Summary
우리는 비 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장, 및 애벌레 감염에 관해서는 뿐만 아니라 rAaeDV 벡터의 정량 분석에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.
Abstract
Vivo에서 microinjection 개별 모기의 유전자 기능 분석을 위한 가장 일반적으로 사용 되 진 전송 기술입니다. 그러나,이 방법을 기술적으로 요구 하는 작업이 더 필요 하 고 그들의 작은 크기, 상대적으로 얇고 깨지기 쉬운 표 피 및 높은 사망률, 그것의 응용 프로그램을 제한 하는 애벌레에서 사용 하는 경우에 특히 복잡 한 절차를 포함. 반면, 유전자 배달에 대 한 바이러스 성 벡터 extracellular와 세포 장벽을 극복 하 개발 되었습니다. 이러한 시스템 쉬운 조작, 높은 유전자 전달 효율, 유전자 발현의 장기적인 유지 관리 및 영구 효과 vivo에서생산 하는 것의 이점이 있다. 모기 densoviruses (MDVs)는 효과적으로 모기 세포;로 외국 핵 산을 제공할 수 있는 모기 관련, 작은 단일 가닥 DNA 바이러스 그러나, 교체 또는 일반적으로 재조합 바이러스를 만드는 외국 유전자의 삽입으로 배달 벡터가이 바이러스의 개발에 장애가 포장 또는 복제 능력의 손실을 발생 합니다.
여기, 우리가 아닌 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장 및 rAaeDV 벡터의 정량 분석 그리고 애벌레 감염에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.
이 학문은 설명 한다, 처음으로 비 결함 재조합 MDV 마이크로 RNA (miRNA) 식 시스템 개발, 따라서 모기에서 유전자의 기능 분석을 위한 강력한 도구를 제공 하 고 기본 설정의 타당성은 모기 품 어진 질병을 제어 하기 위한 바이러스 paratransgenesis의 응용 프로그램. 우리는 Aedes albopictus 1세인트 탈피 애벌레 감염 될 수 쉽게 그리고 효과적으로 사이트를 사육 하는 애벌레의 물 본문에 바이러스를 도입 하 여와 개발된 rAaeDVs overexpress 또는 노크 하는 데 사용 될 수 입증 된 유전자 모기의 기능 분석을 위한 도구를 제공 하는 유 충에 특정 대상 유전자의 표현.
Introduction
모기-품 어진 질병 말라리아, 황열병, 뎅기열, zika 발열 등은 계속 글로벌 전염 성 질병 부담1,2의 중요 한 일부분을 담당 하는 주요 국제 공중 보건 문제입니다. 벡터에 대 한 응답에 사용 된, 전통적인 살충제 모기 품 어진 질병의 예방에 대 한 지속 가능한 통합된 모기 제어 전략의 주요 구성 요소입니다. 그러나, 이러한 전략 상대적으로 효과 없는 또는 관련된 부정적인 환경에 미치는 영향 뿐만 아니라 모기 인구3,4내성의 진화로 인해 원하지 않는 것을 입증 했다. 이러한 이유로, 모기의 다른 방법에 대 한 긴급 한 필요 제어 및 불 임 남성 모기를 생산 하는 유전자 변형 방법의 사용 이며 병원 체 저항 모기의 릴리스 유망한 새로운 제어 전략으로 발현. 개발 효과적인 새로운 컨트롤 방법, vivo에서 유전자 전달 모기 유전자 기능의 포괄적인 분석에 대 한 안전 하 고 효과적인 방법으로 필요한 같은.
플라스 미드 DNA, 더블의 직접 microinjection RNA (dsRNA) 좌초 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)는 가장 일반적으로 사용 되 vivo에서 유전자 전달 방법 모기에. 사실, 모기의 유전자 변형 종자의 생산 여전히 태아 microinjection5,,67의 과정에 의존 합니다. 그러나, microinjection는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째,이 기술은 기술적으로 요구 하 고 복잡 한 절차를 포함 한다. 둘째, 주입 하면 태아, 애벌레, pupae, 및 성인 대상 생물의 생존에 직접적인 영향을 실제 모욕. 셋째, 대부분 수 중 서식 지에서 살고 먹 운동 특성을가지고 있기 때문에 microinjection에 대 한 모기 유 충을 무력화 하기가 어렵습니다. 넷째, 1st-2nd 탈피 애벌레의 크기는 10-에 20 배 작은 4번째 보다 탈피 및 오래 된 애벌레, 그리고 전 손톱 더 섬세 한. 이러한 기능 1st-2nd 탈피 애벌레 이전 단계에서 그들에 비해 조작 하기 어려울. 결합, 이러한 요소는 애벌레 (약 5%) 성인8에 비해 감소 후 주입 생존 율에 기여 한다. 바이러스 성 기반 전달 시스템 관련된 extracellular와 세포 장벽을 극복 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 시스템 쉬운 조작, 높은 변환 효율, 장기와 강력한 식의 수준과 영구 효과 vivo에서생산 하는 것의 이점이 있다. 따라서, 유전자 전달 시스템 활용 레트로 바이러스, lentiviruses, adenoviruses 널리 되었습니다 사용 모델 종 inmammalian 세포 라인. Sindbis 바이러스 식 시스템 이전 성인 모기;에 유전자 기능을 분석 하는 데 사용 되었다는 그러나 biosafety 관심사 외, 주입은 여전히 바이러스 감염9필요한 과정. DsRNA 해결책에 애벌레를 몸을 담글 하 여 구두 납품은으로 알려졌다 이전 가능한 전달 방법으로, 비록 작은 RNA 기능 분석10위해 적당 하다. 그래서, 효과적인 바이러스 전달 방법 아직도 모기에 대 한 개발 해야 합니다.
모기 densoviruses (MDVs) Parvoviridae, 그리고 Brevidensovirus11속에서 하나를 제외한 모든가 Densovirinae subfamily의 일부입니다. MDV virions 비 싸여 있으며 단일 가닥 DNA (ssDNA) 게놈과 icosahedral capsid의 구성 (20 nm 직경에서). 바이러스 성 게놈 크기에 약 4kb 이며 호스트 세포의 핵 내에서 복제 됩니다. MDVs 환경에서 상대적으로 안정 하 고 모기에 대 한 높은 특이성으로 좁은 호스트 범위를 보여. 이 바이러스를 확산 하 고 모기 인구에서 자연스럽 게 지속 가능성 있고 거의 모든 장기와 조직 midgut, 말 tubules, 뚱뚱한 몸, 근육, 신경, 그리고 침 샘12를 포함 하 여 이러한 곤충의 침입 수 있습니다.
그대로 MDV 유전자를 플라스 미드 기반의 전염 성 클론; 생성 하 플라스 미드 벡터에 subcloned 수 있습니다. 이러한 모기 세포에 배달, 바이러스 성 게놈 플라스 미드 벡터에서 추출 되 고 전염 성 바이러스 입자를 생산 됩니다. MDV 작은 ssDNA 게놈 있기 때문에, 전염 성 클론은 쉽게 건설 하 고 바이러스 성 게놈 쉽게 조작된11,13를 수 있습니다. 이러한 특성 모기 생물학 검토를 위해 귀중 한 에이전트 MDV 확인 합니다. 그러나, 바이러스 성 게놈 시퀀스의 거의 모든 바이러스 확산을 위해 필수적 이다, 때문에 교체를 통해 재조합 바이러스의 생성 또는 외국 유전자의 삽입 하면 손실 바이러스 성 포장 및/또는 복제 능력에 만듭니다 있는 유전자 납품 벡터로 MDVs의 개발에 대 한 장벽 했다. 여기, 우리는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 시스템을 개발 비 결함 rAaeDV vivo에서 RNA 배달은 쉽게 플라스 미드 건설의 이점 및 생성할 수 있는 기능 바이러스의 유지 보수를 보고 야생 형 바이러스에 대 한 필요 없이 호스트 세포에 안정적이 고 장기적인 식입니다. 또한이 메서드는 애벌레의 쉬운 변환에 대 한 수 있습니다.
다음 단계에 대 한 프로토콜은이 연구에서 설명 하는: 1) rAaeDVs 인코딩 intronic 작은 RNA 식 카세트, C6/36 포장 셀을 사용 하 여 재조합 바이러스 입자의 2) 생산의 디자인 라인, 셀 무료의 3) 정량 분석 rAaeDV 게놈 숫자, 및 4 복사) Ae albopictus 애벌레 애벌레 서식 지의 물 몸으로 바이러스의 직접 소개에 의해의 감염. 전반적으로,이 작품에는 특정 작은 RNAs 또는 대상 유전자 overexpressed 하거나 수 개발된 MDV 전달 시스템을 사용 하 여 모기 애벌레에 뜨 시연 했다.
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Protocol
모든 프로토콜 윤리 위원회의 남부 의료 대학에 의해 승인 했다.
1. 인공 Intron 설계
참고:이 작업에 사용 되는 인공 intron는 65 길이, 및 순서에 혈압이 5 '-GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG-3 '.
- Hpa 배치 나 제한 사이트 인공 intron의 양쪽 끝에 그래서 그 Hpa 나 소화 플라스 미드 ( 그림 1 참조)에서 intron을 해제할 수 있습니다.
- 장소 두 Xba 나 제한 사이트는 intron에서 그래서 그 Xba 나 소화 작은 RNA 식 시퀀스를 삽입 하는 데 사용할 수 있습니다.
- 는 DNA 제조 업체에서 인공 intron의 전장 DNA 시퀀스의 화학 합성을 주문. 합성 DNA 생성은 표준 pUC19 플라스 미드에 클로닝에서.
참고: 인공 intron의 필수 구성 요소 포함 5를 포함 하 여 여러 합의 뉴클레오티드 요소, ' GUAAGAGU, UACUAAC, 폴 리 pyrimidine 순서 보존된 지점 포인트 시퀀스 (BPS) 시퀀스와 기증자 스플라이스 사이트 (DS) 로 (PPT) 10 시퀀스 UCUUC(U) 3 '-수락자 스플라이스 사이트 (AS) 시퀀스 GAUAUCCUGCAG ( 그림 1 A). 두 개의 Xba 나 제한 사이트 DS와 작은 RNA 식 시퀀스를 삽입 하는 데 사용할 수 있는 BPS 사이 소개 되었다. 이 인공 intron 포유류와 모기 세포에서 효과적으로 결합 하는 능력 이전 확인된 14 되었습니다.
2. 설계는 인공 Intronic 작은 RNA 식 카세트
참고: overexpression 또는 생 miRNA의 최저, 전조 미르 미르 스폰지를 인코딩 시퀀스 DS와 BPS 사이 삽입 했다. 예를 들어, 봉사 애 albopictus aal-하자-7에서 생 전조 미르 미르 overexpression 및 최저 재조합 형 바이러스 성 벡터를 생성 선정 됐다. 반대로 let 7 스폰지는 앞에서 설명한 방법 15에 따라 설계 되었습니다. 애벌레에서 대상 유전자를 허물고, 우리 설계 된 특정 인공 미르 (amiRNA) 또는 온라인 소프트웨어 16 , 17;를 사용 하 여 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 순서 예를 들어, V ATPase 소 단위를 mRNA 역할을 (취득 no. AY864912)는이 연구에서 유전자를 대상으로 선정 됐다. amiRNA 것입니다 라고 하 amiVTP이. 사전-미르, 스폰지, amiRNA, 및 shRNA 모든 시퀀스 세부 사항을 보충 표 1에 설명 되어 있습니다.
- 전조 miRNAs, 미르 스폰지, 및 Xba와 shRNA의 전장 cDNA 시퀀스의 화학 합성 주문 나 DNA 제조 업체에서 양쪽 끝에 제한 사이트.
- 정렬 된 DNA, 스핀 10000-14000 x DNA 블록을 포함 하는 관을 받은 후 g 모두 DNA 건조 되도록 1 분에 대 한 튜브의 하단에는.
- 10 ng / µ L의 최종 농도 달성 하기 위해 DNase 무료 물에 말린된 DNA resuspend.
- 소화 플라스 미드 백본 및 DNA 시퀀스를 Xba와 내가 1 시간 동안 37 ° C에서 그리고 다음 5 dephosphorylate '와 종 아리 장 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (CIAP) 제조 업체에 따라 선형화 플라스 미드 등뼈의 끝 ' s 프로토콜 .
- 65에서 60 분이 열에 의해 비활성화 CIAP ° c.
- 는 1.0 %agarose 젤을 실행 하 고 선형화 등뼈를 잘라. 다음 제조 업체에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 ' s 지침.
- Ligate 1 h. 22 ° C에서 backboneby T4 DNA 리가 (5 U / µ L)으로 DNA 조각
- 유능한 대장균 (대장균)에 2.7 단계 세포 및 암 피 실린 (100 µ g/mL의 농도)에 포함 된 Lysogeny 국물 (파운드) 한 접시에 접시에서 결 찰 반응의 제품은 변환.
- 수행 열 충격 방법 18를 사용 하 여 적절 한 대장균을 통해 변환 스트레인. 예를 들어 대장균 긴장 DH5α를 사용 하 여 열 충격 변화에 대 한.
- 선택에서 단일 식민지 2.8 고 3 mL의 문화에서 품 어 농축 (100 µ g/mL의 농도)에서 중간 포함 암 피 실린.
- 제조 업체에 따라 소형 예비 키트를 사용 하 여 세균성 문화에서 플라스 미드 DNA를 추출 ' s 지시. DNA 시퀀싱 회사 샘플 보내기.
참고: overexpression 또는 생 miRNA의 최저, 전조 미르 미르 스폰지를 인코딩 시퀀스 삽입 되었다 2 사이 Xba 나 사이트. 모든 미르 식 또는 스폰지 구조 400 보다 짧은 있어야 바이러스 19의 포장 제한 때문에 bp (바이러스 성 게놈 길이의 10%).
3. RAeaDV 구문 생성 하 플라스 미드 등뼈로 미르 또는 shRNA 식 카세트를 복제
참고: 촬영, 촬영 플라스 미드 포함 하는 AaeDV 게놈의 구성 하는 전염 성 클론 (3,981 nt) 19, 친절 하 게 교수 조나단 칼 슨에 의해 제공 되었다 고 이전 세부 사항 11에서 설명 하고있다. 비 구조 단백질 1 (NS1)를 표현 하는 p7NS1-DsRed-p7 발기인에서 빨간 형광 성 단백질 (DsRed) 융합 단백질 되었습니다 자세히 다른 14 설명. 인간 전용 미르-941-1 전조 20와 그것의 스폰지, 스크램블된 shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), 또한 부정적인 제어로 AaeDV에 subcloned 했다.
- Pre-미르, 스폰지, shRNA 또는 amiVTP 식 카세트 Hpa 사이트에 선의 촬영 플라스 미드 백본 프로토콜 단계 2.4 2.7에에서 설명 된 대로 AaeDV NS1 코딩 영역.
- 유능한 대장균 세포 및 단계 2.8 2.10에서에서 설명한 대로 긍정적인 클론을 선택 Stbl3 DNA 변환.
- 제조 업체에 따라 맥시 준비 키트를 사용 하 여 세균 세포에서 rAaeDV 플라스 미드 추출, 다음 ' s 지침.
참고: Stbl3 또는 Stbl4 대장균 세포 원치 않는 ITR 재결합을 최소화 하기 위해 rAaeDV DNA 변환에 대 한 활용 되어야 합니다. 맥시 prep rAaeDV 플라스 미드 DNA의 대량을 추출 하는 데 사용할 해야 (> 100 µ g). 바이러스를 생성 하기 전에 rAaeDV 플라스 미드의 시퀀스 무결성 분석 해야 합니다 항상 여 DNA 시퀀싱 21.
4. RAaeDV 플라스 미드와 transfecting C6/36 셀
- 문화 C6/36 세포 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 28 ° C 배양 기에서 1% 페니실린/스 포함.
- 0 일에 접시 10 25 cm 2 문화 플라스 크에 세포 transfection 90-95%는 1:2 희석에 confluent 셀을 분할 하기 전에 18-20 h.
참고: 하루 1, 셀에 도달 해야 90-95% 합류. - 하루에 1, rAaeDV 플라스 미드 22 시리즈와 셀 transfect.
- Microcentrifuge 튜브에서 RPMI 1640 매체의 600 µ L에 10 µ g의 DNA를 희석 하 고 부드럽게 혼합. 한편, RPMI 1640 매체의 600 µ L 25 µ L 당 transfection transfection 시 약의 준비.
- 품 실 온 (RT)에서 5-10 분 그런 다음, 1640-플라스 미드 DNA 혼합물에 1640 transfection 시 혼합물의 625 µ L를 추가.
- 는 실시간에 20-30 분 동안이 혼합물을 품 어 Transfection, 전에 씻어 RPMI 1640 매체의 2 mL로 두 번 셀.
- RT 후 보육 (4.3.3 단계), 25 cm 2 문화 플라스 크를 the1640 transfection 시 DNA 플라스 미드 혼합물을 추가 하 고 28에서 6 h에 대 한 품 어 ° c.
- 약 6 h 후 transfection에 제거 transfection 미디어 RPMI 1640 매체의 5 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 10%와 RPMI 1640 매체 추가 FBS.
그러나 참고: rAaeDV Ae albopictus 애벌레 감염 (95%)의 높은 속도에서는,, 우리의 경험에서는, 감염 된 애벌레의 거의 50%에서 감염 없이 1 차 감염 사이트 (예를 들어, 항문 용의자와 다름 셀)에 제한 했다 보급 23. 따라서, 여러 조직에서 애벌레를 감염 시킬 필요가 있는 경우에, 형광 단백질을 표현 하는 결함이 재조합 바이러스 감염 사이트의 시각화 수 있도록 공동 감염 되어야 합니다. 예를 들어 DsRed을 표현 하는 결함이 있는 재조합 바이러스 생산, p7NS1-DsRed 위에서 설명한 절차에 따라 C6/36 세포로 도우미 플라스 미드와 공동 transfected 이어야 한다 (cotransfection 농도 비율 2:1 이어야 함).
5. 페 C6/36 세포에서 rAaeDV Virions 수확
- 수확 세포 transfection 후 5 일. 꺼내 려 하 고 5 mL 유리 dropper, 문화 매체를 위아래로 pipetting으로 요리에 셀 중단. 모든 셀 정지 균 15 mL 튜브에 전송.
- -80 ° C에서 드라이 아이스/에탄올 목욕 30 분에 고정 하 고 37에 녹여 다음 1 분에 대 한 ° C. 소용돌이 동결 및 해 동 절차 3 번 반복.
- 원심 4 °C.Collect은 상쾌한에 20 분 동안 4800 x g에서 샘플 하 고 펠 릿을 삭제. 그런 다음는 상쾌한 통과 0.22 μ m 일회용 주사기 필터. 최종 정제 virion-80에서 주식 약 수 및 저장소 ° c.
참고: 반복된 freeze-thaw 주기 방지.
6. RAaeDV 측정
- 준비 DNA 표준. 선형화 Hpa와 모든 rAaeDV 플라스 미드 나, 젤 추출 키트 24 소화 제품을 정화.
- 절대 양적 표준 곡선을 생성 하 고 앞에서 설명한 방법 25에 따라 바이러스 titer 측정.
7. 모기 변환
- 세척 100 1 세인트 탈피 Ae albopictus 애벌레 세 번 사용 하 여 이온 물, 그리고 다음, 95 이온된 물 들어 있는 비 커에 애벌레를 전송. RAaeDV 주식 (최종 농도 10 복사본/10ml x 1.00)의 5 mL을 추가.
- 품 어 24 28 ° c, h 이온된 수를 사용 하 여 시간 3 애벌레를 세척 하 고 다음 애벌레는 접시에 다시 전송 하 고 정기적으로 피드.
- 모니터링 정량 또는 서쪽 오 점 (대표 결과 그림 3과 4에 나와 있습니다) 애벌레에 대상 유전자 발현의 수준.
참고: 형광 신호 검출 방식 보다 정확 하 게 감염 된 유 충을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 DsRed을 표현 하는 재조합 형 바이러스에 감염 된 애벌레에서 형광 신호를 감지, 애벌레 수 오목 함 슬라이드에 배치 되며 감염 된 후 2 일까지 모든 8 h는 거꾸로 형광 현미경 관찰. 형광 애벌레 감지 되 면 이후 지속적인 관찰 수 있도록 개별 플라스틱 테스트 컵으로 분리 되어야 한다. 이 메서드를 사용 하 여 여러 조직 감염 된 애벌레를 확인할 수 있습니다.
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Representative Results
RAaeDV 건설을 위한 전략
결함이 rAaeDV 벡터 모기 애벌레에 DsRed 유전자를 표현 하기 위해 생성 되었습니다. 결과 플라스 미드 부사장 단백질 삭제 (그림 1A) 함께 NS1 DsRed 융합 단백질 카세트를 포함. rAaeDV 미르에 대 한 식 구문을 포함 하는 플라스 미드, 미르 스폰지, shRNA 및 amiRNA 설계 되었습니다 ( 그림 1B참조). 예를 들어 rAaeDV 벡터 모기 애벌레에 있는 aal-하자-7 overexpress 생성 했다. 결과 플라스 미드 바이러스 NS1 exon (그림 1B)에서 intronic 사전-aal-하자-7 카세트 포함. RAaeDV 벡터 바이러스 NS1 exon에 intronic aal-하자-7 스펀지 식 카세트를 포함 하는 aal-하자-7 식 모기 유 충 (그림 1B 와 그림 2B)를 허물고 생성 되었습니다. RAaeDV shRNA 벡터와 rAaeDV amiRNA 벡터 intronic shRNA 및 pre-amiRNA 식 카세트, 각각, 모기 유 충 (그림 2C)에 있는 V ATPase mRNA를 허물고 사용 되었다.
RAaeDV titers를 선형 회귀 분석으로 생성 된 표준 곡선에 따라 계산
Y는 Log10의 값을 나타내는 표준 DNA 분자 농도, 그리고 x 축 CT 값을 나타냅니다. CT 번호 (x 축) 및 Log10 (농도) 값 (y 축) 표시 좋은 상관 관계 (R2 = 0.9988)와 방정식 y =-0.288 x + 13.87 (그림 3). 선형 방정식 (표 1)를 사용 하 여 샘플의 rAaeDV titers를 계산 합니다. RAaeDV의 높은 titers 프로토콜 (단계 6.2 및 표 1)에서 설명한 메서드를 사용 하 여 (4 mL, >10 입자/10ml x 7.65) 수확 했다. 재조합 형 바이러스 (VrepUCA-7, VrepUCA-기, VrepUCA amiVTP, VrepUCA shVTP, VrepUCA941 1, VrepUCA-941-1s, 및 VrepUCA-shct) 해당 감염 클론 촬영-7, 촬영-기, 촬영-amiVTP, pUCA941 1, pUCA941-1s, transfecting에 의해 생성 된 C6/36 세포 (섹션 3, 4 및 5)로 촬영 shct.
RAaeDV 벡터의 miRNA overexpression 및 최저 효율 결정
예제에서는 100 1세인트 탈피 애벌레 intronic 사전 let-7 식 포함 하는 rAaeDV의 동일한 금액 (10 입자/10ml x 1.00)로 치료 했다 벡터, intronic 하자 7 스펀지 식 벡터 인간 관련 사전 miR-941-1 식 벡터 또는 애벌레 서식 지의 물 체 내에 바이러스를 추가 하 여 미르-941-1 스펀지 식 벡터. 감염 후 5 일 aal-하자-7 식 정량에 의해 결정 되었다 (그림 4, n = 3; 추가 표 2)입니다. 하자-7 레벨 3 생물의 평균 ± SD는 애벌레에 복제로 표시 되는 실질적으로 증가 했다 하거나 사전-let-7-표현 rAaeDV 감소 (2,843.31 ± 80.72%, p overexpressed < 0.0001, t-검정)와 하자 7 스폰지 표현 rAaeDV (74.78 ± 1.60%, p downregulated < 0.0001, t-검정), 각각.
RAaeDV 벡터의 V ATPase mRNA 최저 효율 모니터링
총 100 1세인트 탈피 애벌레 intronic amiRNA 표현 rAaeDV, intronic shRNA 표현 rAaeDV, 인간 전용 사전-miR-941-1-표현 rAaeDV의 동일한 금액 (10 입자/10ml x 1.00)로 치료 했다 orscramble 애벌레 서식 지의 물 체 내에 바이러스를 추가 하 여 shRNA 표현 rAaeDV 감염 후 5 일 V ATPase mRNA의 식 정량에 의해 결정 되었다 (그림 5, n = 3; 추가 표 2)입니다. 3 생물의 평균 ± SD는 애벌레에 복제 표시 V ATPase 수준 실질적으로 표현 하는 amiRNA rAaeDV에 의해 감소 되었다 (downregulated 43.01 ±6.37%, p = 0.0011, t-검정) 및 intronic shRNA 표현 rAaeDV (downregulated 72.88 ±에 의해 5.74%, p = 0.0001, t-검정).
그림 1 : 재조합 AaeDV 플라스 미드의 도식 조직. (A) pNS와 pVP 바이러스 성 발기인 드라이브 NS1 및 NS2 유전자와 VP 유전자의 식을 각각. P7NS1-DsRed 플라스 미드에 DsRed 유전자는 NS1 유전자를 융합 했다. (B) 촬영-7, 촬영-기, 촬영-941-1, 촬영-941-1s, 촬영-shct, 촬영-shVTP 및 촬영 amiVTP 포함 aal-하자-7, aal-하자-7 스폰지, 있다-미르-941-1, 있다-미르-941-1 스폰지, 스크램블된 shRNA, V ATPase shRNA 인공 introns 인공 미르, 각각,는 Hpa사이트에 복제 된 NS1 유전자의. 인공 intron flanked (DS) 결합 기증자와 수락자 사이트 (AS)에 의해 표시 되 고 지사 지점 도메인 (BrP), 폴 리-pyrimidine 지역 (PPT) 및 pre-미르를 포함 한다. MiRNA 스폰지 또는 인공 미르 시퀀스 5 스플라이스 사이트와 사이 BrP. intron 안에 삽입은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 인공 intronic 예측에 관한 (미르)와 미르 스폰지와 인공 miRNAs 생성 하기 위한 전략의 속. (A) Intronic 미르는 전조 NS1, pNS1 발기인에 의해 구동 되며 RNA 접합에 의해 사전 mRNA에서 죽 습 하의 메신저 RNA (mRNA 이전) 내에서 베낀 공동. exons는 NS1 단백질 합성에 대 한 성숙한 메신저 RNA (mRNA)를 출혈, 사전-미르와 접합된 한 intron는 추가 처리 성숙 miRNA에 Dicer에 의해. (B) 항 let-7과 반대로 miR-941-1 구조를 생성 하기 위한 전략. 반대로 let-7과 반대로 miR-941-1의 각각 aal-하자-7와 있다-미르-941-1, 시퀀스. 안티-미르 시퀀스와 꼬리 영역 씨앗 지역 일치 하는 완전 한 표시 됩니다. 하자-7과 미르-941-1 스폰지 3 반복 센스 구문 (붉은 글자) 바인딩할 수 있는 aal-하자-7과는-미르-941-1, 각각 포함 되어 있습니다. (C) 시퀀스 고 미르 기반 인공 miRNAs와 shRNA이이 연구에 사용 된에 대 한 예측된 선구자 구조. 성숙한 인공 miRNAs와 shRNA 빨간색으로 표시 되 고 그들의 관련된 대상 mRNA 순서는 파란색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : RAaeDV 적정 및 계산된 conce 표준 곡선ntrations MDVs. (A) 실시간 정량의 10 배 확대 비율, 희석은 촬영 표준으로 수행 하 고 CT 값 x로 ABI 7500에 측정 되었다. 복사본 수 단계 6.2 및 6.3 다음 수식에 따라 계산 했다: 복사 번호 (y) =-0.288x + 10.87; R2 = 0.9988. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 재조합 MDV 중재 aal-하자-7 overexpression 및 최저 Ae albopictus 애벌레. Aal-하자-7 식 카세트 (왼쪽된 패널)를 포함 하는 재조합 형 바이러스 감염 후 애벌레에 생 미르 식의 (A) 분석. (B) 항 let 7의 효율 구조 애벌레 (오른쪽 창)에서 결정 되었다. 고 있다-미르-941-1 고은-941-1 스폰지 (부정적인 제어) overexpressed downregulated 성숙 하자 7 miRNAs 제어 그룹에서 관찰 하는 기초 수준에 비해 각각. miRNA 풍부 5S rRNA를 정규화 되었는지 및 데이터 평균 ± SD 3 생물의 복제로 표시 됩니다. T-테스트 마찰 레벨의 의미에서 수행 했다. 별표 표시 감염 및 해당 모의 치료 애벌레 간의 통계적으로 유의 한 차이 (4 p 별표 < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : ShRNA 및 amiRNA 카세트를 포함 하는 재조합 형 바이러스 감염 후 V ATPase mRNA 발현의 분석. mRNA 풍부 했다 aalrpS7로 정규화 됩니다. 오차 막대 실시간 RT-PCR에 의해 평가 Ae albopictus 애벌레에 V ATPase mRNA 식 2−ΔΔCT 값의 표준 편차를 나타내는 (* *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 재조합 MDV C T 정량에 의해 결정 하는 값에 해당 하는 x 값을 계산 하는 데 사용 되는 수식에는 y 값. 각 1 µ L 샘플에서 바이러스 성 게놈 복사 번호 바이러스 서 스 펜 션의 바이러스 농도 값 변환 함수 파워 (10, y), 40을 곱한 했다 궁극적으로,에 의해 얻은.
추가 표 1: 미르 선구자의 시퀀스입니다.
추가 표 2: 정량 데이터입니다.
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Discussion
그것은 두 rAaeDV 건설을 제한 하는 주요 장벽을 극복 하는 것이 중요입니다. 첫 번째 결함 재조합 바이러스의 생산 이다. 그것은 알려졌다 적절 하 게 표현 하는 벡터 크기의 GFP 단백질; 전갈 곤충 전용 neurotoxins20 등 외국 유전자 MDV를 사용할 수 있습니다. 그러나, 건설 전략에 MDV ORFs 삽입 또는 세 유전자를 대체 하는 일단 virions 형성할 수 없습니다 독립적으로 도우미 플라스 미드 누락 된 필수적인 바이러스 성 단백질 공급 cotransfected 하지 않으면. 결함이 있는 바이러스는 비보에 결함이 있는 유전자와 모기에 발생 하는 보조 전송에 종사 하는 수 없습니다. 우리의 결과 모기로 외국 유전자의 효율적인 배달을 사용 하도록 결함이 있는 유전자와 MDVs의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임을 제공 하 여 intronic 식 전략을 확인 합니다.
두 번째는 바이러스 성 capsid의 크기에 의해 부과 된 재조합 형 바이러스 성 게놈의 까다로운 길이 제한이. 효율적인 포장에 대 한 게놈 크기 4400 뉴클레오티드 (wt MDVs 게놈의 길이의 110%)을 초과할 수 없습니다. intronic 미르 식 카세트 (를 포함 하 여 미르 식 카세트와 인공 intron) 더 이상 400의 nt AaeDV 게놈으로 소개 될 수 있다. 재조합 형 바이러스 게놈의 길이 여전히 포장에 적합,이 전달 시스템 개선 위한 방이 있다. 게놈 길이 제한 때문에 결함이 intronic 식 전략 없이 유전자를 표현 하기가 어렵습니다.
C6/36 세포는 성공적인 transfection 및 rAaeDV의 포장 수 있도록 건강을 위해 필수적입니다. 그러나, 여기에 사용 되는 양이온 liposome 시 약 및 상업 곤충 세포 특정 transfection 시 약, C6/36 세포 transfection (40-60%)의 효율성을 개선 하지 않으면. 따라서, 높은 titer 재조합 바이러스를 수확, 세포 transfection 앞에서 설명한 성장 특성14에 따라 후 5 일 동안 유지 하는 데 필요한입니다. 또한, 성공적인 애벌레 감염에 대 한 애벌레 감염 성 바이러스 입자 24-높은 감염 비율23되도록 36 h에 대 한 접촉 수를 위해 필수적 이다.
끝으로, 여기에 설명 된 intronic 식 전략 결함이 MDV의 세대에 의해 부과 하는 장벽을 극복 하기 위해 처음 이다. 이 전략에는 비 결함 재조합 MDVs overexpress 수 또는 모기에 downregulate miRNAs와 대상 유전자의 생산 수 있습니다. 이 기술은 복잡 한 애벌레 microinjection 절차의 사용 없이 모기 유전자의 기능 분석을 위한 도구를 제공 합니다 그리고 분명 상용 애플 리 케이 션을 했다. 더 연구는 모기 생물학과 뎅기열 바이러스 컨트롤에 대 한 paratransgenesis를 조사 하는 설명된 식 전략의 응용 프로그램을 확장 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국에서 재정 지원을 인정 (샤 오 Guang 첸에 2016YFC1200500), 국립 자연 과학 재단의 중국 (81672054 및 81371846), 자연의 연구 팀 프로그램 광 (2014A030312016)의 과학 재단 하 고 광주 (201508020263)의 과학 및 기술 프로그램. 친절 하 게 촬영 및 p7NS1 GFP 플라스 미드를 제공 하 고 비판적으로이 원고를 읽고 우리는 기꺼이 교수 조나단 칼 슨 (콜로라도 주립 대학)을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
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