Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استخدام دينسوفيروس المؤتلف البعوض ناقل توصيل جينات للتحليل الوظيفي للجينات في يرقات البعوض

Published: October 6, 2017 doi: 10.3791/56121
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

Summary

نحن تقرير استخدام اصطناعية إينترونيك صغيرة رنا تعبير استراتيجية لتطوير غير تالف المؤتلف دينسوفيروس (آيدف) بعوض الزاعجة المصرية في فيفو نظام التسليم. ويرد وصف إجراء مفصل للبناء والتعبئة والتغليف، والتحليل الكمي لناقلات رايدف، وكذلك فيما يتعلق بالإصابة باليرقات.

Abstract

في فيفو microinjection هو تقنية نقل الجينات الأكثر استخداماً لتحليل وظائف الجينات في البعوض الفردية. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب أكثر تقنيا مطالبين بعملية وينطوي على إجراءات معقدة، لا سيما عند استخدامها في اليرقات بسبب صغر حجمها، وبشرة رقيقة وهشة نسبيا، وارتفاع معدل الوفيات، التي تحد من تطبيقها. وفي المقابل، وضعت النواقل الفيروسية لإيصال الجينات التغلب على الحواجز خارج الخلية وداخل الخلية. هذه النظم لها المزايا من السهل التلاعب وتوصيل الجينات عالية الكفاءة والصيانة على المدى الطويل من التعبير الجيني والقدرة على إنتاج الآثار المستمرة في فيفو. دينسوفيروسيس البعوض (مدفس) هي فيروسات الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل الخاصة بالبعوض، والصغيرة التي يمكن أن يحقق فعالية الأحماض النووية الأجنبية إلى خلايا البعوض؛ بيد الاستبدال أو الإدراج للجينات الأجنبية لإنشاء الفيروسات المؤتلف عادة ما يسبب فقدان قدرات التعبئة والتغليف و/أو النسخ المتماثل، مما يشكل عائقا أمام تطوير هذه الفيروسات نواقل التسليم.

هنا، نحن التقرير باستخدام استراتيجية تعبير الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي إينترونيك اصطناعي لتطوير غير تالف المؤتلف دينسوفيروس (آيدف) بعوض الزاعجة المصرية في فيفو نظام التسليم. ويرد وصف إجراءات مفصلة للبناء والتغليف والتحليل الكمي لناقلات رايدف، والإصابة بعدوى اليرقات.

وتوضح هذه الدراسة، للمرة الأولى، إمكانية وضع غير تالف المؤتلف MDV الصغرى الحمض النووي الريبي (ميرنا) تعبير نظام، وهكذا يوفر أداة قوية للتحليل الوظيفي للجينات في البعوض ووضع أساس تطبيق باراترانسجينيسيس الفيروسية للسيطرة على الأمراض التي ينقلها البعوض. أظهرنا أن Aedes albopictus 1st الطور اليرقات يمكن أن تكون مصابة بسهولة وفعالية بإدخال الفيروس في الجسم المياه من اليرقات تربية الموقع وأن رايدفس المتقدمة يمكن أن تستخدم أوفيريكسبريس أو هدم تعبير الجينات المستهدفة المحددة في يرقات، توفير أداة للتحليل الوظيفي للبعوض الجينات.

Introduction

الأمراض التي ينقلها البعوض مثل الملاريا وحمى الضنك والحمى زيكا والحمى الصفراء، وهي المشاكل الرئيسية للصحة العامة الدولية التي ما زالت تستأثر بجزء كبير من العبء العالمي للأمراض المعدية1،2. مبيدات الحشرات التقليدية، التي جرى استخدامها في الاستجابة للنواقل، عنصرا رئيسيا لاستراتيجية مكافحة البعوض المتكاملة المستدامة للوقاية الأمراض التي ينقلها البعوض. ومع ذلك، أثبتت هذه الاستراتيجيات أن تكون نسبيا غير فعالة أو غير مرغوب فيه بسبب الآثار البيئية السلبية المرتبطة بها، فضلا عن تطور مقاومة البعوض السكان3،4. لهذه الأسباب، هناك حاجة ملحة إلى طرق بديلة من البعوض السيطرة، واستخدام أساليب معدلة وراثيا لإنتاج البعوض الذكور العقيمة والإفراج عن البعوض المقاوم الممرض نشأت كاستراتيجيات مراقبة جديدة واعدة. تطوير التحكم فعالة جديدة الأساليب، مثل نهج آمنة وفعالة للتسليم في فيفو الجينات، والتحليل الشامل لوظيفة الجينات البعوض مطلوب.

Microinjection مباشرة من بلازميد الحمض النووي، مزدوج تقطعت الحمض النووي الريبي (dsRNA) أو الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA) هو الأكثر استخداماً في فيفو الجينات طريقة التسليم في البعوض. في الواقع، لا تزال تعتمد إنتاج سلالات معدلة وراثيا من البعوض في عملية جنين microinjection5،،من67. ومع ذلك، قد microinjection العديد من القيود. أولاً، أن هذا الأسلوب تقنيا تطالب وينطوي على إجراءات معقدة. ثانيا، يؤدي الحقن إهانة مادية للأجنة واليرقات، الخوادر، والكبار، مما يؤثر تأثيراً مباشرا على صلاحية الكائن المستهدف. وثالثاً، من الصعب شل يرقات البعوض ل microinjection نظراً لأن معظم يعيش في الموائل المائية وتمتلك خاصية مشارعهم الحركة. الرابع، حجم 1st-2nd يرقات الطور 10 إلى 20 ضعفا أصغر من ذلك من 4ال الطور واليرقات الأكبر سنا، والبشرة السابقة أكثر حساسية. هذه الميزات تجعل من الصعب على التلاعب 1st-2nd يرقات الطور مقارنة بتلك التي في مراحل قديمة. جنبا إلى جنب، تسهم هذه العوامل بمعدل انخفاض حقن بعد بقاء لليرقات (حوالي 5 في المائة) بالمقارنة مع البالغين8. وقد وضعت منظومات الإيصال الفيروسية التغلب على الحواجز خارج الخلية وداخل الخلية المرتبطة بها. هذه النظم لها المزايا من السهل التلاعب وتوصيل عالية الكفاءة ومستويات قوية وطويلة الأجل للتعبير والقدرة على إنتاج الآثار المستمرة في فيفو. ولذلك، استخدام الجينات قد تم إيصالها الاستفادة من الفيروسات القهقرية و lentiviruses غدية على نطاق واسع خطوط الخلايا إينماماليان والأنواع النموذجية. نظام التعبير الفيروسية سيندبيس قد استخدمت سابقا لتحليل وظيفة الجينات في البعوضة الكبار؛ وباﻹضافة إلى شواغل السلامة الأحيائية، ولكن الحقن لا يزال عملية ضرورية للعدوى الفيروسية9. وعلى الرغم من التسليم الشفوي بامتصاص اليرقات في حل دسرنا أفيد سابقا كأسلوب تسليم ممكناً، أنها غير ملائمة ل تحليل وظيفة الحمض النووي الريبي الصغيرة10. لذلك، لا يزال ينبغي وضع طرق التسليم الفيروسية الفعالة للبعوض.

دينسوفيروسيس البعوض (مدفس) جزء من فصيلة دينسوفيريناي بارفوفيريداي، وتقع كافة ولكن واحد في جنس بريفيدينسوفيروس11. فيريونس MDV هي غير المغلفة وتتكون من جينوم الحمض النووي (سدنا) واحد-الذين تقطعت بهم السبل وقفيصه icosahedral (20 نانومتر في القطر). الجينوم الفيروسي حوالي 4 كيلو بايت في الحجم، ويتم تكرارها داخل نواة الخلايا المضيفة. مدفس مستقرة نسبيا في البيئة وإظهار مجموعة مضيف ضيقة مع خصوصية عالية للبعوض. هذه الفيروسات يمكن أن تنتشر وتستمر بطبيعة الحال في السكان البعوض، ويمكن أن تغزو تقريبا جميع الأعضاء والأنسجة من هذه الحشرات، بما في ذلك الأمامي، Malpighian الأنابيب، والدهون في الجسم والجهاز العضلي، والخلايا العصبية، والغدد اللعابية12.

يمكن أن سوبكلونيد سليمة MDV الجينوم إلى بلازميد موجهات لإنتاج الحيوانات المستنسخة على أساس بلازميد المعدية؛ عندما يتم تسليم هذه النسخ إلى خلايا البعوضة، يستخرج الجينوم الفيروسي من ناقلات بلازميد، وتنتج الجسيمات الفيروسية المعدية. بسبب MDV جينوم ssDNA صغيرة، استنساخ المعدية هي التي شيدت بسهولة والجينوم الفيروسي يمكن أن تكون بسهولة التلاعب بها11،13. هذه الخصائص تجعل MDV عامل قيمة لدراسة البيولوجيا البعوض. ومع ذلك، نظراً لأن ما يقرب من كل تسلسل الجينوم الفيروسي ضروري لانتشار الفيروس، إنشاء الفيروسات المؤتلف من خلال استبدال أو الإدراج من الجينات الأجنبية تتسبب في فقد في قدرات التعبئة والتغليف و/أو النسخ المتماثل الفيروسية، مما يخلق حاجز لتطوير مدفس كمتجهات إيصال الجينات. هنا، نحن التقرير باستخدام استراتيجية تعبير الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي إينترونيك اصطناعية لوضع رايدف غير معيبة في فيفو الجيش الملكي النيبالي تسليم نظام يحتوي على مزايا بلازميد سهلة البناء والحفاظ على الفيروس الوظيفية التي يمكن أن تنتج تعبير مستقر وطويل الأجل في الخلايا المضيفة دون الحاجة إلى البرية من نوع الفيروس. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتوصيل سهل لليرقات.

يتم وصف البروتوكولات للخطوات التالية في هذه الدراسة: 1) تصميم رايدفس ترميز كاسيت إينترونيك الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي تعبير، 2) إنتاج جزيئات الفيروس المؤتلف الخلية C6/36 التغليف باستخدام خط، 3) التحليل الكمي للخلية الحرة رايدف الجينوم نسخ الأرقام، و 4) الإصابة بيرقات Ae. albopictus بالتقديم المباشر للفيروس في جسم المياه الموئل اليرقات. إجمالاً، أظهرت هذا العمل أن يمكن overexpressed الكشف صغيرة محددة أو الجينات المستهدفة أو ترسيتها في يرقات البعوض باستخدام نظام التسليم MDV المتقدمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كافة البروتوكولات أقرتها "اللجنة الأخلاقية بجامعة جنوب الطبية"-

1. تصميم "إنترون الاصطناعية"

ملاحظة: إنترون الاصطناعية المستخدمة في هذا العمل هي 65 bp في الطول، والتسلسل هو 5 '-جتاجاجتكجاتكجاكجكجتاكتاكتجتاككتكتكتتتتتتتتتجاتاتككتجكاج-3 '.

  1. مكان Hpa أنا قيد الموقع على طرفي إنترون الاصطناعية بحيث أن Hpa أنا الهضم يمكن الإفراج عن إنترون من البلازميدات (انظر الشكل 1 ألف)-
  2. مكان الاثنين Xba أنا تقييد مواقع في إنترون حتى أن Xba أنا الهضم يمكن استخدامها لإدراج تسلسل الرنا الصغيرة التعبير.
    3. تأمر
  3. التوليف الكيميائي لكامل طول تسلسل الحمض النووي من إنترون الاصطناعية من شركة تصنيع الحمض النووي. الاصطناعية الحمض النووي التي تم إنشاؤها من الاستنساخ في بلازميد قياسية pUC19.
    ملاحظة: العناصر الأساسية من إنترون الاصطناعية تشمل عدة عناصر النوكليوتيدات توافق الآراء، بما في ذلك 5 ' المانحة لصق الموقع (DS) مع تسلسل جواجاجو، تسلسل مصانة فرع نقطة (BPS) مع تسلسل أواكواك، بولي-بيريميدين المسالك (PPT) مع UCUUC(U) تسلسل 10، و 3 '-يقبلون لصق الموقع (عليه السلام) مع تسلسل جواوككوجكاج ( الشكل 1 أ). اثنين Xba أنا أدخلت تقييد مواقع بين DS وبت في الثانية التي يمكن استخدامها لإدراج تسلسل التعبير الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي. القدرة على لصق فعالية هذا إنترون الاصطناعي من خلايا الثدييات والبعوض قد أكد سابقا 14-

2. تصميم "الاصطناعية إينترونيك الصغيرة رنا التعبير كاسيت"

ملاحظة: overexpression أو ضربة قاضية لميرنا الذاتية، تم إدراج تسلسل ترميز ميرنا السلائف أو اسفنجة ميرنا بين DS وبت في الثانية. كمثال، اختير ميرنا سلائف ذاتية من عبد اللطيف-البوبيكتوس 7-العال-اسمحوا لبناء ناقلات الأمراض الفيروسية المؤتلف overexpression ميرنا وضربه قاضية. وقد صمم الأسفنج المضادة بعد 7 ليت وفقا للأساليب الموصوفة سابقا 15. نهدم الجينات المستهدفة في يرقات، قمنا بتصميم محددة ميرنا الاصطناعية (أميرنا) أو دبوس الشعر القصير تسلسل الحمض النووي الريبي (شرنا) باستخدام البرمجيات على الإنترنت 16 ، 17؛ كمثال، وحدة فرعية الخامس-ATPase مرناً (لا الانضمام. واختير AY864912) جينات مستهدفة في هذه الدراسة. أميرنا وسوف يشار إليها باسم أميفتب الآخرة. جميع تفاصيل تسلسل من قبل ميرنا والإسفنج، أميرنا، وشرنا موصوفة في تكميلية الجدول 1-

  1. تأمر التوليف الكيميائي تسلسلات كدنا طول ميرناس السلائف والإسفنج ميرنا، وشرنا مع Xba أنا مواقع التقييد على طرفي من مصنع الحامض النووي.
  2. بعد تلقي أمر الحمض النووي، تدور هذه الأنابيب التي تحتوي على كتل الحمض النووي في العاشر 10,000-14,000 ز لمدة 1 دقيقة لضمان كافة المجففة الحمض النووي في الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. ريسوسبيند الحمض النووي المجففة في المياه خالية من الدناز لتحقيق تركيز نهائي 10 نانوغرام/ميليلتر.
    4. والخلاصة
  4. العمود الفقري بلازميد الحمض النووي تسلسل مع Xba أنا في 37 درجة مئوية ح 1، وثم ديفوسفوريلاتي في 5 ' ينتهي من العمود الفقري بلازميد خطية مع العجل الفوسفاتيز القلوية المعوية (سياب) وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s .
  5. "إلغاء تنشيط سياب" بتدفئة لمدة 60 دقيقة في 65 ° C.
  6. تشغيل 1.0% [اغروس] هلام وقص العمود الفقري خطية. ثم استخراج الحمض النووي من جل شريحة باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s-
  7. ليجاتي بلغة الحمض النووي إلى ليجاسى T4 الحمض النووي باكبونيبي (يو 5/ميليلتر) عند 22 درجة مئوية حاء – 1
  8. تحويل المنتجات من رد فعل ربط من الخلايا خطوة 2.7 إلى المختصة الإشريكيّة القولونية (كولاي) وطبق على طبق أجار ليسوجيني مرق (رطل) التي تتضمن الأمبيسلّين (بتركيز 100 ميكروغرام/مل). سلالة
    1. إجراء التحويل من خلال أسلوب الصدمة الحرارة 18، والاستخدام المناسب كولاي. على سبيل المثال، استخدام سلالة كولاي DH5α الحرارة صدمة التحول.
  9. بيك مستعمرة واحدة من خطوة 2.8 واحتضان ثقافة 3 مل أثري الأمبيسلّين تحتوي على المتوسط (بتركيز 100 ميكروغرام/مل).
  10. استخراج بلازميد الحمض النووي من ثقافة البكتيرية باستخدام مجموعة مصغرة الإعدادية عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s. إرسال العينة إلى شركة تسلسل الحمض النووي-
    ملاحظة: أوفيريكسبريسيون أو ضربة قاضية لميرنا الذاتية، أدرجت في تسلسل ترميز ميرنا السلائف أو اسفنجة ميرنا بينهما Xba أنا المواقع. يجب أن تكون كافة بنيات التعبير أو الأسفنج ميرنا أقصر من 400 شركة بريتيش بتروليوم (10% طول الجينوم الفيروسي) بسبب الحد التغليف من الفيروسات 19.

3. توليد رايادف بناء طريق الاستنساخ على ميرنا أو شرنا "كاسيت التعبير" في "العمود الفقري بلازميد"

ملاحظة: بوكا، استنساخ معدية المكونة من بلازميد بوكا تحتوي على الجينوم آيدف (3,981 nt) 19، يرجى قدم البروفيسور جوناثان كارلسون وقد وصفت سابقا في التفصيل 11. p7NS1-دسريد تعرب عن بروتين غير الهيكلية 1 (NS1)-البروتين الانصهار الأحمر نيون البروتين (دسريد) من المروج p7 وقد تم وصف بالتفصيل في مواضع أخرى 14. سلائف مير-941-1 الخاصة بالإنسان 20 وفي الأسفنج، شرنا مجمعة (كجاكجاكتاتكجتجكاتتكاجاج آتجكاكجاتاجتكجتكج)، كانت أيضا سوبكلونيد إلى آيدف كعنصر سلبي.

  1. اضطر قبل-ميرنا والإسفنج وشرنا أو كاسيت تعبير أميفتب إلى Hpa أنا الموقع من منطقة الترميز NS1 آيدف في العمود الفقري بلازميد بوكا كما هو موضح في الخطوة البروتوكول 2.4 إلى 2.7.
  2. تحويل الحمض النووي Stbl3 المختصة كولاي الخلايا وتحديد استنساخ إيجابية كما هو موضح في الخطوة 2.8 إلى 2.10.
  3. بعد ذلك، استخراج بلازميد رايدف من الخلايا البكتيرية باستخدام مجموعة الإعدادية ماكسي عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s-
    ملاحظة: ينبغي استخدام الخلايا Stbl3 أو Stbl4 كولاي رايدف الحمض النووي التحول إلى أدنى حد من غير مرغوب فيها ساحة جزئ. الإعدادية ماكسي ينبغي أن تستخدم لاستخراج بلازميد رايدف للحصول على كمية كبيرة من الحمض النووي (> 100 ميكروغرام). قبل إنشاء هذا الفيروس، ينبغي دائماً تحليل سلامة تسلسل بلازميد رايدف ب تسلسل الحمض النووي 21-

4. الخلايا C6/36 ترانسفيكتينج مع رايدف البلازميدات

  1. خلايا الثقافة C6/36 في روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1% في حاضنة 28 درجة مئوية.
  2. في اليوم 0، لوحة الخلايا في عشر قوارير الثقافة 2 25 سم ح 18-20 قبل تعداء عن طريق تقسيم الخلايا المتلاقية 90-95% في تمييع 1:2-
    ملاحظة: قبل يوم 1، ينبغي أن تصل الخلايا إلى التقاء 90-95 ٪.
  3. في اليوم 1، ترانسفيكت الخلايا مع السلسلة من رايدف والبلازميدات 22- تمييع 10 ميكروغرام الحمض النووي في 600 ميليلتر في المتوسط RPMI 1640 في أنبوب ميكروسينتريفوجي
    1. وتخلط بلطف. ومن ناحية أخرى، تعد 600 ميليلتر في المتوسط RPMI 1640 و 25 ميليلتر من تعداء كاشف كل تعداء.
    2. إينكوباتي لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم أضف ميليلتر 625 من خليط كاشف 1640-تعداء إلى خليط الحمض النووي بلازميد 1640.
    3. احتضان هذا الخليط لمدة 20-30 دقيقة في الرايت قبل تعداء، تغسل الخلايا مرتين مع 2 مل متوسط RPMI 1640.
    4. الحضانة بعد RT (الخطوة 4.3.3)، إضافة the1640-تعداء كاشف الحمض النووي بلازميد المخلوط إلى قارورة الثقافة 2 25 سم واحتضانها ح 6 في 28 درجة مئوية.
    5. في حوالي الساعة تعداء ح 6 بعد، إزالة وسائط الإعلام تعداء، تغسل الخلايا مرتين مع 5 مل متوسط RPMI 1640، ثم قم بإضافة المتوسط RPMI 1640 مع 10% FBS.
      ملاحظة: يظهر رايدف ارتفاع معدلات الإصابة (95 في المائة) في يرقات Ae. البوبيكتوس؛ بيد أن تجربتنا، في ما يقرب من 50% يرقات المصابة، العدوى كان يقتصر على مواقع الإصابة الأولية (مثلاً، الحليمات الشرج وخلايا الشعر الخشن) دون نشر 23. ولذلك إذا كان هناك حاجة لتصيب اليرقات في أنسجة متعددة، ينبغي أن يكون فيروساً المؤتلف معيبة معربا عن بروتين فلوري المصابة المشترك لتمكين تصور مواقع الإصابة. على سبيل المثال، لإنتاج الفيروس المؤتلف المعيبة معربا عن دسريد، p7NS1-دسريد ينبغي أن يكون المشترك transfected مع بلازميد مساعد داخل الخلايا C6/36 وفقا للإجراء المبين أعلاه (يجب أن تكون نسبة التركز، كوترانسفيكتيون 2:1)-

5. حصاد فيريونس رايدف من Transfected الخلايا C6/36

  1. حصاد الخلايا بعد تعداء 5 أيام. طرد وتعليق الخلايا في الأطباق بالقطارة، زجاج 5 مل، بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع المتوسط الثقافة. نقل كل خلية معلقات لأنابيب 15 مل معقمة.
  2. تجمد في-80 درجة مئوية، أو في حمام الثلج الجاف/إيثانول لمدة 30 دقيقة وثم ذوبان الجليد في 37 ° دوامة جيم 1 كحد أدنى لتكرار إجراءات التجميد والذوبان 3 مرات.
  3. الطرد المركزي العينة في 4,800 س ز لمدة 20 دقيقة في °C.Collect 4 المادة طافية وتجاهل بيليه. ثم تمرير المادة طافية من خلال مرشح حقنه المتاح 0.22 ميكرومتر. قاسمة ومخزن virion المنقي النهائي للأرصدة في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة.

6. تحديد كمية رايدف

المعايير
  1. تحضير الحمض النووي. لينيريزي جميع رايدف البلازميدات مع Hpa الأول، وتنقية المنتجات هضمها مع مجموعة أدوات استخراج هلام 24-
  2. بناء المنحنى المعياري الكمية المطلقة وقياس عيار الفيروس وفقا للأساليب الموصوفة سابقا 25-

7. توصيل البعوض

  1. يغسل 100 1 st الطور يرقات Ae. البوبيكتوس ثلاث مرات استخدام منزوع الماء، وثم قم بنقل اليرقات في كوب يحتوي على 95 مل منزوع الماء. إضافة 5 مل مخزون رايدف (تركيز النهائي من 1.00 × 10 10 نسخ/مل)-
  2. احتضان 24 ساعة في 28 درجة مئوية، يغسل اليرقات ثلاث مرات باستخدام المياه، ونقل اليرقات ثم العودة إلى اللوحات وتغذية بانتظام.
  3. رصد مستوى التعبير الجيني المستهدف في اليرقات مع قبكر أو لطخة غربية (الممثل النتائج يبين الشكلان 3 و 4)-
    ملاحظة: يمكن استخدام طريقة الكشف عن إشارة الأسفار لعزل اليرقات المصابة أكثر دقة. على سبيل المثال، للكشف عن إشارات الفلورسنت من اليرقات مصاب بالفيروس المؤتلف معربا عن دسريد، اليرقات يمكن وضعها على شريحة تقعر ولاحظ تحت مجهر مقلوب الأسفار كل ح 8 حتى 2 يوما بعد الإصابة. حالما يتم الكشف عن يرقات الفلورسنت، ينبغي أن تفصل في أكواب فردية اختبار البلاستيك للسماح للمراقبة المستمرة اللاحقة. يمكن تعريف اليرقات مع متعددة الأنسجة المصابة باستخدام هذا الأسلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استراتيجيات لبناء رايدف
تم إنشاء ناقل رايدف معيبة للتعبير عن الجين دسريد في يرقات البعوض. بلازميد الناتجة الواردة كاسيت بروتين NS1-دسريد انصهار مع البروتين نائب الرئيس حذف (الشكل 1أ). رايدف البلازميدات المحتوية على التعبير بنيات لميرنا, ميرنا الأسفنج وشرنا وأميرنا صممت (هو مبين في الشكل 1ب). على سبيل المثال، تم إنشاء ناقل رايدف أوفيريكسبريس 7-العال-اسمحوا في يرقات البعوض. بلازميد الناتجة الواردة كاسيت قبل-العال-السماح-7 إينترونيك في إكسون NS1 الفيروسية (الشكل 1ب). تم إنشاء ناقل رايدف التي تحتوي على كاسيت تعبير إينترونيك العال-السماح-7 الأسفنج في إكسون NS1 الفيروسية نهدم التعبير العال-السماح-7 في يرقات البعوض (الشكل 1ب و الشكل 2ب). ، استخدمت ناقل شرنا رايدف وناقل أميرنا رايدف التي تحتوي على شرنا إينترونيك وأميرنا قبل التعبير أشرطة الكاسيت، نهدم مرناً الخامس-ATPase في يرقات البعوض (الشكل 2-ج).

حساب التتر رايدف استناداً إلى منحنى قياسية التي ولدت مع تحليل الانحدار الخطي
المحور الصادي يمثل قيمة Log10 القياسية التركيز الجزيئي الحمض النووي، والمحور السيني يشير إلى قيمة الأشعة المقطعية. أرقام CT (المحور السيني) و Log10 (تركيز) قيم المحور (ص) عرض علاقة جيدة (ص2 = 0.9988) والوفاء بالمعادلة y =-0.288 x + 13.87 (الشكل 3). حساب التتر رايدف من العينات باستخدام معادلة خطية (الجدول 1). استخدام الأسلوب الموصوفة في البروتوكول (الخطوة 6، 2 و الجدول 1)، التتر عالية من رايدف (4 مل، > 7.65 × 1010 جسيمات مليلتر) تم حصادها. فيروسات المؤتلف (فريبوكا-7 فريبوكا-7s، فريبوكا-أميفتب، فريبوكا-شفتب، VrepUCA941-1، فريبوكا-941-1s وشكت فريبوكا) تم إنشاؤها بواسطة ترانسفيكتينج الإصابة المقابلة استنساخ بوكا-7، 7s بوكا، بوكا-أميفتب، pUCA941-1، pUCA941-1s، بوكا-شكت في الخلايا C6/36 (الأبواب 3 و 4 و 5).

تحديد كفاءة ميرنا أوفيريكسبريشن وضربه قاضية لناقلات رايدف
في المثال، 100 1st الطور اليرقات يعاملون بكميات متساوية (1.00 × 1010 جسيمات مليلتر) من رايدف التي تحتوي على تعبير ما قبل ليت-7 إينترونيك ناقلات، ناقلات التعبير إينترونيك 7 تمكنك من الأسفنج، الإنسان-المحددة ناقل التعبير قبل مير-941-1 أو ناقلات التعبير الأسفنج مير-941-1 عن طريق إضافة الفيروس إلى الجسم المياه الموئل اليرقات. خمسة أيام بعد الإصابة، التعبير عن العال-السماح-7 كان يحددها qPCR (الشكل 4، n = 3؛ تكميلية الجدول 2). مستويات السماح-7 التي يتم عرضها كما يتطابق ± يعني SD البيولوجية الثلاثة في اليرقات، كانت إلى حد كبير تزيد أو تنقص من رايدف قبل-ليت-7-الإعراب عن (overexpressed 2,843.31 ± 80.72 ٪، ف < 0.0001، اختبار t) اسمحوا-7-الأسفنج-الإعراب عن رايدف (دوونريجولاتيد 74.78 ± 1.60%، ف < 0.0001، اختبار t)، على التوالي.

رصد كفاءة مرناً الخامس-ATPase ضربة قاضية لناقلات رايدف
ما مجموعة 100 1st الطور اليرقات يعاملون بكميات متساوية (1.00 × 1010 جسيمات مليلتر) إينترونيك رايدف أميرنا-الإعراب عن، رايدف التعبير عن شرنا إينترونيك، رايدف الخاصة بالإنسان قبل-مير-941-1-وإذ يعرب عن أورسكرامبلي إذ تعرب عن شرنا رايدف عن طريق إضافة الفيروس إلى الجسم المياه الموئل اليرقات. خمسة أيام بعد الإصابة، التعبير عن الخامس-ATPase مرناً تحدده qPCR (الشكل 5، n = 3؛ تكميلية الجدول 2). المستوى الخامس-ATPase عرض كما يتطابق ± يعني SD البيولوجية الثلاثة في اليرقات كان تخفيضاً بالتعبير عن أميرنا رايدف (دوونريجولاتيد ±6.37 43.01%، ف = 0.0011، اختبار t) وإينترونيك الإعراب عن شرنا رايدف (دوونريجولاتيد من 72.88 ± 5.74%، p = 0.0001، اختبار t).

Figure 1
الشكل 1 : المنظمة التخطيطي من البلازميدات آيدف المؤتلف. (أ) السندات الإذنية وحماية الأصناف النباتية الفيروسية المروجين محرك التعبير عن الجينات NS1/NS2 والجينات نائب الرئيس، على التوالي. في بلازميد p7NS1-دسريد، وكان تنصهر الجين دسريد للجين NS1. بوكا-7 (ب) وشكت بوكا بوكا-941-1، بوكا-941-1s،، شفتب بوكا و 7s بوكا بوكا أميفتب تحتوي على إينترونس الاصطناعية، بما في ذلك الأسفنج العال-السماح-7، 7-العال-اسمحوا، الأسفنج قد-مير-941-1، قد-مير-941-1، سارعت شرنا، شرنا الخامس-ATPase والاصطناعية ميرنا، على التوالي، قد تم استنساخ في Hpaأنا موقع الجين NS1. إنترون الاصطناعية ويرد flanked بلصق جهة مانحة (DS) وموقع يقبلون على (عليه السلام) ويحتوي على مجال فرع-نقطة (BrP)، والمسالك بولي-بيريميدين (PPT) وميرنا قبل. يتم إدراج الأسفنج ميرنا أو تسلسل ميرنا اصطناعية داخل إنترون بين الموقع 5-الوصلة وبرنامج إعادة هندسة العمليات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : نشوء حيوي ميكرورنا إينترونيك الاصطناعية (ميرنا) واستراتيجية لتوليد ميرنا الأسفنج والاصطناعية ميرناس. ميرنا إينترونيك (A) يدون المشترك داخل سليفة الحمض النووي الريبي الرسول (ما قبل-مرناً) من NS1، الذي سوف يكون مدفوعا بالمروج pNS1 والمشقوق من قبل-مرناً بالحمض النووي الريبي الربط. على الرغم من أن هي متصلة exons لتشكيل رنا رسول ناضجة (مرناً) تخليق البروتين NS1، معالجة إنترون المقسمة مع ما قبل-ميرنا كذلك إلى ميرنا ناضجة من ديسير. (ب) استراتيجية لإنشاء بنيات مكافحة ليت-7 ومكافحة مير-941-1. تسلسل المحاذاة لمكافحة ليت-7 ومكافحة مير-941-1 مع العال-السماح-7 وقد-مير-941-1، على التوالي. ويرد مطابقة كاملة المناطق البذور مع مناطق تسلسل وذيل ميرنا المضادة. الأسفنج اسمحوا-7 ومير-941-1 تحتوي على ثلاثة تكرار العقاقير بنيات (أحرف حمراء) التي يمكن ربط العال-السماح-7 وقد-مير-941-1، على التوالي. (ج) تسلسل وهياكل السلائف المتوقعة على أساس ميرنا ميرناس الاصطناعية وشرنا المستخدمة في هذه الدراسة. ميرناس الاصطناعية ناضجة وشرنا تظهر باللون الأحمر، وتسلسل مرناً المستهدفة ذات الصلة بهم باللون الأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : المنحنى المعياري لمعايرة رايدف وتشريعيا محسوبوأجرى نتراتيونس قبكر-مدفس (A) في الوقت الحقيقي مع بوكا قياسية التي قد تضعف من 10 مرات نسبة التكبير، وتم قياس قيمة جر على 7500 أبي العاشر. تم حساب عدد النسخ حسب الخطوة 6.2 و 6.3 بالصيغة التالية: نسخ الرقم (y) =-0.288x + 10.87؛ ص2 = 0.9988. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : Overexpression المؤتلف بوساطة MDV العال-السماح-7 وضربه قاضية في يرقات Ae. البوبيكتوس . (أ) تحليل التعبير ميرنا الذاتية في اليرقات بعد العدوى بالفيروس التوليفية التي تحتوي على الكاسيت التعبير العال-السماح-7 (اللوحة اليمنى). (ب) كفاءة مكافحة لت-7 بناء مصممة في اليرقات (اللوحة اليمنى). الأسفنج قد-مير-941-1 وقد-941-1 (مراقبة سلبية) أوفيريكسبريسيد ودوونريجولاتيد ميرناس واسمحوا-7 ناضجة، على التوالي، مقارنة بالمستويات القاعدية في السيطرة على المجموعة. وكان تطبيع وفرة ميرنا إلى الرنا الريباسي 5S، ويتم عرض البيانات كما يتطابق ± يعني SD البيولوجية الثلاثة. T-اختبارات أجريت في different مستويات من الأهمية. تشير العلامات النجمية إلى فروق معتد بها إحصائيا بين اليرقات المصابة والمقابلة معاملة وهمية (أربعة التنصيص، ف < 0.0001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : تحليل التعبير مرناً الخامس-ATPase بعد الإصابة بالفيروس التوليفية التي تحتوي على أشرطة الكاسيت شرنا وأميرنا- وكان تطبيع وفرة مرناً ل aalrpS7. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري للقيم−ΔΔCT 2 للتعبير مرناً الخامس-ATPase في يرقات Ae. البوبيكتوس أن تقييمه بواسطة RT-PCR الوقت الحقيقي (* *، ف < 0.01؛ * * *، ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Table 1
الجدول 1: المؤتلف MDV ج T يتوافق مع القيمة التي يحددها قبكر x قيمة في الصيغة، التي يتم استخدامها لحساب y القيمة- تم الحصول على عدد نسخ الجينوم الفيروسي في كل عينة ميليلتر 1 وظيفة السلطة (10، ص)، الذي كان مضروباً في نهاية المطاف في 40، تحويل القيمة إلى تركيز فيروس من الفيروسات تعليق.

Supplemental Table 1
تكميلية الجدول 1: تسلسلات من السلائف ميرنا.

Supplemental Table 2
تكميلية الجدول 2: بيانات قبكر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من المهم أن التغلب على اثنين من الحواجز الرئيسية التي تحد من البناء رايدف. الأول هو إنتاج فيروس المؤتلف معيبة. فقد أفيد أن MDV يمكن أن تستخدم كوسيلة للتعبير عن شكل مناسب الحجم الجينات الأجنبية، مثل العقرب neurotoxins20 الخاصة بالحشرات والبروتين التجارة والنقل؛ بيد بغض النظر عن استراتيجية التشييد، بمجرد إدراج Orf MDV أو استبدالها بجينات خارجية، فيريونس لا يمكن أن تشكل بشكل مستقل إلا إذا هو كوترانسفيكتيد بلازميد مساعد لتوريد البروتينات الفيروسية لا غنى عنها مفقودة. الفيروس المعيبة غير قادر على الانخراط في انتقال الثانوية، التي تحدث في فيفو في البعوض مع مورثات معيبة. النتائج التحقق من صحة استراتيجية تعبير إينترونيك أن يقدم نموذجا جديداً يمكن التغلب على القيود المفروضة على مدفس مع مورثات معيبة لتمكين كفاءة إيصال جينات أجنبية إلى البعوض.

والثاني هو حد طول تطلبا من الجينوم الفيروسي المؤتلف يفرضها حجم قفيصه الفيروسية. لا يمكن أن يتجاوز حجم الجينوم لكفاءة التعبئة والتغليف، 4,400 النيوكليوتيدات (110% طول الجينوم مدفس wt). كاسيت تعبير ميرنا إينترونيك (بما في ذلك ميرنا التعبير كاسيت وانترون الاصطناعية) لا يزيد عن 400 يمكن إدخال nt إلى الجينوم آيدف. على الرغم من طول جينوم الفيروس المؤتلف لا تزال مناسبة للتعبئة والتغليف، وهذا النظام التسليم له مجالاً للتحسين. بسبب قيود في طول الجينوم، من الصعب التعبير عن الجينات دون استراتيجيات التعبير إينترونيك المعيبة.

من الضروري ضمان صحي لتمكين تعداء ناجحة والتعبئة والتغليف من رايدف الخلايا C6/36. ومع ذلك، الحويصلية الموجبة والكواشف المستخدمة هنا والحشرات التجارية الخلية الكواشف تعداء محددة، لم تحسن كفاءة تعداء الخلية C6/36 (40-60%). ولذلك، لحصاد عالية-عيار الفيروس المؤتلف، أنها ضرورية للحفاظ على الخلايا لمدة 5 أيام بعد تعداء استناداً إلى خصائص النمو هو موضح سابقا14. بالإضافة إلى ذلك، للإصابة اليرقات بنجاح، من الضروري لليرقات تكون على اتصال مع جزيئات الفيروسات المعدية 24–ح 36 لضمان نسب الإصابة بارتفاع23.

وفي الختام، استراتيجية التعبير إينترونيك الموصوفة هنا هي الأولى للتغلب على الحواجز التي تفرضها توليد MDV معيبة. تمكن هذه الاستراتيجية الإنتاج غير تالف المؤتلف مدفس التي يمكن أن أوفيريكسبريس أو دوونريجولاتي ميرناس والهدف الجينات في البعوض. هذا الأسلوب يوفر أداة للتحليل الوظيفي من جينات البعوض دون استخدام إجراءات microinjection اليرقات معقدة ولها تطبيقات تجارية واضحة. إجراء المزيد من الدراسات ستوسع تطبيق استراتيجية التعبير وصف للتحقيق في البيولوجيا البعوض وباراترانسجينيسيس للسيطرة على فيروس حمى الضنك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

الكتاب تقر دعما ماليا من البحوث الرئيسية الوطنية وبرنامج التنمية في الصين (2016YFC1200500 "تشن" شياو قوانغ)، الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81672054 و 81371846)، وبرنامج فريق البحوث الطبيعية المؤسسة للعلوم في قوانغدونغ (2014A030312016)، والبرامج العلمية والتكنولوجية في قوانغتشو (201508020263). ونعترف مع الامتنان البروفيسور جوناثان كارلسون (جامعة ولاية كولورادو) يرجى تقديم والبلازميدات بوكا و p7NS1-التجارة والنقل ونقديا قراءة هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge machine Thermo Scientific 75004260
Centrifuge System Beckman Coulter 363118
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit Omega Biotech D6904
Purified Agar OXOID LP0028A
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) Thermo Scientific EF0651
FastDigest HpaI Thermo Scientific FD1034
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µL) Thermo Scientific EL0011
TransStbl3 Chemically Competent Cell Beijing Transgen Biotech CD521-01
Ampicillin  Beijing Tiangen Biotech RT501
Proteinase K Promega MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) Beijing Tiangen Biotech FP205

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
  2. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
  3. Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
  4. Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
  5. Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
  6. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
  7. Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
  8. Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
  9. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
  10. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, (Online) 69 (2013).
  11. Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
  12. Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
  13. Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
  14. Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
  15. Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).
  16. BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/ (2017).
  17. GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).
  18. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
  19. Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
  20. Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
  21. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  22. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
  23. Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
  24. Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
  25. Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).

Tags

علم الأحياء التنموي، دينسوفيروس البعوض ناقل إيصال الجينات، رنا الصغيرة، Aedes albopictus، مكافحة ناقلات الأمراض،، المسألة 128 إنترون الاصطناعية.
استخدام دينسوفيروس المؤتلف البعوض ناقل توصيل جينات للتحليل الوظيفي للجينات في يرقات البعوض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P. W., Xu, J. B., Dong, Y. Q.,… More

Liu, P. W., Xu, J. B., Dong, Y. Q., Chen, X. G., Gu, J. B. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (128), e56121, doi:10.3791/56121 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter