Summary
Her, beskriver vi en kromatin immunoprecipitation (ChIP) og ChIP-seq bibliotek forberedelse protokol til at generere globale epigenomiske profiler fra lav-overflod kylling embryonale prøver.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en meget udbredt teknik til kortlægning af lokalisering af post-translationally modificerede histoner, Histon varianter, transkriptionsfaktorer eller ændring af kromatin enzymer i en given locus eller på en genome-wide skala. Kombinationen af ChIP assays med næste generation sequencing (dvs., ChIP-FF.) er en kraftfuld tilgang til globalt afdække gen regulerende net og at forbedre den funktionelle anmærkning af genomer, især ikke-kodende regulerende sekvenser. ChIP protokoller kræve normalt store mængder af cellulære materiale, således udelukker anvendeligheden af denne metode til at undersøge sjældne celletyper eller lille væv biopsier. For at gøre ChIP assay kompatibel med mængden af biologisk materiale, der kan typisk fås i vivo under tidlige hvirveldyr embryogenese, vi beskriver her en forenklet ChIP protokol, hvor antallet af trin kræves for at fuldføre den analysen var reduceret for at minimere prøve tab. Denne ChIP protokollen har held været anvendt til at undersøge forskellige Histon ændringer i forskellige embryonale kylling og voksen mus væv ved hjælp af lav til medium celle numre (5 x 104 - 5 x 105 celler). Vigtigst, denne protokol er kompatibel med ChIP-seq teknologi ved hjælp af standard biblioteket præparationsmetoder, hvilket giver global epigenomiske kort i yderst relevant embryonale væv.
Introduction
Histon posttranslationelle modifikationer er direkte involveret i forskellige kromatin-afhængige processer, herunder transskription, replikering og DNA reparation1,2,3. Desuden forskellige Histon ændringer viser positive (fx H3K4me3 og H3K27ac) eller negativ (f.eks. H3K9me3 og H3K27me3) korrelationer med genekspression og kan defineres bredt som aktiverende eller undertrykkende Histon markerer, henholdsvis2,3. Derfor, globale Histon ændring kort, også benævnt epigenomiske kort, er dukket op som stærke og universel værktøj funktionelt anmærke hvirveldyr genomer4,5. Eksempelvis distale regulerende sekvenser som smagsforstærkere kan identificeres baseret på tilstedeværelsen af specifikke kromatin signaturer (f.eks. aktive smagsforstærkere: H3K4me1 og H3K27ac), som adskiller dem fra proksimale promotor regioner (f.eks. aktive initiativtagere: H3K4me3)6,7,8. På den anden side findes gener med store celle identitet regulering funktioner typisk med bred kromatin domæner mærket med H3K4me3 eller H3K27me3, afhængigt af de underliggende gener, transcriptionally aktive eller inaktive status henholdsvis9 ,10. Ligeledes synes udtryk for store celle identitet gener skal kontrolleres ofte af flere og rumligt grupperet smagsforstærkere (dvs., super-forstærkere), der kan identificeres som brede H3K27ac-mærkede domæner11.
I øjeblikket genereres Histon ændring maps ved hjælp af ChIP-seq teknologi, som i forhold til tidligere metoder såsom ChIP-chip (ChIP koblet til microarrays) giver højere opløsning, færre artefakter, mindre støj, større dækning og lavere koster12. Generation af epigenomiske kort med ChIP-seq teknologi har ikke desto mindre, dens iboende begrænsninger, for det meste forbundet med kapacitet til at fuldføre ChIP i prøver af interesse. Traditionelle ChIP protokoller kræves typisk millioner af celler, hvor de grænseværdier for anvendelsen af denne metode til in vitro celle linjer eller celler der kan nemt være isoleret i vivo (f.eks. blod celler). I de sidste par år, har en række modificerede ChIP protokoller kompatibel med lav celle numre blevet beskrevet13,14,15,16. Men disse protokoller er specielt designet til at være sammen med next generation sequencing (dvs., ChIP-FF.), og de bruger typisk ad hoc- bibliotek forberedelse metoder13,14, 15 , 16.
Her, vi beskrevet en ChIP protokol, der kan bruges til at undersøge Histon ændring profiler ved hjælp af lav til mellemliggende celle numre (5 x 104 - 5 x 105 celler) på enten valgte loci (dvs., ChIP-qPCR) eller globalt (dvs. ChIP-seq) (figur 1). Når koblet til ChIP-seq teknologi, kan vores ChIP protokollen bruges sammen med standard biblioteket forberedelse metoder, således at gøre det bredt tilgængeligt for mange laboratorier10. Denne protokol er blevet brugt til at undersøge flere Histon mærker (f.eks. H3K4me3, H3K27me3 og H3K27ac) i forskellige kylling embryonale væv (f.eks, spinal neurale rør (SNT), frontonasal protuberanser og epiblast). Vi forventer dog, at det bør være bredt gælder for andre organismer, som biologisk og/eller klinisk relevante prøver kan kun fås i små mængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ifølge tysk dyrs pleje retningslinjer, ingen dyr institutionspleje og brug udvalg (IACUC) godkendelse var nødvendig for at udføre kylling embryo eksperimenter. Ifølge de lokale retningslinjer kræver kun eksperimenter med kylling HH44 (18-dag) embryoner og ældre IACUC godkendelse. Embryoner bruges i denne undersøgelse var imidlertid alt i tidligere stadier af embryoets udvikling (dvs. HH19 (72 h)).
Bemærk: Formålet med denne protokol er at give en detaljeret beskrivelse af ChIP assay, så det effektivt kan kombineres med qPCR eller næste generation sequencing (dvs., ChIP-FF.) at undersøge Histon ændringer i lav-overflod embryonale prøver (lige fra 5 x 10 4-5 x 10 5 celler for hver ChIP reaktion) og forskellige vævstyper ( figur 1). Protokollen skal være relevant at undersøge de bindende profiler af transkriptionsfaktorer og co aktivatorer (fx p300). Men på grund af den lavere overflod af disse regulerende proteiner, større celle tal er sandsynligvis være påkrævet (5 x 10 5 - 5 x 10 6 celler for hver ChIP reaktion).
1. forberedelse af æg og Microdissection af kylling SNT
Bemærk: proceduren for microdissections teknisk adskiller sig fra væv til væv og dyremodel til dyremodel. Dette afsnit beskriver i detaljer dissektion-protokollen bruges til at få brachialis SNT sektioner fra fase-HH19 kylling embryoner som eksempel.
- Inkuberes frugtbare hvid Livorno hønseæg, fremstillet af en lokal ynglefugl i vandret orientering ved 37 ° C og 80% luftfugtighed i 3 dage at få fase-HH19 kylling embryoner.
- Afgøre stadier ifølge Hamburger og Hamilton kylling embryonale udviklingsmæssige staging system 17.
- Udføre alle microdissections under kolde betingelser; ellers kromatin integritet kan blive kompromitteret.
- Isolere HH19 embryoner.
- For at gøre embryonerne tilgængelige, uddrag 3 mL af albumin ved hjælp af en 10-mL sprøjte med en nål (0,90 x 40 mm) til at sænke blastoderm.
- Gør en lille åbning i ægget ved hjælp af fine saks og tilsættes 1 mL Locke (Se Supplerende materialer til opskriften) at lette fjernelsen af ekstra embryonale membraner.
- Indsprøjtes 10% indiske sort blæk/Locke løsning ved hjælp af en 1-mL sprøjte med en nål (0,55 x 25 mm 2) under blastoderm lette visualisering af embryonerne.
- Afbrød den ekstra embryonale membran, der omgiver fosteret ved hjælp af medicinsk kirurgiske fine saks og pincet.
- Bruge en perforeret ske for at overføre embryonet til et 4,5 cm petriskål indeholdende 20 mL af 1 x PBS løsning.
- Dissekere væk dyr og de resterende dele af ekstra embryonale membran ved hjælp af fine saks og pincet under et stereomikroskop.
- Skære den tværgående SNT segment på brachialis niveau af embryonet, udvide caudally til thorax regionen at isolere SNT ( figur 2).
- Fjerner væv, der omgiver sideværts/ventrally SNT (fx laterale plade mesoderm, ectoderm, notochord og aorta) ved hjælp af pincet ( figur 2).
- Fordybe hver dissekeret kylling SNT segment i en 3,5 cm petriskål der indeholder 5 mL varm (37 ° C) trypsin (Trypsin/EDTA løsning 1:250).
- Stoppe trypsin behandling når lempelse af de ikke-neurale væv omkring SNT registreres under et stereomikroskop.
Bemærk: Trypsinization tid skal styres stramt at undgå overdreven fordøjelse og spredning af neurale væv og bevare den strukturelle integritet af SNT. - Efter trypsin behandling, fjerne de resterende mesenchymale og ectodermal væv manuelt for at forberede afsnittet ren SNT.
- Overføre afsnittet SNT til en 1,5 mL tube og flash-fryse det i flydende kvælstof. Endnu en tilstrækkelig SNT sektioner er akkumulerede (pool SNT sektioner fra ~ 30 kylling embryoner for én ChIP reaktion), opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Hvis tilstrækkelige embryonale væv (dvs. 5 x 10 5-5 x 10 6 celler) kan blive dissekeret fra en enkelt eller et par kylling embryoner, derefter frysning er ikke nødvendig og det er muligt at fortsætte direkte til de næste trin. Der henvises til fejlfindingsvejledning i tabel 1.
Bemærk: advarsel! Flydende kvælstof har en meget lav temperatur, bære passende beskyttelse.
2. Crosslinking proteiner til DNA: dag 1
Bemærk: udføre alle trinene på is, medmindre andet er angivet.
- Tilføje 500 µL af DMEM med 10% FBS og 10 µL 1 M Na-butyrat direkte til den frosne væv eller, alternativt, straks til den frisk dissekeret væv. Homogeniseres cellerne ved at suspendere igen forsigtigt med en 1 mL pipette.
Bemærk: Tilsætning af Na-butyrat er valgfrit, men anbefales hvis undersøge Histon acetylation. I stedet for DMEM - 10% FBS, kan prøver være genopslemmes i 1 x PBS med 0,1% BSA. Tilføjelsen af FBS eller BSA er valgfri, men det letter pelleringsmidler prøver i de efterfølgende centrifugering trin. - Tilføje 13,5 µL af 37% formaldehyd (1% formaldehyd endelig) og placere den på en rotator i 15 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: advarsel! Formaldehyd er giftige. - Tilføje 25 µL af 2,5 M Glycin til røret og placere den på en rotator i 10 min. ved stuetemperatur til at slukke formaldehyd.
- Spinde tube på 850 x g i 5 min. ved 4 ° C i en tabel-top centrifuge. Supernatanten.
- Vaske pellet engang med 500 µL af kolde frisklavede wash buffer (Se Supplerende materialer til opskriften), centrifuge på 850 x g og 4 ° C i 5 min, og supernatanten.
3. Lysis og ultralydbehandling
- Forbered komplet lysis buffer (LB) (Se Supplerende materialer til opskriften) og chill på is. Til 1 mL, bruge 950 µL af LB, 40 µL af protease hæmmer koncentrat (25 x) og 10 µL af 100% PMSF.
- Resuspenderes i 300 µL af komplet LB af pipettering og placere den på en vuggende platform i 10 min. ved 4 ° C.
- Sonikeres prøver ved hjælp af følgende indstillinger: Temp = 4 ° C, samlet tid = 7 minutter, “ på ” interval = 30 s, “ off ” interval = 30 s, amplitude = 25%
Bemærk: Sonikering betingelser skal optimeres for hvert væv og vil variere afhængigt af sonikator anvendes. Det anbefales at bruge de laveste sonikering indstillinger, der resulterer i afrevne DNA spænder fra 200 til 600 bp i størrelse. Klipning varierer meget afhængigt af vævstype, quantiTy, ultralydbehandling volumen, crosslinking betingelser og udstyr. Der henvises til fejlfindingsvejledning i tabel 1. - Spinde sonicated prøven på 16.000 x g i 10 min. ved 4 ° C at sammenpresse den celleaffald.
- Overføre lysate (supernatanten) til en frisk 1,5 mL tube.
Bemærk: Hvis udgangsmaterialet er anses for tilstrækkelig til to ChIP eksperimenter, derefter 300 µL af komplet LB kan føjes til den sonicated kromatin (dvs. endelige rumfang: 600 µL). - Tilføje 30 µL af 10% octylphenol nonylphenolethoxylat for hver 300 µL af sonicated lysate (endelig koncentration: 1%) og blandes ved pipettering.
Bemærk: advarsel! Octylphenol nonylphenolethoxylat er akut giftige (oral, dermal, indånding).
4. Antistof inkubation
- delprøve 330 µL af sonicated lysate i to 1,5 mL rør: 300 µL for ChIP og 30 µL som input kontrol (10% af udgangsmaterialet). Butik i " 30 µL input kontrolprøve " på -20 ° C.
Bemærk: Hvis to ChIP reaktioner er udført fra den samme prøve, så den 660 µL af sonicated lysate kan være fordelt på tre 1,5 mL reagensglas (300 µL til ChIP #1, 300 µL til ChIP #2 og 60 µL som input kontrol (20% af råvaren af hver ChIP) ). - Tilføje 3-5 µg antistof til de 300 µL af sonicated kromatin alikvot og inverter på Bland.
Bemærk: I denne undersøgelse, hver ChIP reaktion blev udført med et antistof, der er specifikke for Histon H3 tri methylerede på K4 (H3K4me3), Histon H3 di methylerede på K4 (H3K4me2), Histon H3 tri methylerede på K27 (H3K27me3), og Histon H3 tri acetylation på K27 (H3K27me3). Succes i denne protokol er helt afhængig af kvaliteten af antistof anvendes. Antistoffet skal være specifik og effektiv på immunoprecipitation af et specifikt protein. Det er vigtigt at fastslå størrelsen af antistof, der kan bruges til at immunoprecipitate crosslinked protein-DNA komplekse. Også, specificitet af antistoffet kan kontrolleres af vestlige skamplet at sikre, at den registrerer den korrekte protein. Et antistof, der registrerer flere uspecifik bands er ikke anbefalet til ChIP. - Placere røret på en vuggende platform ved 4 ° C natten over (12-16 h) til at binde antistoffet til kromatin.
Bemærk: Der henvises til fejlfindingsvejledning i tabel 1.
5. Forberedelse af magnetiske perler: dag 2
- alikvot 50 - 100 µL af Protein G/magnetisk bead gylle for hver ChIP reaktion i en 1,5 mL mikrofuge tube på ice.
- Vaske de magnetiske perler tre gange med koldt blok løsning (Se Supplerende materialer til opskriften) (4 ° C). Tilføje 500 µL koldt blok løsning og mix af invertere eller svippede. Lægge røret i en magnetiske indehaveren og vente på perler til at bosætte sig på siden af røret. Hæld den klare væske og Gentag. Efter den sidste vask, fjerne alle væske med en gel-loading spids.
6. Immunoprecipitation af kromatin
- tilføje antistof-bundet kromatin 300 µL til vasket perlerne og vend for at blande.
- Rotér lodret på en tube rotator ved 4 ° C i mindst 4 h at binde antistoffet til perlerne.
7. Vask, elueres og vende krydsbindinger
- Chill RIPA Wash Buffer (Se Supplerende materialer til opskriften) på is, angivet i vandbad til 65 ° C, og precool centrifuge til 4 ° C.
- Vaske kromatin-bundet perler fire gange i 1 mL koldt RIPA Wash Buffer og holde på is. For at gøre det, der tilsættes 1 mL af kolde RIPA Wash Buffer og mix af invertere eller svippede. Glasset anbringes i den magnetiske indehaveren og vente på perler til at bosætte sig på siden af røret. Hæld den klare væske og Gentag.
Bemærk: Antallet af vasker med RIPA Wash Buffer måske nødt til at være optimeret afhængigt af prøvetype, prøve overflod og antistof bliver brugt. Et øget antal vasker vil mindske baggrunden men vil også mindske den samlede gendannede DNA, der kan kompromittere downstream analyse af qPCR eller ChIP-FF. - Tilsættes 1 mL af TE/50 mM NaCl til røret og overføre kromatin-bundet perler i TE/50 mM NaCl til en frisk 1,5 mL mikrofuge tube før at fjerne væsken ved hjælp af magnetiske indehaveren, som beskrevet ovenfor.
- Spinde perler på 900 x g i 3 min. ved 4 ° C, placere røret tilbage i den magnetiske indehaveren og fjerne alle de resterende TE med en gel-loading spids.
- Tilføje 210 µL af eluering buffer (Se Supplerende materialer til opskriften) ved stuetemperatur og resuspend ved at svippe.
- Elute i 15 min. ved 65 ° C i en varme blok under omrystning.
- Spinde perler på 16.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur og Læg røret i magnetiske indehaveren.
- Overføre supernatanten (~ 200 µL) til en frisk mikrofuge tube Når perlerne har afgjort.
- Tø input kontrolprøver (30 µL) fra-20 ° C til stuetemperatur (frosne taktfast 4.1), tilføje 3 bind af eluering buffer (90 µL) og blandes ved kortvarigt vortexing.
- Ruger chip og kontrol prøverne på 65 ° C natten over (12-16 h) at vende krydsbindinger.
8. Digest cellulære proteiner og RNA: dag 3
- 8.1At stuetemperatur, tilsættes 1 mængde af TE buffer pr tube (til at fortynde SDS) og vend for at blande: tilføje 120 µL af TE til 120 µL af kontrolprøve og 200 µL af TE til 200 µL af ChIP prøven.
- Tilføje RNase A til 0,2 mg/mL slutkoncentration og inverter til mix: tilføje 2,4 µL af 20 mg/mL RNase A til 240 µL af kontrolprøve og 4 µL af 20 mg/mL RNase A til 400 µL af ChIP prøven.
- Ruger rør ved 37 ° C i et vandbad i 2 timer at fordøje RNA.
- Tilføje Proteinase K til en endelig koncentration på 0,2 mg/mL og inverter til mix: tilføje 2,4 µL af 20 mg/mL Proteinase K til 240 µL af kontrolprøve og 4 µL af 20 mg/mL Proteinase K til 400 µL af ChIP prøven.
- Incubate ved 55 ° C i et vandbad i 2 timer at fordøje protein og rense DNA.
9. ChIP-qPCR
Bemærk: udføre DNA-ekstraktion og oprensning, som beskrevet i de Supplerende materialer.
Bemærk: verificere sonikering effektivitet, som er beskrevet i den Supplerende materialer, at bekræfte, at 200-500 bp DNA fragmenter er opnået ( figur 3).
Bemærk: en kritisk trin er at bestemme, hvis chippen faktisk arbejdede. Hvis der er kendte genomisk bindingssteder for protein af interesse, kan primere være konstrueret til kvantitativ PCR (qPCR) til at bestemme, hvis de kendte steder specielt er beriget med ChIP DNA, sammenlignet med negative-kontrol regioner ikke forventes at være bundet af candidato proteiner. Som et eksempel, dette arbejde viser ChIP-qPCR resultaterne med ChIPs udføres for H3K4me3 (aktive promotor Histon mark) og H3K27me3 (inaktive promotor Histon mark) i SNT sektioner isoleret fra HH14 chick embryoner ( figur 4A ).
- Mix hver primer par (forward og reverse) i det samme rør og forberede en stock koncentration på 20 µM hver med dH 2 O (tabel 2).
Bemærk: effektiviteten af hver primer par bør evalueres før ChIP-qPCR analyse. - Bruge ChIP og 20% input kontrol DNA fremstillet i skridt 8,5 for qPCR optimering.
Bemærk: Input DNA er typisk fortyndet 20 x (til 1% af råvaren bruges i ChIP reaktioner) for qPCR analyse. - For hver 10 µL PCR, bland følgende komponenter i et PCR rør: for DNA mastermix, tilføje 2 µL af dH2O, 2,5 µL SYBR green-mix og 1 µL af DNA (fra ChIP eller 1% input); for mastermix med primere , tilføje 2.375 µL af dH2O, 2,5 µL af SYBR green mix og 0,125 µL af forward og reverse primer mix.
- Bland prøver af vortexing for 2 s og kortvarigt centrifugeres ved 900 x g i 1 min.
- Udføre real-time PCR (et eksempel af primere og cykling betingelser anvendes her kan findes i tabel 2 og tabel 3, henholdsvis).
Bemærk: ChIP-qPCR dataanalyse: ChIP signaler er beregnet som procent af input. Kort, når Ct værdier er fremstillet for hver qPCR reaktion, en fortyndingsfaktoren af 100 eller 6.644 cyklusser (log2 af 100) anvendes til Ct-værdier opnået til input DNA reaktioner. Derefter, for en given region af interesse (dvs. primer par), ChIP signaler beregnes som følger:
justeret input = Ct (Input) - 6.644
ChIP signal = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. chIP-seq bibliotek forberedelse; Ende reparation: Dag 4
- fortyndes op til 100 ng af ChIP-DNA i 60 µL af eluering buffer (Se materialer tabel).
- Tilføje 40 μL af slutningen reparere mix og afpipetteres forsigtigt 10 gange.
- Incubate ved 30 ° C i 30 min på en termisk cycler.
- Vortex den magnetiske perler og tilføje 160 μL til rør indeholdende slutningen reparation mix. Blandes grundigt ved pipettering 10 gange. Inkuber 15 min ved stuetemperatur.
- Glasset anbringes i den magnetiske indehaveren og vente på perler til at bosætte sig på siden af røret...
- Hæld den klare væske.
- Samtidig med at røret på den magnetiske indehaveren, tilføje 200 μl af frisklavede 80% EtOH.
- Incubate ved stuetemperatur til 30 s og kassér supernatanten. Gentag én gang..
- Holde røret for 15 min på den magnetiske indehaveren ved stuetemperatur. Når pelleten er tørt, fjerner røret fra magnetiske indehaveren.
- Resuspenderes i 20 μL af resuspension buffer. Forsigtigt afpipetteres 10 gange til blandes grundigt.
- Incubate i 2 min. ved stuetemperatur.
- Røret anbringes i den magnetiske indehaveren og vente på perler til at bosætte sig på siden af røret. 17,5 μL af supernatanten overføres til en ny tube.
11. ChIP-seq bibliotek forberedelse; Adenylate 3 ' slutter
- tilføje 12,5 μl af A-hale mix til den nye rør og blandes grundigt ved forsigtigt pipettering op og ned 10 gange. Røret anbringes på en termisk cycler og inkuberes efter følgende program: 37 ° C i 30 min, 70 ° C i 5 min og hold ved 4 ° C
12. ChIP-seq bibliotek forberedelse; Ligate adaptere
- tilføje 2.5 μL af resuspension buffer, 2,5 μL af ligatur mix og 2,5 μL af passende RNA adapter indekset. Blandes grundigt ved forsigtigt pipettering op og ned 10 gange.
- Incubate på en termisk cycler i 10 min på 30 °.
- Tilføje 5 μl af stop ligatur buffer og blandes grundigt ved pipettering 10 gange.
- Vortex den magnetiske perler og tilføje 42,5 μL til prøven. Blandes grundigt ved pipettering 10 gange. Inkuber 15 min ved stuetemperatur.
- Glasset anbringes i den magnetiske indehaveren og vente på perler til at bosætte sig på siden af røret og hæld den klare væske
- Samtidig med at røret på den magnetiske indehaveren, tilføje 200 μl af frisklavede 80% EtOH.
- Incubate ved stuetemperatur til 30 s og kassér supernatanten. Gentag engang.
- Holde røret på den magnetiske indehaveren og lad prøven blive tør til 15 min..
- Fjerne røret fra magnetiske indehaveren og resuspenderes i 52,5 μL af resuspension buffer. Blandes grundigt ved pipettering 10 gange. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min., Læg røret i magnetiske indehaveren og vente på perler at bosætte sig på siden af røret. Overføre 50 μL supernatant, klar til en ny tube.
- Vortex den magnetiske perler og der tilsættes 50 μl til prøven. Blandes grundigt ved pipettering 10 gange. Inkuber 15 min ved stuetemperatur.
- Røret anbringes i den magnetiske indehaveren og vente på perler til at bosætte sig på siden af røret og hæld den klare væske.
- Samtidig med at røret på den magnetiske indehaveren, tilføje 200 μl af frisklavede 80% EtOH.
- Incubate ved stuetemperatur til 30 s og kassér supernatanten. Gentag engang.
- Holde røret på den magnetiske indehaveren og lad prøven lufttørre i 15 min.
- Fjerne røret fra magnetiske indehaveren og resuspenderes i 27,5 μL af resuspension buffer. Blandes grundigt ved pipettering 10 gange.
- Incubate ved stuetemperatur i 2 min., Læg røret i magnetiske indehaveren og vente på perler til at bosætte sig på siden af røret. Overføre 25 μL supernatant, klar til en ny tube.
13. ChIP-seq bibliotek forberedelse; Forstærkning af DNA-fragmenter
- sted 12,5 µL af skabelonen i en 0,2 mL PCR rør. Tilføje 2,5 μl PCR primer cocktail, 10 μL af forbedrede PCR mix. Bland grundigt af pipettering op og ned 10 gange. Røret anbringes på en termisk cycler og bruge de betingelser, der er beskrevet i tabel 4.
- Vortex den magnetiske perler og tilsættes 25 μL til prøven. Blandes grundigt ved pipettering 10 gange. Inkuber 15 min ved stuetemperatur.
- Røret anbringes i den magnetiske indehaveren, vente på perler til at bosætte sig på siden af røret og hæld den klare væske.
- Samtidig med at røret på den magnetiske indehaveren, tilføje 200 μl af frisklavede 80% EtOH. Inkuber ved stuetemperatur til 30 s og kassér supernatanten. Gentag engang.
- Holde røret på magnetiske indehaveren, og lad den prøve luft tørre for 15 min. Fjern røret fra magnetiske indehaveren og resuspenderes i 32,5 μL af resuspension buffer. Blandes grundigt ved pipettering 10 gange.
- Ruger PCR rør/plade i 2 min. ved stuetemperatur. PCR rør/pladen anbringes på den magnetiske stå ved stuetemperatur, vente på perler til at bosætte sig på siden af røret og 30 μL af supernatanten overføres til en ny tube.
14. ChIP-seq bibliotek forberedelse; Biblioteket Validation
NOTE: validering af biblioteket udføres ved hjælp af en DNA og RNA kvalitetskontrol system. Forberedelse af stigen: alikvot 1 µL af genomisk DNA Ladder første tube/godt, og tilsæt 3 µL af prøvebuffer.
- Forberedelse af prøven: Bland 1 µL af bibliotek prøven (10-100 ng/µL) med 3 µL af prøvebuffer i et rør. Spin ned og derefter vortex på maksimal hastighed for 5 s. Spin ned for at placere prøven i bunden af røret.
- Indlæse prøverne i den kvalitetskontrolsystem.
- Når kørslen er færdig, analysere resultaterne ved at indstille kontrasten til den maksimale værdi for at sikre ingen primer dimerer er til stede i prøven ( figur 5); primer dimerer skal svare på et band omkring 135 bp. Hvis selv en svag band er til stede, så gå til en anden oprydning ved at tilføje eluering buffer (Se Materialer tabel) op til en 50 µL volumen og tilføje 47,5 µL af de blandede magnetiske perler. Hvis koncentrationen af prøven er for lav (< 2 nM), fortsætte med at køre PCR (trin 13.1), ved hjælp af 18 cykler i stedet for 15, med 12,5 µL volumen af prøven tilbage fra trin 12.16.
- Kvantificere bibliotekerne individuelt af qPCR ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits.
Bemærk: Puljer af biblioteker kan blive sekventeret ved hjælp af en sequencer med en single-Læs af 1 x 50 nt protokol med sigte på 30 M læser/prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere udførelsen af vores ChIP protokol, udførte vi ChIP-seq eksperimenter ved hjælp af poolede SNT sektioner fra HH19 kylling embryoner, maxillary protuberanser af HH22 kylling embryoner, og fase-HH3 kylling embryoner til at undersøge de bindende profiler af forskellige Histon ændringer (dvs., H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 og H3K27me3). Når ChIP DNAs blev opnået, blev ultralydbehandling effektivitet evalueret ved agarosegelelektroforese gelelektroforese af de tilsvarende input DNAs (figur 3). Derefter, ChIP og input DNAs blev brugt til ChIP-qPCR analyser til at måle enrichments på loci forventes at være enten bundet eller ubundet af de undersøgte Histon ændringer (figur 4A). I eksemplet vist i figur 4A, H3K27me3 og H3K4me3 berigelse blev niveauer i HH19 SNT sektioner evalueret af ChIP-qPCR omkring regionerne promotor af SOX17 og SOX2, to gener, der er inaktive og aktive i SNT, henholdsvis. Som forventet, var SOX2 initiativtageren stærkt præget af H3K4me3, men ikke af H3K27me3, mens SOX17 promotor viste det modsatte mønster (figur 4A). Ved at evaluere et par loci, er det muligt at vurdere kvaliteten af chippen uden at miste meget DNA materiale for downstream ChIP-seq analyse. Når kvaliteten af ChIPs blev bekræftet, var ChIP-seq biblioteker udarbejdet og sekventeret. Repræsentative loci er vist for hvert af de undersøgte kylling embryonale væv: (i) profiler for H3K27me3 og H3K4me3 i SNT af HH19 chick embryoner omkring PAX7 (figur 4B); (ii) profiler for H3K4me2 og H3K27ac i de maxillary protuberanser af HH22 kylling embryoner omkring SNAI1 (fig. 4 c); og (iii) profil for H3K27me3 i HH3-fase kylling embryoner omkring TBX3/TBX5 locus (figur 4D). Disse ChIP-seq eksperimenter illustrerer, at vores ChIP protokol kan bruges til at generere epigenomiske profiler fra begrænsede mængder af biologisk materiale i en bred vifte af embryonale væv.
Figur 1: skematisk oversigt over ChIP protokol for lav-overflod embryonale prøver isoleret fra kylling embryoner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kort oversigt over SNT Microdissection protokol. Den tværgående SNT segment er afskåret på en HH19 kylling embryo brachialis niveau. Efter trypsin behandling fjernes den ikke-neurale væv mekanisk ved hjælp af pincet. Ikke, notochord; SNT, spinal neuralrøret; og så, somite. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempel på Optimal sonikering. En kylling SNT HH19 prøve var sonicated til 11 cykler, med 30 s ON og 45 s OFF pulser på "høj" amplitude ved hjælp af en sonikator. Krydsbindinger blev vendt og renset DNA blev løst på en 1,5% agarosegel. Den optimale fragment størrelse er observeret efter 11 cyklusser, spænder fra 200-500 bp. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative eksempler på ChIP analyse af ChIP-qPCR eller ChIP-FF. (A) H3K27me3 (venstre) og H3K4me3 (til højre) niveauer på de angivne regioner blev målt ved ChIP-qPCR analyse udføres ved hjælp af SNT sektioner isoleret fra HH19 chick embryoner. SOX2 promotor-regionen er aktive i SNT og er dermed præget af H3K4me3, men ikke af H3K27me3; SOX17 promotor-regionen er inaktive i SNT og er derfor beriget i H3K27me3 men ikke i H3K4me3; Chr6 Neg repræsenterer en intergenic region i kylling kromosom 6 og fungerer som en negativ kontrol. Fejllinjer udgør standardafvigelsen fra tre tekniske replikater. (B) ChIP-seq (H3K27me3 i magenta, H3K4me3 i blå og input i rød) profiler fra SNTs af HH14 chick embryoner er vist omkring PAX7 locus. (C) ChIP-seq (H3K4me2 i orange, H3K27ac i grøn, og input i rød) profiler fra de maxillary protuberanser af HH22 chick embryoner er vist omkring SNAI1 locus. (D) ChIP-seq (H3K27me3 i magenta) og input i rød profiler fra HH3 chick embryoner er vist omkring TBX3/TBX5 locus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: eksempel på ChIP-seq bibliotek validering ved hjælp af automatiseret RNA kvalitetskontrol System. De samme ChIP-seq biblioteker blev analyseret med den automatiserede RNA kvalitetskontrol system før (A) og efter (B) primer dimer oprydning. Primer dimerer kan ses som en svag ~ 135 bp band i (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Problem | Mulig årsag | Løsning |
| 1,2,3,4 5 og 11 | Lav ChIP signal til støj forhold ifølge ChIP-qPCR og/eller ChIP-seq | Vævet kvalitet kompromitteret. | Udføre mikro-dissektioner i kulde; ellers kunne blive kompromitteret kromatin integritet. |
| Prøven tab efter centrifugering af crosslinked prøver. | Bruge DMEM medium med 10-20% serum eller gentage centrifugering skridt og øge tid til 10 min. | ||
| Cross-Linking varighed. | Optimere crosslinking tid. Øget crosslinking gange kan lette afsløringen af visse proteiner, såsom Co aktivatorer og co repressors, der ikke binde til DNA direkte. | ||
| Prøven tab på grund af flere vasker i PBS. | Reducere antallet af vasker; centrifugering trin kan gentages på 1.500 x g. | ||
| Suboptimal sonikering resulterer i enten for langt eller for kort DNA størrelser. | Udføre en gang kursus eksperiment for at optimere sonikering betingelser. Optimal fragment størrelser spænder fra 200 til 500 bp | ||
| Antistof ikke egnet til ChIP. | Bruge et andet antistof mod den endogene protein eller et antistof mod et tag tilføjes et eksogent udtrykte proteiner (fx Flag, HA). | ||
| 12 | Lav eller ingen signaler i qPCR, selv for input DNA | Suboptimal primere | Kontrollere primer effektiviteten og specificiteten; design nye primere. |
| Utilstrækkelig mængde af DNA | Ikke nok råvare. Øge mængden af DNA anvendes pr. qPCR reaktion. |
| Primere | Sekvens |
| SOX2-F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
| SOX2-R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
| SOX17-F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
| SOX17-R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
| Chr6-neg-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
| Chr6-neg-Rasmussen | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
Tabel 2: Primer sekvenser for ChIP-qPCR.
| Preincubation | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 5 min | |
| Forstærkning | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 10 s | |
| 60 ° C | 10 s | 45 |
| 72 ° C | 10 s | Cykler |
| Smeltende kurve | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 5 s | |
| 65 ° C | 1 min | |
| Køling | ||
| 40 ° C | 30 s | |
Tabel 3: PCR betingelser for ChIP-qPCR.
| Indledende denaturering | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 3 min | |
| Forstærkning | ||
| Temperatur | Tid | |
| 98 ° C | 20 s | |
| 60 ° C | 15 s | 15 |
| 72 ° C | 30 s | Cykler |
| Endelige udvidelse | ||
| Temperatur | Tid | |
| 72 ° C | 5 s | |
| Køling | ||
| 4 ° C | hold | |
Tabel 4: PCR betingelser for forstærkning af DNA-fragmenter i ChIP-seq bibliotek forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epigenomiske profilering af Histon ændring ved hjælp af ChIP-seq kan bruges til at forbedre den funktionelle anmærkning af hvirveldyr genomer i forskellige cellulære sammenhænge4,5,18. Disse epigenomiske profiler kan blandt andet bruges til at identificere enhancer elementer, til at definere den regulerende stat af smagsforstærkere (dvs. aktiv, primet, eller klar) og definere store celle identitet reguleringsmyndigheder i forskellige biologiske eller patologisk sammenhænge (fx, brede H3K4me3 promotor domæner og super-smagsforstærkere)6,7,9,10,11,19. Men på grund af den iboende begrænsning af ChIP-analysen, som typisk kræver millioner af celler, de fleste Histon ændring profiler er blevet genereret i in vitro- cellelinjer og celle typer, der kan være sorteret i vivo i store mængder 4. senest har flere ChIP-seq protokoller er beskrevet, der er kompatible med ekstremt lav celle numre, dermed dramatisk udvide rækken af celletyper og væv i hvilke epigenomiske profiler, i princippet være genereret13 ,14,15,16. Disse nye ChIP-seq protokoller hver påberåbe sig specifikke ad hoc- bibliotek forberedelse metoder, der i det mindste i nogle tilfælde kræver ikke-standard udstyr og/eller reagenser14,15,16.
Her, beskriver vi en ChIP-protokollen, der arbejder med lav til mellemliggende celle numre (5 x 104 - 5 x 105 celler) fremstillet i vivo fra forskellige embryonale væv10. For at øge følsomheden af vores ChIP assays, har vi fjernet flere trin normalt anvendes under ChIP, såsom sekventielle celle og nukleare lysis, hvilket kan resultere i et fremadskridende tab af værdifulde materiale. Således, efter crosslinking, prøver behandles med en enkelt lysisbuffer og er efterfølgende sonicated for at minimere prøve tab. Vigtigere, er vores ChIP protokol kompatibel med qPCR analyse, således at den epigenomiske analyse af udvalgte loci af interesse. Vores ChIP-protokollen kan desuden kombineres med standard ChIP-seq bibliotek forberedelse metoder, således at være potentielt nyttige for de fleste laboratorier med adgang til næste generation sequencing technology.
ChIP og ChIP-seq protokoller kan bruges ikke kun til at undersøge de bindende profiler af Histon ændringer, men også at afdække bindingssteder af andre vigtige transcriptional regulatorer, såsom transkriptionsfaktorer og co aktivatorer (f.eks. P300 og CBP)20. Typisk, ChIPs (og ChIP-seq) for transskriptionsfaktorer og co aktivatorer, som ikke er så rigelige som histoner, kræver betydeligt mere råvare end ChIPs for Histon mærker. Således beskrives protokollen måske ikke nødvendigvis fungerer for de fleste transkriptionsfaktorer eller co aktivatorer medmindre antallet af starter celler er betydeligt øget (f.eks. 5 x 105 - 5 x 106 celler) og/eller meget specifikke og effektive antistoffer er tilgængelige. Ikke desto mindre, med yderligere optimering og hele tiden forbedre biblioteket forberedelse metoder, vi forventer, at ChIP-seq fra begrænset cellulære materiale bliver muligt for de fleste regulerede proteiner.
Selv om vores ChIP og ChIP-seq protokoller har valideret udstrakt grad for en bred vifte af Histon ændringer og embryonale væv, vil vi gerne fremhæve nogle vigtige skridt, som vi finder afgørende for at skabe høj kvalitet epigenomiske profiler. Først, de embryonale prøver skal være frisk isoleret under betingelser, der ikke på kompromis kromatin integritet. Disse omfatter udføre dissektioner under kolde betingelser eller flash-frysning poolede prøver, indtil tilstrækkeligt materiale opsamles. En anden kritisk trin er sonikering, som skal være præcist optimeret til at udføre høj kvalitet ChIPs. Optimal sonikering betingelser varierer ofte, afhængigt af det væv, mængden af væv eller sonikator bliver brugt. Sidst men ikke mindst, afhængig en vellykket ChIP i sidste ende af tilgængeligheden af specifikke og ChIP-kompatible antistoffer mod proteiner af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke nogen konkurrerende finansielle interesser skal offentliggøres.
Acknowledgments
Forfatterne takke Jan Appel for hans fremragende teknisk bistand under etableringen af denne protokol. Arbejde i Rada-Iglesias laboratorium er understøttet af CMMC murene finansiering, DFG forskningsbevillinger (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 og TE 1007/3-1), UoC avancerede forsker gruppe Grant og CECAD Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Kouzarides, T.
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al.
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
