941-1 स्पंज (नकारात्मक नियंत्रण) व्यक्त की और downregulated-7 miRNAs, क्रमशः बेसल स्तर की तुलना में नियंत्रण समूह में मनाया । miRNA बहुतायत 5 एस rRNA को सामान्यीकृत किया गया था, और डेटा तीन जैविक प्रतिकृति के अर्थ ± एसडी के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं । T-परीक्षणों के महत्व के different स्तर पर प्रदर्शन किया गया । तारक संक्रमित और इसी नकली उपचारित लार्वा (चार तारांकन, p & #60; ०.०००१) के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : shRNA और amiRNA कैसेट युक्त संयोजक विषाणु के साथ संक्रमण के बाद वी-ATPase mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण. mRNA बहुतायत aalrpS7 को सामान्यीकृत किया गया. त्रुटि पट्टियों में V-ATPase mRNA व्यंजक के लिए 2− ΔΔCT मानों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते है Ae. albopictus में रीयल-टाइम RT-पीसीआर (* *, p & #60; ०.०१; * * *, p & #60; ०.००१) का मूल्यांकन किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: द संयोजक MDV ग टी मान qPCR द्वारा निर्धारित करने के लिए संगत x सूत्र में मान, जिसका परिकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है y मान. प्रत्येक 1 µ एल नमूना में वायरल जीनोम कॉपी संख्या समारोह शक्ति (10, y), जो अंततः ४० से गुणा किया गया था द्वारा प्राप्त किया गया था, वायरस निलंबन के वायरस एकाग्रता के लिए मूल्य परिवर्तित ।

Supplemental Table 1
पूरक तालिका 1: miRNA प्रणेता का अनुक्रम ।

Supplemental Table 2
पूरक तालिका 2: qPCR डेटा ।

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Discussion

यह महत्वपूर्ण है कि rAaeDV निर्माण की सीमा के दो महत्वपूर्ण बाधाओं को दूर करने के लिए । पहले दोषपूर्ण संयोजक वायरस का उत्पादन होता है । यह बताया गया है कि MDV एक वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है उचित रूप से व्यक्त करने के लिए विदेशी जीन आकार, बिच्छू कीट के रूप में विशिष्ट neurotoxins20 और GFP प्रोटीन; हालांकि, निर्माण रणनीति की परवाह किए बिना, एक बार MDV के ORFs डाला या exogenous जीन के साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं, virions स्वतंत्र रूप से जब तक एक सहायक प्लाज्मिड लापता अपरिहार्य वायरल प्रोटीन की आपूर्ति करने के लिए cotransfected है नहीं कर सकते । दोषपूर्ण वायरस माध्यमिक संचरण, जो दोषपूर्ण जीनोम के साथ मच्छरों में vivo में होता है में संलग्न करने में असमर्थ है । हमारे परिणाम एक intronic अभिव्यक्ति रणनीति है कि एक नए प्रतिमान है कि दोषपूर्ण जीनोम के साथ MDVs की सीमाओं को दूर करने के लिए मच्छरों में विदेशी जीन के कुशल वितरण सक्षम कर सकते है प्रदान करता है मांय ।

दूसरा है वायरल कैप्सिड के आकार से लगाए गए संयोजक वायरल जीनोम की मांग लंबाई सीमा । कुशल पैकेजिंग के लिए, जीनोम का आकार ४,४०० न्यूक्लियोटाइड (wt MDVs जीनोम की लंबाई का ११०%) से अधिक नहीं हो सकता । एक intronic miRNA अभिव्यक्ति कैसेट (miRNA अभिव्यक्ति कैसेट और कृत्रिम intron सहित) कोई ४०० से अधिक nt के AaeDV जीनोम में पेश किया जा सकता है । हालांकि संयोजक वायरस जीनोम की लंबाई अभी भी पैकेजिंग के लिए उपयुक्त है, इस वितरण प्रणाली में सुधार के लिए कमरा है । जीनोम की लंबाई में कमी की वजह से, यह दोषपूर्ण intronic अभिव्यक्ति रणनीतियों के बिना जीन व्यक्त करने के लिए मुश्किल है ।

यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि सी 6/36 कोशिकाओं के सफल अभिकर्मक और rAaeDV की पैकेजिंग को सक्षम करने के लिए स्वस्थ हैं । हालांकि, cationic liposome एजेंट यहां और वाणिज्यिक कीट सेल विशिष्ट अभिकर्मक रिएजेंट इस्तेमाल किया, सी 6/36 सेल अभिकर्मक (40-60%) की दक्षता में सुधार नहीं है । इसलिए, उच्च titer संयोजक वायरस फसल के लिए, यह पहले वर्णित विकास विशेषताओं पर आधारित अभिकर्मक के बाद 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए आवश्यक है14. इसके अतिरिक्त, सफल लार्वा संक्रमण के लिए, यह लार्वा 24-३६ h के लिए संक्रामक वायरस कणों के संपर्क में होने के लिए उच्च संक्रमण अनुपात23सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।

अंत में, intronic अभिव्यक्ति रणनीति यहां वर्णित पहले दोषपूर्ण MDV की पीढ़ी द्वारा लगाए गए बाधाओं को दूर करने के लिए है । यह कार्यनीति गैर-दोषपूर्ण संयोजक MDVs के उत्पादन को सक्षम बनाती है जो मच्छरों में miRNAs और लक्ष्य जीन को व्यक्त या downregulate कर सकती है. इस तकनीक जटिल लार्वा microinjection प्रक्रियाओं के उपयोग के बिना मच्छर जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक उपकरण प्रदान करता है और स्पष्ट वाणिज्यिक अनुप्रयोगों है । आगे की पढ़ाई डेंगू वायरस नियंत्रण के लिए मच्छर जीवविज्ञान और paratransgenesis की जांच के लिए बताई गई एक्सप्रेशन रणनीति के आवेदन का विस्तार होगा ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFC1200500 जिओ-Guang चेन), चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६७२०५४ और ८१३७१८४६), प्राकृतिक के अनुसंधान दल के कार्यक्रम से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । गुआंग्डोंग के विज्ञान फाउंडेशन (2014A030312016), और गुआंगज़ौ के वैज्ञानिक और तकनीकी कार्यक्रम (२०१५०८०२०२६३) । हम कृतज्ञता के लिए प्रोफेसर जोनाथन कार्लसन (कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय स्वीकार करते हैं) कृपया pUCA और p7NS1-GFP plasmids प्रदान करने के लिए और गंभीर रूप से इस पांडुलिपि पढ़ने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge machine Thermo Scientific 75004260
Centrifuge System Beckman Coulter 363118
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit Omega Biotech D6904
Purified Agar OXOID LP0028A
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) Thermo Scientific EF0651
FastDigest HpaI Thermo Scientific FD1034
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µL) Thermo Scientific EL0011
TransStbl3 Chemically Competent Cell Beijing Transgen Biotech CD521-01
Ampicillin  Beijing Tiangen Biotech RT501
Proteinase K Promega MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) Beijing Tiangen Biotech FP205

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक १२८ मच्छर densovirus जीन वितरण वेक्टर लघु आरएनए, एडीज albopictus वेक्टर कंट्रोल आर्टिफिशियल intron ।
मच्छर के लार्वा में जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक जीन वितरण वेक्टर के रूप में एक संयोजक मच्छर Densovirus का प्रयोग
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