Summary
ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq ライブラリの準備のプロトコルについて述べる。
Abstract
クロマチン免疫沈降 (チップ) は、クロマチン修飾酵素特定の軌跡やゲノム規模で、転写因子やヒストン ファーストクリーニング変更されたヒストンのローカリゼーションをマッピングするための広く使われている手法です。次世代シーケンス (すなわち、チップ Seq) とチップ試金の組み合わせは、遺伝子制御ネットワークを世界的に明らかにして特に規制の非コーディング シーケンスのゲノムの機能アノテーションを改善する強力なアプローチです。チップ プロトコルは通常多量の細胞材料、従ってまれなセルタイプまたは小さい組織生検の調査にこの法の適用性を排除を必要です。チップ試金を初期脊椎動物胚体内で通常得られる生物学的材料の量に対応するために、するために述べるここでチップの簡易プロトコルを完了するために必要なステップ数、アッセイは、サンプルの損失を最小限に抑えるために減少しました。このチップ プロトコルは様々 なニワトリ胚および成体組織中細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) に低の異なるヒストン修飾を調査するため正常に使用されています。重要なは、このプロトコルは標準ライブラリの作製法を用いたチップ seq 技術と互換性のある、関連性の高い萌芽期ティッシュのマップ グローバル エピゲノムを提供します。
Introduction
ヒストン翻訳後修飾は、転写、複製 DNA 修理1,2,3など、さまざまなクロマチンに依存するプロセスに直接関与しています。さらに、異なるヒストン修飾を示す正 (などH3K4me3 と H3K27ac) または負 (例えばH3K9me3 と H3K27me3) 遺伝子の発現との相関と広く定義することができます活性化または抑圧的なヒストンをマークしたようそれぞれ2,3。その結果、全体的なヒストン修飾マップ、エピゲノム マップとも呼ばれますが、機能的脊椎動物のゲノム4、5の注釈に強力で普遍的なツールとして浮上しています。たとえば、遠位規制エンハンサーを識別できるように基づく系列クロマチンの特定の存在 (例えば、アクティブなエンハンサー: H3K4me1 と H3K27ac)、近位プロモーター領域からそれらを区別する (など活性プロモーター: H3K4me3)6,7,8。その一方で、主要な細胞アイデンティティの規定する機能を持つ遺伝子、通常、広範なクロマチン ドメインそれぞれ根本的な遺伝子の転写活性アクティブまたは非アクティブの状態に応じて H3K4me3 と H3K27me3、マーク9 で発見します。 ,10。同様に、主要な細胞アイデンティティ遺伝子発現クラスター化エンハンサー (すなわち、超エンハンサー) 広範な H3K27ac マーク ドメイン11として識別することができます複数のと空間的に制御する頻繁にようであります。
現在、ヒストン修正図を生成する技術を使用してチップ seq チップ (チップ マイクロ アレイに結合) などの従来のアプローチと比較して高い解像度、ノイズ、大きい範囲、および下位以下の少ないアーティファクトを提供しますコスト12。それにもかかわらず、エピゲノム マップ チップ seq 技術を使用しての世代が関心のサンプル チップを正常に実行する能力と大抵関連付けられるその固有の限界あります。伝統的なチップ プロトコルは通常細胞の培養系にこの法の適用性線またはセル範囲が制限簡単に分離できます生体内で(例えば、血液細胞) 細胞の数百万を必要です。ここ数年で低細胞数と互換性のあるチップ プロトコルの修正の数は説明13,14,15,16をされています。ただし、これらのプロトコルを次世代シーケンス (すなわち、チップ seq) と結合される設計、彼らは通常アドホック図書館準備方法13,14,を使用15,16。
ここでは、我々 は中間に低細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) を使用して、ヒストン変更プロファイルを調査するためチップ プロトコルを記述した (すなわち、チップ qPCR) いずれかの選択した軌跡またはグローバル (すなわち、チップ seq) (図 1)。チップ seq 技術を組み合わせることで、当社のチップ プロトコルは標準ライブラリの製法をできるようになり、多くの研究所10に幅広くアクセスと共に使用できます。このプロトコルは、いくつかのヒストンを調査に使用されている(例えば、 H3K4me3、H3K27me3、および H3K27ac) 異なる鶏胚組織 (例えば、脊髄神経管 (SNT)、成人プロミネンスと胚盤葉上層) で。ただし、少量で、生物学的および臨床的に関連するサンプルをだけ得ることが他の生物に広く適用されると見込んでください。
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Protocol
ドイツ動物のケアのガイドラインに従って施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 承認された鶏胚の実験を実行する必要ありません。ローカルのガイドラインに従ってのみ実験鶏 HH44 (18 日) 胚と古い IACUC 承認が必要。ただし、本研究で使用される胚は胚の開発の初期の段階ですべてだった (すなわち HH19 (72 h)).
注: このプロトコルの目的は qPCR または次世代シーケンス (すなわち、 チップ seq) のヒストンの修正を調査すると効果的に組み合わせることができますので、チップ試金の詳細な説明を提供するために低豊富な胚サンプル (5 × 10 4-5 x 10 の 5 セル各チップの反作用のため) と異なる組織型 ( 図 1)。プロトコルは転写因子と共活性剤 (例えば p300) の結合プロファイルを調査に適用する必要があります。ただし、これらの調節蛋白質の低い豊富なのため大きな細胞数が必要 (5 x 10 5 - 各チップの反応の 5 × 10 6 セル) をする可能性があります
。1。 準備の卵と鶏の SNT の
注: microdissections 手順は技術的に組織に組織および動物モデルと動物モデルから異なります。解剖のプロトコル使用例鶏胚をステージ HH19 から、上腕の SNT セクションを取得する詳細について説明します
。- 37 ° C、湿度 80% ステージ HH19 鶏胚を得るための 3 日間で水平方向での地元のブリーダーから得られる、肥沃な白色レグホーン鶏の卵を孵化します 。
- ハンバーガーとハミルトンに従って段階鶏胚発達ステージング システム 17 決定します 。
- 冷たい条件の下ですべての microdissections を実行; クロマチンの整合性を侵害可能性がありますそうでなければ、.
- HH19 胚を隔離します。
- 胚にアクセスできるように、10 mL シリンジ針 (0.90 × 40 mm) を用いた、胚を下げるためアルブミンの 3 mL を抽出します 。
- 高級はさみを使って卵に小さな開口部を作るし、ロック溶液 1 mL を追加 (レシピの 補足資料 参照) 胚体外膜の除去を容易にします 。
- 胚の可視化を容易にするため、すなわち下針 (0.55 × 25 mm 2) で 1 mL 注射器を使用して 10% インド黒インク/ロック溶液を注入しています 。
- 医療外科高級はさみと鉗子を使用して胚を囲む胚体外膜切断します 。
- 4.5 cm x PBS ソリューション 1 の 20 mL を含むペトリ皿に胚を転送する穴あきスプーンを使用します 。
- 、羊膜と高級シザーと顕微鏡下で鉗子を使用した胚体外膜の残りの部分を離れて解剖します 。
- 尾 SNT ( 図 2) を分離する胸部領域に拡張胚の上腕のレベルで横の SNT セグメントをカットします 。
- 横/腹側 (例えば、 側板中胚葉、外胚葉、脊索、および大動脈) SNT を囲む組織を削除する鉗子 ( 図 2) を使用します 。
- 3.5 cm シャーレ暖かい (37 ° C) トリプシン (トリプシン EDTA/ソリューション 1: 250) 5 mL を含む解剖鶏 SNT セグメントに没頭します 。 SNT の周りの非神経組織の緩みが顕微鏡下で検出された場合、
- はトリプシン処理を停止します
。 注: trypsinization 時間する必要があります厳密に管理する過剰消化・神経組織の分散を避けるためとの SNT の構造の整合性を保持する 。
- トリプシン処理後きれいな SNT 部分を準備する手動で残り、外胚葉性間葉系組織を削除します 。
- は、SNT セクションを 1.5 mL チューブに転送し、フラッシュを液体窒素で凍結それ。一度十分な SNT セクションは蓄積された (プールの SNT セクション 1 つのチップの反作用のための ~ 30 鶏の胚から)、-80 デパート ° C
注: 場合十分な萌芽期ティッシュ (5 すなわち 5 x 10-5 x 10 の 6 セル) 単一または少数の鶏胚から解剖することができ、凍結が必要ではありません、直接次の手順に続行することが可能です。表 1 のトラブルシューティング ガイドを参照してください
。 注: 注意!液体窒素は超低温、適切な保護具を着用します 。
2。DNA に架橋タンパク質: 日 1
注: 特に明記しない限り氷の上のすべての手順を実行します
。- 追加 500 μ L DMEM の 10 %fbs と凍結組織に直接 1 M Na 酪の 10 μ L、あるいは新たに切り裂かれたティッシュをすぐに。再 1 mL ピペットをゆっくり停止することによって細胞をホモジナイズしてください
。 注: Na 酪酸の追加はオプションですが推奨されるヒストンのアセチル化を調査する場合。DMEM-10 %fbs ではなく 0.1 %bsa を用いた 1 × PBS でサンプルを再停止することができます。政府短期証券や BSA の追加はオプションですが、その後遠心分離の手順でサンプルをペレット化を容易にします 。
- 37% ホルムアルデヒド (1% ホルムアルデヒド ファイナル) の 13.5 μ l 添加し室温で 15 分間ローテータの上に置きます
。 注: 注意!ホルムアルデヒドは有毒な 。
- 管に 2.5 M のグリシンの 25 μ L を追加し、ホルムアルデヒドを抑制するために室温で 10 分間の回転子の上に置きます 。
- スピン テーブル トップ遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 850 x g のチューブです。上澄みを廃棄します 。
- 一度風邪を 500 μ l 添加の餌を洗浄作りたてを洗って 850 x g と、5 分の 4 ° C で (レシピの 補足資料 を参照)、遠心分離機をバッファー、上澄みを廃棄します 。
3。換散および超音波処理
- 準備完全な換散バッファー (LB) (レシピの 補足資料 を参照してください)、冷たい氷の上。1 mL の LB、プロテアーゼ阻害剤濃縮 (25 x) の 40 μ L、100% の 10 μ L の 950 μ L を使用して、PMSF 。
- ピペッティングによる完全なポンドの 300 μ L でペレットを再懸濁します、4時 10 分にロッキング プラットフォームに ° C
- は、次の設定を使用してサンプルを超音波照射: 温度 4 ° C = 合計時間 = 7 分、“ に ” 間隔 = 30 s、“ オフ ” 間隔 = 30 s、振幅 = 25%
注: 超音波照射条件は各組織の最適化が必要な超音波発生装置の使用によって異なります。200 から 600 に至るまでせん断の DNA は、最低の超音波処理設定を使用するお勧めサイズで bp。ひら組織型によって大きく異なりますせん断ty、超音波ボリューム、架橋条件、および装置。表 1 のトラブルシューティング ガイドを参照してください 。
- 細胞の残骸をペレットへの 4 ° C で 10 分間 16,000 x g で熱量のサンプルをスピンします 。
- が新鮮な 1.5 mL チューブにライセート (清) を転送します
。 注: 出発原料は 2 つのチップの実験のための十分な場合、完全なポンドの 300 μ L に追加できる熱量クロマチン (すなわち、 最終巻: 600 μ L). - 10% の追加の 30 μ L オクチルフェノールエトキシ レートのすべての 300 μ L の超音波溶解処理 (最終濃度: 1%)、ピペッティングで混ぜます
。 注: 注意!オクチルフェノールエトキシ レートは急性毒性 (経口、経皮、吸入).
4。抗体の孵化
- 因数、330 μ L の 2 つの 1.5 mL チューブにライセート超音波処理: チップと入力コントロール (原料の 10%) として 30 μ L 300 μ L。ストア、" 30 μ L 入力コントロール サンプル " に-20 ° C
注: 660 μ 超音波溶解処理し、2 つのチップの反応が同じサンプルから実行される場合配布できる 3 つの 1.5 mL チューブ (300 μ L チップ #1、チップ #2 300 μ L と入力コントロール (各チップの原料の 20%) として 60 μ L のために). - を加える熱量クロマチン因数とミックスする反転の 300 μ L 抗体の 3-5 μ g.
注: この研究では、各チップの反応を行った K4 でメチル化されたヒストン H3 トライの抗体 (H3K4me3) K4 でメチル化されたヒストン H3 ・ ディ ・ (H3K4me2)、K27 でメチル化されたヒストン H3 トライ (H3K27me3)、K27 のヒストン H3 トライ アセチル化 (H3K27me3)。このプロトコルの成功は、使用される抗体の品質に完全に依存です。抗体は、特定、特定のタンパク質の免疫沈降で効率的にする必要があります。複雑な immunoprecipitate 架橋蛋白質・ DNA を使用することができる抗体の量を決定することが重要です。また、抗体の特異性は、それが正しい蛋白質を検出することを確保するため西部のしみでチェックできます。複数の非特異的なバンドを検出する抗体はチップ推奨されません 。
- は、クロマチンへ 4 ° C で一晩 (12-16 h) 抗体をバインドするロッキング プラットフォーム上管を配置します
。 注意: 表 1 にトラブルシューティングのガイドを参照してください 。
5。磁性ビーズの作製: 日 2
- 洗浄 3 回コールド ブロック ソリューションと磁気ビーズ (レシピの 補足資料 参照) (4 ° C)。反転またはフリックで 500 μ L のコールド ブロック ソリューションとミックスを追加します。マグネット ホルダーに管を入れ、管の側に解決するビーズを待ちます。透明な液体を注ぐを繰り返します。最後の洗浄後、すべて液体ゲルの読み込みヒントを削除します 。
6。クロマチン免疫沈降
- 洗浄ビーズに抗体が結合クロマチンの 300 μ L を追加し、ミックスに反転します 。
- 抗体をビーズにバインドする、少なくとも 4 時間のための 4 ° C で管の回転で縦方向に回転します 。
7。洗って、溶出、逆にクロスリンク
- チル RIPA 洗浄バッファー氷上では、風呂の水を 65 ° C に設定 (レシピの 補足資料 を参照してください)、4 に遠心分離機を precool ° C
- は、4 回 1 mL の冷 RIPA 洗浄バッファーでクロマチン結合ビーズを洗浄し、氷の上を保ちます。これを行うには、反転またはフリックによって冷 RIPA 洗浄バッファー ミックス 1 mL を追加します。マグネット ホルダーにチューブを置き、ビーズ、チューブの側に解決を待ちます。透明な液体を注ぐし、繰り返します
。 注意: RIPA 洗浄バッファーで洗浄の数を最適化する必要がありますサンプル タイプ、サンプルの豊富なと使用されている抗体の応じて。洗浄数の増加がバック グラウンドを減少させるが、また減少 qPCR またはチップ シーケンスによる下流解析を妥協することができます回復された DNA の合計金額 - チューブにテ/50 mM NaCl の 1 mL を追加し、前述のように、マグネット ホルダーを使用して液体を削除する前に新鮮な 1.5 mL および microfuge の管に TE/50 mM NaCl でクロマチン結合ビーズを転送します 。
- 4 ° C で 3 分間 900 x g でビーズをスピン、マグネット ホルダーに管を配置し、ゲルの読み込みヒントと残りのすべてのテを削除します 。
- 溶出バッファーの追加 210 μ L (レシピの 補足資料 参照) 常温、フリックすることで再懸濁します 。
- 揺れながらヒート ブロックの 65 ° C で 15 分間想定し, 浸出液 。
- 室温で 1 分 16,000 x g でビーズをスピンし、磁気ホルダーにチューブを配置します 。
- ビーズが落ち着いて一度新鮮なおよび microfuge の管に上清 (〜 200 μ L) を転送します 。
- (手順 4.1 で冷凍) 部屋の温度-20 ° C から入力コントロールのサンプル (30 μ L) を解凍溶出バッファー (90 μ L) の 3 つのボリュームを追加し、ミックスを簡単にボルテックス 。
- 65 ° C で一晩 (12-16 h) クロスリンクを逆にチップとコントロールのサンプルをインキュベートします 。
8。ダイジェスト細胞蛋白質と RNA: 日 3
- 8.1At 室温 (SDS をうすめる) チューブ TE バッファーの 1 ボリュームを追加して、ミックスに反転: コントロールのサンプルの 120 μ L、200 μ L チップ サンプルに TE の 200 μ L に TE の 120 μ L を追加します 。
- 追加 RNase A 0.2 mg/mL 最終濃度、反転にミックスする: 20 mg/ml の RNase A 2.4 μ L を追加し、コントロールのサンプルの 240 μ L 4 μ L チップ サンプルを 400 μ l 添加する RNase A を 20 mg/mL の 。
- 37 ° c に RNA を消化 2 h の水風呂でチューブをインキュベートします 。
- ミックスは、最終濃度 0.2 mg/mL と反転の「プロティナーゼ K を追加: コントロール サンプルの 240 μ l と 20 mg/mL, プロテイナーゼ K 400 μ L チップ サンプルための 4 μ l に 20 mg/mL プロティナーゼ K の 2.4 μ L を追加します 。
- 蛋白質を消化し、DNA を浄化する 55 ° C の 2 h の水浴中で加温します 。
9。チップ qPCR
注: 補足資料 で説明されているように DNA の抽出および浄化を実行します
。注: 前述の 補足資料、( 図 3) を 200-500 bp の DNA 断片が得られることを確認するために超音波処理効率を確認します
。注: チップが実際に働いていたかどうかを決定するための重要なステップです。既知の興味の蛋白質のためのゲノム結合部位がある場合のプライマーを設計できます量的な PCR (qPCR) 知られているサイトがチップ DNA で濃縮され具体的にかどうかを決定するために拘束されることがなく期待陰性コントロール領域との比較チャンディ日付蛋白質。例として、この作品はチップ H3K4me3 の実行により得られたチップ qPCR 結果を示しています (アクティブなプロモーター ヒストン マーク) と H3K27me3 (アクティブでないプロモーター ヒストン マーク) HH14 ニワトリから分離された SNT のセクションで ( 図 4 a).
- 同じ管で各プライマーのペア (前方および後方) を混合し、各を使用して 20 μ M でストック濃度を準備 dH 2 O (表 2).
注: 各プライマーの効率は、チップ qPCR 解析の前に評価されるべき 。
- はチップと 20% の入力コントロール ステップ 8.5 qPCR 最適化で得られた DNA を使います
。 注: DNA は通常入力希釈 20 x (チップの反作用で使用される原料の 1%) を qPCR 解析します 。
- 各 10 μ L の PCR、PCR チューブに次のコンポーネントを混在させる: DNA マスター ミックス (チップまたは 1% 入力) から 2 μ dH2O、SYBR グリーン ミックスの 2.5 μ、1 μ L の DNA を追加; プライマーとマスター ミックス、dH2O、SYBR グリーン ミックスの 2.5 μ L、前方および逆プライマー ミックスの 0.125 μ L の 2.375 μ L を追加します。
- 2 s と 1 分 900 × g で遠心する簡潔にボルテックスによってサンプルをミックス
- は、リアルタイム PCR (プライマーおよびここで使用されるサイクリング条件の例にあります 表 2 および 表 3、それぞれ) を実行します
。 注: チップ qPCR データ分析: チップ信号は入力のパーセントとして計算されます。簡単に言えば、一度 Ct 値を取得各 qPCR 反応、100 または 6.644 サイクルの希釈倍率 (100 log2) が入力の DNA 反応で得られた Ct 値に適用されます。次に、(すなわち プライマー) の関心の特定の領域、チップ信号を計算通り:
入力を調整 = Ct (入力) - 6.644
チップ信号 = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. チップ seq ライブラリの準備;終わり修理: 4 日目
- 100 まで希釈溶出バッファーの 60 μ L の DNA チップの ng (材料 の表 を参照してください).
- エンドの追加 40 μ L ミックスを修復し、ピペットの軽く 10 倍 。
- サーマルサイクラー上で 30 分間 30 ° C に加温します 。
- 磁気渦ビーズ終わり修理ミックスを含むチューブに 160 μ L を追加。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 15 分間インキュベートします 。
- マグネット ホルダーにチューブを置き、側管. 解決するビーズを待つ
- 透明な液体を注ぐ 。
- マグネット ホルダーをチューブのまま、作りたての 80% の 200 μ L を追加 EtOH 。
- 加温室温 30 s と破棄上清で。一度を繰り返して
- は、マグネット ホルダーに室温で 15 分の管を維持します。ペレットが乾燥していたら、マグネット ホルダーからチューブを削除します 。
- は、再懸濁バッファーの 20 μ L にペレットを再懸濁します。ミックス徹底的に 10 倍を軽くピペットします 。
- 室温で 2 分間加温します 。
- マグネット ホルダーにチューブ、チューブの側に解決するビーズの待ちます。上澄みの 17.5 μ L を新しいチューブに転送します 。
11。チップ seq ライブラリの準備;アデニル酸 3 ' 終了
- 新しい A テーリング ミックス追加 12.5 μ 管と上下に 10 回軽くピペッティングして徹底的にミックス。サーマルサイクラーに管を配置し、次のプログラムによると孵化させなさい: 37 ° C、30 分、70 ° C、4 ° C で 5 分押し
12。チップ seq ライブラリの準備;アダプターを縛る
- 再懸濁の追加 2.5 μ L バッファー、結紮ミックスの 2.5 μ L と適切な RNA アダプター インデックスの 2.5 μ L。ミックス徹底的に優しく上下に 10 回ピペッティングします 。
- 30 ° で 10 分間のサーマルサイクラーに加温します 。
- ストップ結紮バッファーと 10 回のピペッティングで徹底的にミックス追加 5 μ L.
- 渦磁気ビーズ、42.5 μ L をサンプルに追加します。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 15 分間インキュベートします 。
- マグネット ホルダーにチューブを置き、管の側に解決し、明確な液体を注ぐビーズを待つ
- マグネット ホルダーをチューブのまま、作りたての 80% の 200 μ L を追加 EtOH 。
- 加温室温 30 s と破棄上清で。もう一度繰り返します 。
- マグネット ホルダーに管を保持し、15 分空気乾燥させるサンプル 。
- はマグネット ホルダーからチューブを削除し、再懸濁バッファーの 52.5 μ L でペレットを再懸濁します。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。2 分間室温でインキュベート、マグネット ホルダーにチューブ、チューブの側に解決するビーズの待ちます。明確な上澄みの 50 μ L を新しいチューブに転送します 。
- 渦磁気ビーズのサンプルに 50 μ L を追加。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 15 分間インキュベートします 。
- マグネット ホルダーにチューブを置き、管の側に解決し、明確な液体を注ぐビーズを待つ 。
- マグネット ホルダーをチューブのまま、作りたての 80% の 200 μ L を追加 EtOH 。
- 加温室温 30 s と破棄上清で。もう一度繰り返します 。
- マグネット ホルダーにチューブを維持し、15 分の乾燥サンプル空気
- はマグネット ホルダーからチューブを削除し、再懸濁バッファーの 27.5 μ L でペレットを再懸濁します。10 回のピペッティングで徹底的にミックスします 。 2 分間、室温で
- 加温マグネット ホルダーにチューブ、チューブ側に解決するビーズの待ちます。明確な上澄みの 25 μ L を新しいチューブに転送します 。
13。チップ seq ライブラリの準備;DNA のフラグメントの増幅
- 0.2 mL PCR のテンプレートの場所 12.5 μ 管。上下に 10 回ピペッティングして徹底的に PCR プライマー カクテルの 2.5 μ、10 μ L の強化された PCR ミックス ミックスを追加します。サーマルサイクラーにチューブを置き、表 4 に示した条件を使用します 。
- 渦磁気ビーズとサンプルを 25 μ L を追加。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 15 分間インキュベートします 。
- マグネット ホルダーにチューブを置き、管の側に解決し、明確な液体を注ぐビーズを待つ 。
- マグネット ホルダーをチューブのまま、追加 200 μ L 作りたての 80% のエタノール。30 s や破棄上清のため室温で孵化させなさい。もう一度繰り返します 。
- マグネット ホルダー、みましょうサンプル空気管が 15 分乾いた状態に保つはマグネット ホルダーからチューブを削除し、再懸濁バッファーの 32.5 μ L でペレットを再懸濁します。10 回のピペッティングで徹底的にミックスします 。
- インキュベートします。PCR チューブ/プレート常温で 2 分間。室温でマグネット スタンドに PCR チューブ/プレートを置き、チューブ側を解決し、新しいチューブに上清の 30 μ L を転送するビーズを待つ 。
14。チップ seq ライブラリの準備;ライブラリ検証
注: ライブラリの検証は、DNA および RNA の品質管理システムを使用して行われます。はしごの準備: 最初にゲノム DNA の梯子の 1 μ L 分注チューブ/ウェルとサンプル バッファーを 3 μ l 添加します
。- サンプルの調製: チューブ サンプル バッファーの 3 μ L でライブラリのサンプル (10-100 ng/μ L) の 1 μ L をミックスします。スピン ・ ダウンし、管の下部にサンプル配置に 5 s. スピンの最大速度に渦 。
- 品質管理システムにサンプルをロードします 。
- の実行が終了したら、プライマー二量体の例 ( 図 5) に存在がない; 帯約 135 プライマー二量体が対応する必要がありますを確認する最大値にコントラストを設定することによって、結果の分析 bp。でも弱いバンドが存在する場合は、溶出バッファーを追加して 2 番目のクリーン アップに進みます混合磁性体ビーズ 47.5 μ L を追加、最大で 50 μ L のボリューム (表 参照)。サンプルの濃度が低すぎる場合 (< 2 nM)、PCR (ステップ 13.1) の実行を続行、ステップ 12.16 から左 12.5 μ L のサンプル量で 15 ではなく 18 サイクルを使用します 。
- は、qPCR 市販キットを使用して、個別にライブラリを定量化します
。 注: ライブラリのプール シーケンス処理できるシーケンサーを用いた 30 M の読み取り/サンプルを目指して 1 x 50 nt プロトコルの単一読み取り 。
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Representative Results
チップ seq 実験 HH19 鶏の胚からプールの SNT セクションを使用して、HH22 の上顎突起鶏胚との結合プロファイルを調査する段階 HH3 鶏胚を行ったチップ プロトコルのパフォーマンスを示すためには、各種のヒストンの修正は (すなわちH3K4me2、H3K27ac、H3K4me3、および H3K27me3)。チップ Dna が得られた後、超音波処理効率は対応する入力 Dna (図 3) のアガロース電気泳動で評価しました。チップと入力の Dna は遺伝子座のバインドまたは調査のヒストンの修正 (図 4 a) で非連結予想で濃縮を測定するチップ qPCR 解析に使用されました。図 4 aH3K27me3、H3K4me3 濃縮の例 HH19 SNT のセクションでレベルは SOX17、SOX2、非アクティブ、アクティブ、SNT では、それぞれ 2 つの遺伝子のプロモーター領域の周りチップ qPCR で評価しました。予想通り、SOX2 プロモーター強く示された H3K4me3 が、H3K27me3 ではなく SOX17 プロモーターを示した (図 4 a) の逆のパターン。いくつかの遺伝子座を評価することによって下流のチップ seq 分析多くの DNA 資料を失うことがなく、チップの品質を推定することが可能です。チップの品質を確認した、チップ seq ライブラリが準備し、シーケンスします。調査鶏胚組織のそれぞれの代表的な遺伝子座が表示されます: PAX7 (図 4 b); 周り HH19 SNT 鶏胚 H3K27me3 と H3K4me3 用プロファイル (i)(ii) HH22 鶏胚SNAI1 (図 4); 周りの上顎突起で H3K4me2 や H3K27ac のプロファイルTBX3/TBX5 軌跡 (図 4) 周り HH3 ステージ鶏胚における H3K27me3 (iii) プロファイル。これらチップ seq 実験が分かり、当社チップ プロトコルを使用して萌芽期ティッシュの広い範囲の生物材料の少量からエピゲノム プロファイルを生成できます。
図 1: 鶏の胚から分離した低豊富な胚サンプル チップ プロトコルの概要。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: SNT レーザーマイクロダイ セクション プロトコルの概要します。横の SNT セグメント HH19 鶏胚の上腕のレベルで切り離されています。トリプシン処理後は機械的に鉗子を使用して非神経組織を除去します。ない、脊索;SNT、脊髄神経管;そして、体節。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 最適な超音波処理の例です。鶏 SNT HH19 サンプル 11 サイクル、30 s および、超音波発生装置を使用して「高」の振幅で 45 秒 OFF パルス超音波だった。クロスリンクが逆転した、精製した DNA は、1.5% の agarose のゲルに解決されました。200-500 跪くに至る 11 サイクル後最適なフラグメントのサイズを観察この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: チップ qPCR またはチップ シーケンスによるチップ解析の一例(A) H3K27me3 (左) と示された地域で H3K4me3 (右) レベルをチップ qPCR による HH19 ニワトリから分離された SNT セクションを用いて測定しました。SOX2 プロモーター領域の SNT でアクティブなと H3K4me3 によって H3K27me3 のではなく、したがってとしてマークSOX17 プロモーター領域の SNT でアクティブではないと H3K27me3 ではなく、H3K4me3; したがって濃縮されてChr6 ネガティブは鶏染色体 6 の遺伝子間領域を表します、ネガティブ コントロールとして機能します。誤差範囲は、3 つの技術的な複製から標準偏差を表しています。(マゼンタの H3K27me3、ブルー、H3K4me3 と赤で入力)、(B) のチップ seq PAX7 軌跡周り HH14 SNTs ニワトリ胚からのプロファイルが表示されます。(C) チップ seq (オレンジ色の H3K4me2、緑、H3K27ac、赤で入力) SNAI1 遺伝子座の周り HH22 のひよこの胚の上顎突起からプロファイルが表示されます。(D) チップ seq TBX3/TBX5 軌跡の周り HH3 ニワトリ胚から (マゼンタの H3K27me3) と赤で入力プロファイルが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: チップ seq ライブラリ検証自動 RNA 品質管理システムを使用しての例です。(A) 前に自動化された RNA 品質管理システムで同じチップ seq ライブラリを行った、(B) プライマー二量体のクリーンアップの後。プライマー二量体は、(A) で弱い 〜 135 bp のバンドとして見なすことができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 手順 | 問題 | 可能な理由 | ソリューション |
| 1,2,3,4 5 と 11 | QPCR チップやチップ seq によるとノイズ比低チップ信号 | 組織の品質が損なわれます。 | 冷たい条件でミクロ解剖を実行します。それ以外の場合、クロマチンの完全性が侵害されます。 |
| 架橋サンプルの遠心分離後サンプル損失。 | 10-20% 血清と繰り返し遠心分離のステップ DMEM 培地を使用し、10 分時間を増やします。 | ||
| 架橋の期間です。 | 架橋時間を最適化します。増加架橋回共活性剤と DNA に直接バインドしない共リプレッサーなどの特定のタンパク質の検出を促進できます。 | ||
| PBS で洗浄によるサンプルの損失。 | 洗浄する; の数を減らす1,500 × g で遠心分離手順を繰り返すことができます。 | ||
| 長すぎるか短すぎる DNA サイズに最適な超音波。 | 超音波照射条件を最適化する時間コース実験を実行します。200 から 500 に至るまで最適なフラグメント サイズ bp | ||
| 抗体チップには適していません。 | 内因性蛋白抗体が異なる、またはの外に表現された蛋白質 (例えばフラグ、HA) に追加されるタグ抗体を使用します。 | ||
| 12 | 低または DNA の入力に対しても、qPCR でない信号 | 最適なプライマー | プライマー効率と特異性を確認します。新しいプライマーを設計します。 |
| DNA の量が不足 | 十分な原料。QPCR 反応ごとに使用される DNA の量を増やします。 |
| プライマー | シーケンス |
| SOX2 F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
| SOX2 R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
| SOX17 F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
| SOX17 R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
| Chr6-指定、総额-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
| Chr6-指定、総额-R | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
表 2: チップ qPCR のプライマー シーケンス。
| 週間 | ||
| 温度 | 時間 | |
| 95 ° C | 5 分 | |
| 増幅 | ||
| 温度 | 時間 | |
| 95 ° C | 10 s | |
| 60 ° C | 10 s | 45 |
| 72 ° C | 10 s | サイクル |
| 融解曲線 | ||
| 温度 | 時間 | |
| 95 ° C | 5 s | |
| 65 ° C | 1 分 | |
| 冷却 | ||
| 40 ° C | 30 s | |
表 3: チップ qPCR の PCR 条件です。
| 初期変性 | ||
| 温度 | 時間 | |
| 95 ° C | 3 分 | |
| 増幅 | ||
| 温度 | 時間 | |
| 98 ° C | 20 s | |
| 60 ° C | 15 s | 15 |
| 72 ° C | 30 s | サイクル |
| 最終的な拡張 | ||
| 温度 | 時間 | |
| 72 ° C | 5 s | |
| 冷却 | ||
| 4 ° C | ホールド | |
表 4: PCR 条件チップ seq 図書館準備中に DNA のフラグメントの増幅。
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Discussion
エピゲノム チップ seq を使用してヒストン修飾のプロファイリングは、異なる携帯電話4,5,18で脊椎動物のゲノムの機能アノテーションを改善するために使用できます。これらエピゲノム プロファイルは使用できます、他のものの間でエンハンサー エンハンサー (すなわち、アクティブ、プライミング、または構え)、規制の状態を定義し、異なる生物の主要な細胞アイデンティティ レギュレータを定義する要素を識別するためにまたは病理学的コンテキスト (例えば、広い H3K4me3 プロモーター ドメインおよびスーパー エンハンサー)6,7,9,10、11,19。ただし、通常細胞の数百万が必要です、チップ試金の特有の制限によりプロファイル細胞株の in vitroにおける生成されているし、セルのタイプすることができますほとんどのヒストン修飾の並べ替え生体内で大量に4. 最近で非常に低細胞数、細胞の種類の範囲を劇的に拡大と互換性があるいくつかのチップ seq プロトコルが記載されている、どのエピゲノムのプロファイルすることができます、原則として組織生成13 ,14,,1516。これら新しいチップ seq プロトコル各は、少なくともいくつかのケースで標準機器や試薬14,15,16を必要とする特定アドホックのライブラリの準備方法に依存します。
ここでは、生体内で異なる萌芽期ティッシュ10から得られる中間細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) に低で動作するチップ プロトコルについて述べる.当社チップ試金の感受性を高める、シーケンシャル細胞、核溶解、貴重な材料の進歩的な損失につながるなど、チップの中に通常使用されるいくつかの手順を排除している私たち。したがって、架橋結合の後サンプルは単一換散バッファーで処理され、その後サンプルの損失を最小限に抑えるために超音波処理が。重要なは、私たちのチップ プロトコルは qPCR 分析、従って興味の選択した軌跡のエピゲノム解析を有効にすると互換性が。さらに、標準的なチップ seq ライブラリ製法、従って次世代シーケンシング技術へのアクセスをほとんどの実験室に潜在的に有用であると私たちのチップ プロトコルを結合できます。
チップとチップ seq プロトコルは、ヒストンの結合プロファイルを調査するのみならず、転写因子や共活性剤 (例えばなどの他の重要な転写制御因子の結合部位を明らかにするも使用できます。p300 および CBP)20。通常、チップ (チップ seq) 転写因子の共活性剤はないとヒストンと同じくらい豊富、ヒストンのチップよりもかなりより原料を必要とします。したがって、ほとんどの転写因子の説明プロトコル可能性があります必ずしも動作しないまたは共同活性化しない限り、細胞の開始の数はかなり増加した (例えば5 × 105 - 5 x 10 の6セル) および/または非常に具体的、効率的な抗体があります。それにもかかわらず、さらなる最適化と絶えず改善ライブラリの準備方法、我々 は限られた細胞材料からチップ seq をほとんど調節蛋白質の可能になることを見込んでいます。
私達のチップとチップ seq のプロトコルは、さまざまなヒストン修飾と萌芽期ティッシュの広範囲検証されている、高品質エピゲノム プロファイルの生成に不可欠であると考えていくつかの重要なステップを強調したいと思います。まず、萌芽期のサンプルは新鮮なクロマチンの整合性を妥協しない条件下で分離する必要があります。十分な材料が蓄積されるまで、寒さの条件又はフラッシュ凍結標本の解剖を実行するが含まれます。もう一つの重要なステップは、超音波処理は、正確に高品質のチップを実行するように最適化する必要があります。最適な超音波処理条件よく、組織の種類によって異なります、組織、または使用されている超音波発生装置の量。最後になりましたが、成功したチップは最終的に特定および興味の蛋白質抗体チップ互換の可用性に依存します。
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Disclosures
著者には、開示すること、競合する金銭的な利益はありません。
Acknowledgments
著者は、このプロトコルの確立の間に彼の優秀なテクニカル サポート 1 月アペルをありがとうございます。Rada イグレシアス研究室で作業に支えられて CMMC 学内資金、DFG 研究助成 (RA 2547/1-1、RA 2547/2-1、および TE 1007/3-1)、カタルーニャ ・ オープン大学上級研究員グループ Grant、および CECAD グラント。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
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