Summary
Vi rapport ved hjælp af en kunstig intronic små RNA udtryk strategi til at udvikle en ikke-defekte rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo levering system. En detaljeret procedure for byggeri, emballage og kvantitativ analyse af rAaeDV vektorer så godt som for larver infektion er beskrevet.
Abstract
In vivo mikroinjektion er den mest almindeligt anvendte gen overførsel teknik til at analysere genet funktioner i enkelte myg. Men denne metode kræver en mere teknisk krævende operation og involverer komplicerede procedurer, især når det anvendes i larver på grund af deres lille størrelse, en relativt tynde og skrøbelige neglebånd og høj dødelighed, hvilket begrænser dets anvendelse. Derimod er virale vektorer for gen levering blevet udviklet for at overvinde ekstracellulære og intracellulære barrierer. Disse systemer har fordelene ved let manipulation, høj gen transduktion effektivitet, langsigtede vedligeholdelse af genekspression og evnen til at producere vedvarende virkninger i vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) er myg-specifikke, små enkeltstrenget DNA virus, der effektivt kan levere udenlandske nukleinsyrer myg celler; men udskiftning eller indsættelse af fremmede gener oprette rekombinant virus typisk forårsager tab af emballagen og/eller replikering evner, hvilket er en hindring for udviklingen af disse vira som levering vektorer.
Vi rapporterer heri, ved hjælp af en kunstig intronic lille-RNA udtryk strategi til at udvikle en ikke-defekte rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo levering system. Detaljerede procedurer for byggeri, emballage og kvantitativ analyse af rAaeDV vektorer og for larver infektion er beskrevet.
Denne undersøgelse viser for første gang muligheden for at udvikle en ikke-defekte rekombinant MDV RNA (miRNA) udtryk mikrosystem, og dermed at yde et kraftfuldt værktøj til funktionel analyse af gener i myg og skabe et grundlag for den anvendelse af viral paratransgenesis for kontrollerende myg-bårne sygdomme. Vi viste at Aedes albopictus 1st instar larver kan er være inficeret nemt og effektivt ved at indføre virussen i vand kroppen af larverne avl site og at de udviklede rAaeDVs kunne bruges til overexpress eller vælte den udtryk for et bestemt mål gen i larver, giver et værktøj til funktionel analyse af myg gener.
Introduction
Myg-bårne sygdomme som malaria, dengue feber, zika feber og gul feber, er store internationale folkesundhedsmæssige problemer, som fortsat tegner sig for en betydelig del af global infektionssygdom byrde1,2. Konventionelle insekticider, som har været anvendt som svar på vektorer, er en større komponent af bæredygtig integreret myg kontrolstrategi for forebyggelse af myg-bårne sygdomme. Sådanne strategier har imidlertid vist sig for at være relativt ineffektive eller uønskede på grund af de tilknyttede negative miljøpåvirkninger samt udviklingen af resistens hos mosquito befolkninger3,4. Af disse grunde, der er et presserende behov for alternative metoder til myg kontrol og anvendelse af transgene metoder til at producere sterile mandlige myg og udgivelsen af patogen-resistente myg er opstået som lovende nye kontrolstrategier. For at udvikle effektive nye styre metoder, som sikre og effektive tilgange til i vivo gen levering, den omfattende analyse af myg genfunktion er påkrævet.
Direkte mikroinjektion af plasmid DNA, dobbelt strandede RNA (dsRNA) eller små interfererende RNA (siRNA) er den mest almindeligt anvendte i vivo gen leveringsmetode i myg. I virkeligheden, produktion af transgene stammer af myg stadig stole på en proces af embryo mikroinjektion5,6,7. Mikroinjektion har imidlertid flere begrænsninger. Første, denne teknik er teknisk krævende og involverer komplicerede procedurer. For det andet forårsager injektion en fysiske krænkelse af embryonet, larver, pupper og voksen, som direkte påvirker levedygtigheden af målorganismen. For det tredje er det vanskeligt at immobilisere myg larver for mikroinjektion, fordi de fleste bor i en akvatisk habitat og besidder et karakteristisk vrikkende bevægelse. Fjerde, 1st-2nd instar larver fylder 10 til 20 gange mindre end 4th instar og ældre larver og neglebånd af førstnævnte er mere sart. Disse funktioner gør det vanskeligt at manipulere 1st-2nd instar larver i forhold til dem i ældre faser. Kombineret, bidrager disse faktorer til en reduceret efter injektion overlevelsesraten for larver (ca. 5%) i forhold til voksne8. Viral-baserede levering systemer er blevet udviklet for at overvinde de tilknyttede ekstracellulære og intracellulære barrierer. Disse systemer har fordelene ved let manipulation, høj transduktion effektivitet, langsigtede og robust niveauer af udtryk og evnen til at producere vedvarende virkninger i vivo. Derfor anvendt gen levering systemer udnytter retrovira, lentiviruses og adenovirus har været bredt inmammalian cellelinjer og model arter. Sindbis viral ekspressionssystem havde tidligere været brugt til at analysere funktionen gen i den voksne myg; Udover bekymringer, biosikkerhed, men er injektion stadig en nødvendig proces for virusinfektion9. Selv om den mundtlige levering af iblødsætning larver i dsRNA løsning er blevet rapporteret tidligere som en mulig leveringsmetode, er det uegnede for lille RNA funktion analyse10. Så skal effektiv viral leveringsmetoder stadig udvikles for myg.
Mosquito densoviruses (MDVs) er en del af Densovirinae er den af Parvoviridae, og alle, men en nedgang inden for slægten Brevidensovirus11. MDV virioner er ikke-kappebærende og består af en enkeltstrenget DNA (ssDNA) genom og en ikosaedriske kapsid (20 nm i diameter). Det virale genom er ca 4 kb i størrelse og replikeres i kerner i værtsceller. MDVs er forholdsvis stabilt i miljøet og vise en smal værtsspektrum med høj specificitet for myg. Disse vira har potentiale til at sprede og fortsætter naturligvis i mosquito befolkninger og kan invadere næsten alle organer og væv af disse insekter, herunder midgut, Malpighian tubuli, fedt kroppen, muskulatur, neuroner, og spytkirtler12.
Intakt MDV genomer kan blive subcloned ind i plasmid vektorer til at producere plasmid-baserede smitsomme kloner; Når disse kloner er leveret til myg celler, det virale genom er udvundet fra plasmid vektor og smitsomme viruspartikler er produceret. Fordi MDV har en lille ssDNA genom, smitsomme kloner er let bygget og det virale genom kan være lette at manipulere11,13. Disse egenskaber gør MDV et værdifuldt middel til at undersøge myg biologi. Men, fordi næsten alle af viral genomet sekvens er afgørende for viral spredning, oprettelsen af rekombinant virus ved erstatning eller indsættelse af fremmede gener medfører et tab i viral emballage og/eller replikering evner, som skaber en barriere for udvikling af MDVs som gen levering vektorer. Heri, rapport vi ved hjælp af en kunstig intronic lille-RNA udtryk strategi til at udvikle en ikke-defekte rAaeDV i vivo RNA leveringssystem, der har fordelene ved nem plasmid konstruktion og vedligeholdelse af en funktionel virus, der kan producere stabil og langvarig udtryk i værtsceller uden behov for wild-type virus. Desuden, denne metode giver mulighed for nem transduktion af larver.
Protokollerne for de følgende trin er beskrevet i denne undersøgelse: 1) design af rAaeDVs kodning en intronic lille-RNA udtryk kassette, 2) produktionen af rekombinant viruspartikler ved hjælp af cellen C6/36 emballage linje, 3) kvantitativ analyse af celle-fri rAaeDV genom kopiere numre, og 4) infektion af Ae. albopictus larver af direkte indføring af virus i vand kroppen larve habitat. Alt i alt viste dette arbejde at specifikke små RNA'er eller target gener kan overexpressed eller slået ned i myg larver ved hjælp af den udviklede MDV leveringssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle protokoller blev godkendt af det etiske udvalg af sydlige medicinske universitet.
1. designe en kunstig Intron
NOTE: den kunstige intron bruges i dette arbejde er 65 bp i længden, og rækkefølgen er 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.
- Placere Hpa jeg begrænsning site på begge ender af kunstige intron så at Hpa jeg fordøjelsen kan frigive intron fra plasmider (Se figur 1 A).
- Sted to Xba jeg begrænsning websteder i intronnet så at Xba jeg fordøjelsen kan bruges til at indsætte små-RNA udtryk sekvenser.
- Bestil den kemiske syntese af fuld længde DNA sekvenser af den kunstige intron fra DNA producent. Syntetiske DNA lavet er fra kloning ind i en standard pUC19 plasmid.
Bemærk: De væsentlige komponenter i den kunstige intron omfatter flere konsensus nukleotid elementer, herunder en 5 ' donor splejsning websted (DS) med sekvens GUAAGAGU, en bevaret forgreningspunktet sekvens (BPS) med sekvens UACUAAC, en poly-pyrimidin tarmkanalen (PPT) med sekvens UCUUC(U) 10, og en 3 '-acceptor splejsning websted (AS) med sekvens GAUAUCCUGCAG ( fig. 1 A). To Xba jeg begrænsning websteder blev indført mellem DS og BPS, der kan bruges til at indsætte små-RNA udtryk sekvenser. Evnen til at effektivt splejse denne kunstige intron fra pattedyr og myg celler har været tidligere bekræftet 14.
2. Designe en kunstig Intronic små RNA udtryk kassette
Bemærk: For overekspression eller knockdown af endogene miRNA, sekvenser kodning forløber miRNA eller en miRNA svamp var indsat mellem DS og BPS. For at tjene som et eksempel, blev en endogen forløber miRNA fra Ae. albopictus aal-Lad-7 valgt til at konstruere rekombinant virale vektorer for miRNA overekspression og knockdown. En let-7 svamp var designet efter tidligere beskrevne metoder 15. For at vælte target gener i larver, vi har udviklet særlige kunstige miRNA (amiRNA) eller korte hårnål RNA (shRNA) sekvenser ved hjælp af online software 16 , 17; at tjene som et eksempel, V-ATPase subunit et mRNA (tiltrædelse nr. AY864912) blev valgt som et mål gen i denne undersøgelse. AmiRNA vil blive benævnt amiVTP herefter. Alle sekvenser detaljer om pre-miRNA, svamp, amiRNA og shRNA er beskrevet i supplerende tabel 1.
- Bestil den kemiske syntese af fuld længde cDNA sekvenser af forløber miRNAs, miRNA svampe og shRNA med Xba jeg begrænsning websteder i begge ender fra en DNA producent.
- Efter at have modtaget den bestilte DNA, spin de rør, der indeholder DNA blokke på 10.000-14.000 x g i 1 min til at sikre, at alle tørrede DNA er i bunden af røret.
- Resuspend tørrede DNA i DNase-frit vand for at opnå en endelig koncentration på 10 ng/µL.
- Fordøje plasmid rygraden og DNA sekvenser med Xba jeg ved 37 ° C i 1 time, og derefter dephosphorylate 5 ' ender af lineariseret plasmid rygraden med kalv intestinal alkalisk fosfatase (CIAP) Ifølge producenten ' s protokol .
- Inaktivere CIAP ved opvarmning til 60 min. ved 65 ° C.
- Køre en 1,0% agarosegel og skære lineariseret rygraden. Derefter udtrække DNA fra gel skive ved hjælp af en gel udvinding kit efter fabrikanten ' s instruktioner.
- Ligate DNA-fragment i backboneby T4 DNA ligase (5 U/µL) ved 22 ° C i 1 h.
- Omdanne produkter ligatur reaktion fra trin 2.7 i kompetente Escherichia coli (E. coli) celler og plade på en Lysogeny bouillon (LB) agar plade med Ampicillin (ved en koncentration på 100 µg/mL).
- Udføre transformation gennem en heat shock metode 18, og brug den passende E. coli stamme. For eksempel bruge E. coli stamme DH5α for heat shock transformation.
- Pick en enkelt koloni fra trin 2.8 og inkuberes i en kultur af 3 mL beriget medium indeholdende Ampicillin (ved en koncentration på 100 µg/mL).
- Uddrag plasmid DNA fra bakteriekulturen ved hjælp af en mini prep kit efter fabrikanten ' s instruktioner. Send prøven til et DNA-sekventering selskab.
Bemærk: For overekspression eller knockdown af endogene miRNA, sekvenser kodning forløber miRNA eller en miRNA svamp var indsat mellem to Xba websteder. Alle miRNA udtryk eller svamp konstruktioner skal være kortere end 400 bp (10% af det virale genom længde) på grund af emballage grænse af virus 19.
3. Generere en rAeaDV konstruktion af kloning en miRNA eller shRNA udtryk kassette i en Plasmid rygrad
Bemærk: pUCA, en infektiøs klon bestående af en pUCA plasmid som indeholder AaeDV genom (3,981 nt) 19, blev venligst leveret af Prof. Jonathan Carlson og er tidligere beskrevet i detaljer 11. p7NS1-DsRed udtrykker en non-strukturelle protein 1 (NS1)-rødt fluorescerende proteiner (DsRed) fusion protein fra p7 initiativtageren og er blevet beskrevet udførligt andetsteds 14. En menneske-specifikke miR-941-1 precursor 20 og dens svamp, en scrambled shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), blev også subcloned i AaeDV som en negativ kontrol.
- Ligate pre-miRNA, svamp, shRNA eller et amiVTP udtryk kassette i Hpa jeg site i regionen AaeDV NS1-kodning i pUCA plasmid rygraden som beskrevet taktfast protokol 2,4 til 2,7.
- Omdanne DNA i Stbl3 kompetente E. coli-celler og vælge en positiv klon som beskrevet i trin 2.8 til 2.10.
- Efter dette, uddrag rAaeDV plasmid fra bakterieceller ved hjælp af en maxi prep kit efter fabrikanten ' s instruktioner.
Bemærk: Stbl3 eller Stbl4 E. coli celler bør udnyttes til rAaeDV DNA transformation at minimere uønskede ITR rekombination. En maxi prep bør anvendes til at udtrække rAaeDV plasmid for at få en stor mængde af DNA (> 100 µg). Før du genererer virussen, sekvens integriteten af rAaeDV plasmid skal altid analyseres af DNA-sekventering 21.
4. Transfecting C6/36 celler med rAaeDV plasmider
- kultur C6/36 celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin i en 28 ° C inkubator.
- På dag 0, plade celler i ti 25 cm 2 kultur kolber 18-20 h før Transfektion ved at opdele 90-95% sammenflydende celler i en 1:2 fortynding.
Bemærk: Ved dag 1, cellerne skal nå 90-95% sammenløbet. - På dag 1, transfect celler med serien af rAaeDV plasmider 22.
- Fortyndes 10 µg DNA i 600 µL af RPMI-1640 medium i et microcentrifuge rør og blandes forsigtigt. I mellemtiden forbereder 600 µL af RPMI-1640 medium og 25 µL Transfektion reagens pr. Transfektion.
- Incubate for 5-10 min. ved stuetemperatur (RT). Derefter tilføje 625 µL af 1640-Transfektion reagens blandingen til 1640-plasmid DNA blandingen.
- Ruger denne blanding for 20-30 min. ved RT. Før Transfektion, cellerne vaskes to gange med 2 mL af RPMI-1640 medium.
- Efter RT inkubation (trin 4.3.3), 25 cm 2 kultur kolben tilsættes the1640-Transfektion reagens DNA plasmid blanding og Inkuber i 6 timer ved 28 ° C.
- På ca 6 h efter Transfektion, fjerne medierne Transfektion cellerne vaskes to gange med 5 mL af RPMI-1640 medium, og Tilføj derefter RPMI-1640 medium med 10% FBS.
Bemærk: rAaeDV viser høje priser for infektion (95%) i Ae. albopictus larver; imidlertid vores erfaring, i næsten 50% af inficerede larver infektion var begrænset til primær infektion websteder (f.eks. anal papiller og stritter celler) uden formidling 23. Hvis der er behov for at inficere larver i flere væv, bør en defekt rekombinant virus at udtrykke fluorescerende proteiner derfor co inficerede aktivere visualisering af infektion websteder. For eksempel, til at producere defekte rekombinant virus at udtrykke DsRed, p7NS1-DsRed bør være co transfected med en helper plasmid C6/36 celler efter proceduren beskrevet ovenfor (cotransfection koncentrationsgrad bør være 2:1).
5. Høst af rAaeDV virioner fra transfekteret C6/36 celler
- høst cellerne 5 dage efter Transfektion. Løsne og suspendere celler i retter med et 5 mL glas dropper, pipettering op og ned med substratet. Overføre alle celle suspensioner til sterile 15 mL rør.
- Fryse ved-80 ° C eller et tøris/ethanol bad i 30 min og derefter tø på 37 ° C. Vortex i 1 min. Gentag proceduren frysning og optøning 3 gange.
- Centrifugeres prøve på 4.800 x g i 20 min. på 4 °C.Collect supernatanten og kassér pelleten. Derefter passere supernatanten gennem et 0,22 µm engangs sprøjte filter. Alikvot og opmagasinere den endelige renset virion bestande på-80 ° C.
Bemærk: Undgå gentagne fryse-tø cykler.
6. Kvantificere rAaeDV
- Forbered DNA standarder. Linearize alle rAaeDV plasmider med Hpa, og rense de fordøjet produkter med en gel udvinding kit 24.
- Konstruere den absolutte kvantitative standardkurven og måle titer af virus i overensstemmelse med tidligere beskrevne metoder 25.
7. Myg transduktion
- vask 100 1 st instar Ae. albopictus larver tre gange ved hjælp af deioniseret vand og derefter overføre larverne i et bægerglas, der indeholder 95 mL deioniseret vand. Der tilsættes 5 mL af rAaeDV bestande (endelig koncentration på 1,00 x 10 10 eksemplarer/mL).
- Ruger 24 timer ved 28 ° C, vaske larverne tre gange ved hjælp af deioniseret vand, og derefter overføre larverne tilbage til pladerne og feed regelmæssigt.
- Overvågning af target genekspression i larver med qPCR eller vestlige skamplet (repræsentant resultater er vist i figur 3 og 4).
Bemærk: Fluorescens signal detection metode kan bruges til at isolere de smittede larver mere præcist. For eksempel, for at påvise fluorescerende signaler fra larver inficeret med rekombinant virus at udtrykke DsRed, kan larverne placeres på en hule dias og observeret under en inverteret fluorescens mikroskop hver 8 h indtil 2 dage efter infektionen. Når fluorescerende larver er registreret, skal de adskilles i individuelle plast test kopper at give mulighed for efterfølgende kontinuerlig observation. Larverne med flere væv inficeret kan identificeres ved hjælp af denne metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strategier for rAaeDV byggeri
En defekt rAaeDV vektor blev genereret for at udtrykke DsRed gen i myg larver. Den resulterende plasmid indeholdt en NS1-DsRed fusion protein kassette med VP protein slettet (fig. 1A). rAaeDV plasmider indeholder udtryk konstruktioner for miRNA, var miRNA svamp, shRNA og amiRNA designet (vist i figur 1B). For eksempel, blev en rAaeDV vektor genereret for at overexpress aal-Lad-7 i myg larver. Den resulterende plasmid indeholdt en intronic pre-aal-Lad-7 kassette i viral NS1 exon (figur 1B). En rAaeDV vektor indeholdende en intronic aal-Lad-7 svamp udtryk kassette i viral NS1 exon blev genereret for at vælte aal-Lad-7 udtryk i myg larver (figur 1B og figur 2B). En rAaeDV shRNA vektor og et rAaeDV amiRNA vektor indeholdende intronic shRNA og pre-amiRNA udtryk kassetter, henholdsvis, blev brugt til at banke ned V-ATPase mRNA i myg larver (figur 2C).
Beregning af rAaeDV titers udfra en standardkurve, der genereres med den lineære regressionsanalyser
Y-aksen repræsenterer Log10-værdien af standard DNA molekylære koncentration, og x-aksen angiver værdien CT. CT tal (x-aksen) og Log10 () koncentrationsværdier (y-aksen) vises en god korrelation (R2 = 0.9988) og opfylder ligningen y = - 0.288 x + 13.87 (figur 3). Beregn rAaeDV titers af prøver ved hjælp af den lineære ligning (tabel 1). Ved hjælp af metoden beskrevet i protokol (trin 6.2 og tabel 1), de høje titers af rAaeDV (4 mL, > 7.65 x 1010 partikler/mL) var høstet. Rekombinant vira (VrepUCA-7, VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s og VrepUCA-shct) blev genereret af transfecting tilsvarende infektion kloner pUCA-7, pUCA-7s, pUCA amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, pUCA-shct C6/36 celler (afsnit 3, 4 og 5).
Bestemmelse af miRNA overekspression og knockdown effektiviteten af rAaeDV vektorer
I eksemplet med vektor 100 1st instar larver blev behandlet med lige store mængder (1,00 x 1010 partikler/mL) af rAaeDV indeholdende intronic let-7 udtrykket, intronic Lad-7 svamp udtryk vektor, den menneskelige-specifikke pre-miR-941-1 udtryk vektor eller miR-941-1 svamp udtryk vektor ved at tilføje virus i selve vand larve levesteder. Fem dage efter infektion, udtryk for aal-Lad-7 var bestemt af qPCR (figur 4, n = 3; Supplerende tabel 2). Lad-7 niveauer, der vises som den gennemsnit ± SD af tre biologiske replikater i larver, var væsentligt forhøjes eller nedsættes af de pre-let-7-udtrykker rAaeDV (overexpressed 2,843.31 ± 80.72%, p < 0.0001, t-test) og den Lad-7-svamp-udtrykker rAaeDV (downregulated 74.78 ± 1,60%, p < 0.0001, t-test), henholdsvis.
Overvågning af rAaeDV vektorer knockdown V-ATPase mRNA-effektivitet
Alt 100 1st instar larver blev behandlet med lige store mængder (1,00 x 1010 partikler/mL) af intronic udtryk for amiRNA rAaeDV, intronic shRNA-udtrykker rAaeDV, human-specifikke pre-miR-941-1-udtrykker rAaeDV orscramble shRNA-udtrykker rAaeDV ved at tilføje virus i selve vand larve levesteder. Fem dage efter infektion, udtryk for V-ATPase mRNA blev bestemt af qPCR (figur 5, n = 3; Supplerende tabel 2). V-ATPase niveau vises som den gennemsnit ± SD af tre biologiske replikater i larverne blev væsentligt reduceret med amiRNA-udtrykker rAaeDV (downregulated af 43.01 ±6.37%, p = 0.0011, t-test) og intronic shRNA-udtrykker rAaeDV (downregulated af 72.88 ± 5,74%, p = 0,0001, t-test).
Figur 1 : Skematisk organisation af af rekombinante AaeDV plasmider. (A) pNS og pVP viral initiativtagerne drive udtryk for NS1/NS2 gener og VP gener, henholdsvis. I plasmidet p7NS1-DsRed var DsRed-gen smeltet NS1 gen. (B) pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-941-1, pUCA-941-1s, pUCA-shct, pUCA-shVTP og pUCA-amiVTP indeholder kunstige introns, herunder aal-Lad-7, aal-Lad-7 svamp, har-miR-941-1, har-miR-941-1 svamp, scrambled shRNA, V-ATPase shRNA og kunstige miRNA, henholdsvis, som var klonet i Hpajeg site af NS1 genet. Den kunstige intron er vist flanked efter en splejsning donor (DS) og en acceptor websted (AS) og indeholder et forgreningspunktet domæne (BrP), poly-pyrimidin tarmkanalen (PPT) og pre-miRNA. MiRNA svamp eller kunstige miRNA sekvens er indsat inde intron mellem 5-splejsning websted og BrP. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Biogenese af kunstige intronic mikroRNA (miRNA) og strategi til at generere miRNA svampe og kunstige miRNAs. (A) Intronic miRNA er co transskriberede inden for en forløber messenger RNA (præ-mRNA) af NS1, som vil blive drevet af pNS1-promotor og kløvet ud af pre-mRNA af RNA-splicing. Selvom exons er forbundet for at danne en moden messenger RNA (mRNA) til NS1 proteinsyntesen, forarbejdes splejset intron med pre-miRNA yderligere til modne miRNA af Dicer. (B) strategi til at generere de let-7 og miR-941-1 konstruktioner. Justering af let-7 og miR-941-1 sekvenser med aal-Lad-7 og har-miR-941-1, henholdsvis. Komplet matchende Regionsudvalget frø med regionerne anti-miRNA sekvens og hale er vist. Både Lad-7 og miR-941-1 svampe indeholder tre gentage antisense konstruktioner (røde bogstaver) der kan bindes til aal-Lad-7 og har-miR-941-1, henholdsvis. (C) sekvenser og forudsagt forløber strukturer for miRNA-baserede kunstige miRNAs og shRNA anvendes i denne undersøgelse. Modne kunstige miRNAs og shRNA er vist med rødt, og deres relaterede mål mRNA sekvenser er i blå. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Standardkurven for rAaeDV titrering og den beregnede koncentrations af MDVs. (A) Real-time qPCR blev udført med en pUCA standard, der var fortyndet med 10 gange forstørrelse forholdet, og værdien CT blev målt på en ABI 7500 som x. Kopi nummer blev beregnet efter trin 6.2 og 6.3 med følgende formel: Kopier nummer (y) =-0.288x + 10.87; R2 = 0.9988. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Rekombinant MDV-medieret aal-Lad-7 overekspression og knockdown i Ae. albopictus larver. (A) analyse af endogene miRNA udtryk i larverne efter infektion med rekombinant virus indeholdende aal-Lad-7 udtryk kassette (venstre panel). (B) effektivitet af anti-let-7 konstruktion blev fastsat i larver (højre panel). Har-miR-941-1 og har-941-1 svamp (negativ kontrol) overexpressed og downregulated den modne Lad-7 miRNAs, henholdsvis, sammenlignet med de basale niveauer observeret i kontrolgruppen. miRNA overflod var normaliseret til 5S rRNA, og dataene, der vises som den gennemsnit ± SD af tre biologiske replikater. T-test blev udført på forskellige niveauer af betydning. Stjernerne angiver statistisk signifikante forskelle mellem inficerede og tilsvarende mock-behandlede larverne (fire stjerner, p < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Analyse af V-ATPase mRNA udtryk efter infektion med rekombinant virus som indeholder shRNA og amiRNA kassetter. mRNA overflod var normaliseret til aalrpS7. Fejllinjer udgør standardafvigelsen af de 2−ΔΔCT værdier for V-ATPase mRNA udtryk i Ae. albopictus larver som vurderet af real-time RT-PCR (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Rekombinant MDV C T værdi bestemmes af qPCR svarer til den x værdi i den formel, der bruges til at beregne den y værdi. Det virale genom kopi nummer i hver 1 µL prøve blev opnået ved funktion magt (10, y), som var i sidste ende ganges med 40, konvertere værdien til virus fusionen virussuspension.
Supplerende tabel 1: Sekvenser af miRNA forløber.
Supplerende tabel 2: qPCR data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er vigtigt at løse to af de vigtigste barrierer, der begrænser rAaeDV konstruktion. Først er produktionen af defekte rekombinant virus. Det er blevet rapporteret, at MDV kan bruges som en vektor til at udtrykke ordentligt størrelse fremmede gener, som scorpion insekt-specifikke neurotoxins20 og normal god landbrugspraksis protein; men uanset konstruktion strategi, når ORFs MDV er indsat eller udskiftet med udefrakommende gener, virioner kan ikke danne uafhængigt medmindre en helper plasmid er cotransfected for at levere de manglende uundværlig virale proteiner. Defekt virus er i stand til at engagere sig i sekundære transmission, som opstår i vivo i myg med defekte genomer. Vores resultater validere en intronic udtryk-strategi, der tilbyder et nyt paradigme, der kan overvinde begrænsningerne af MDVs med defekt genomer at muliggøre effektiv levering af fremmede gener i myg.
Andet er den krævende længdebegrænsning af af rekombinante virale genom pålagt af størrelsen af viral kapsid. For effektiv pakning, må ikke genom størrelse overskride 4.400 nukleotider (110% af længden af wt MDVs genom). En intronic miRNA udtryk kassette (herunder miRNA udtryk kassette og kunstige intron) på ikke mere end 400 nt kan indføres i AaeDV genom. Selv om længden af af rekombinante virusgenom er stadig velegnet til emballage, har denne levering system plads til forbedring. På grund af begrænsningen i genom længde er det vanskeligt at udtrykke gener uden defekte intronic udtryk strategier.
Det er vigtigt at sikre, at C6/36 celler er sundt at aktiverer vellykket Transfektion og emballering af rAaeDV. Dog kationiske Liposom reagenser her og kommercielle insekt målcellen specifikke Transfektion reagenser, forbedre ikke effektiviteten af C6/36 celle Transfektion (40-60%). For at høste high-titer rekombinant virus, er det derfor nødvendigt at opretholde cellerne i 5 dage efter Transfektion baseret på tidligere beskrevet vækst egenskaber14. Derudover for vellykket larver infektion er det afgørende for larver at være i kontakt med smitsom viruspartikler for 24-36 h til at sikre høj infektion nøgletal23.
Sammenfattende er intronic udtryk strategi beskrevet her de første til at overvinde de barrierer, der er pålagt af generation af defekte MDV. Denne strategi muliggør fremstilling af ikke defekte rekombinante MDVs, der kan overexpress eller nedregulere miRNAs og target gener i myg. Denne teknik giver et værktøj til funktionel analyse af myg gener uden brug af komplicerede larver mikroinjektion procedurer og har klare kommercielle applikationer. Yderligere undersøgelser vil udvide anvendelsen af de beskrevne udtryk strategi at undersøge myg biologi og paratransgenesis for dengue virus kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender finansiel støtte fra den nationale nøgle forskning og udvikling Program i Kina (2016YFC1200500 til Xiao-Guang Chen), National Natural Science Foundation of China (81672054 og 81371846), Team forskningsprogram af naturligt Science Foundation i Guangdong (2014A030312016), og den videnskabelige og teknologiske program over Guangzhou (201508020263). Vi anerkender taknemmeligt Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) venligst give pUCA og p7NS1-NGL plasmider og kritisk læsning dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, (Online) 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).
- BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/ (2017).
- GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al.
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
