Summary
여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (칩) post-translationally 수정된 히스톤, 히스톤 변형, 녹음 방송 요인, 또는 주어진된 장소에서 또는 게놈 넓은 규모로 chromatin 수정 효소의 지역화를 매핑하기 위한 널리 사용 기법입니다. 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 Seq) 칩 분석 실험의 조합 세계적으로 유전자 규제 네트워크를 폭로 하 고 특히 비 코딩 규제 시퀀스의 유전자의 기능 주석 개선 하기 강력한 접근 이다. 칩 프로토콜은 일반적으로 많은 양의 세포 소재, 따라서 희귀 세포 유형 또는 작은 조직 생 검 조사 하는 것이 방법의 적용 제외 필요 합니다. 칩 분석 결과 얻어질 수 있는 일반적으로 생체 내에서 초기 척추 embryogenesis 동안 생물 학적 물질의 양을와 호환을 위해 여기 있는 단계 수를 완료 하는 데 필요한 간단한 칩 프로토콜 설명 합니다 분석 결과 샘플 손실을 최소화 하기 위해 감소 했다. 이 칩 프로토콜은 다양 한 배아 닭고기와 성인 마우스 조직 낮은 중간 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀)를 사용 하 여 다른 히스톤 수정 조사를 성공적으로 사용 되었습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜은 표준 라이브러리 준비 방법을 사용 하 여 칩 seq 기술과 호환, 관련성이 높은 배아 조직에 지도 글로벌 epigenomic 제공.
Introduction
히스톤 포스트 번역 상 수정 녹음 방송, 복제 및 DNA 복구1,2,3를 포함 하 여 다양 한 chromatin 종속 프로세스에 직접 참여 하는. 또한, 다른 히스톤 수정 보여 긍정적인 (예를 들어, H3K4me3 및 H3K27ac) 또는 음수 (예를 들어, H3K9me3 및 H3K27me3) 유전자 발현 상관 관계 광범위 하 게 정의 될 수 있는 활성화 또는 억압 적인 히스톤 표시로 각각2,은3. 따라서, 글로벌 히스톤 수정 지도, epigenomic 지도 라고도 기능적으로 척 추가 있는 게놈4,5주석을 강력 하 고 보편적인 도구로 떠오르고 있다. 예를 들어 원심 규제 시퀀스와 같은 강화를 확인할 수 있습니다에 따라 특정 chromatin 서명의 존재 (예를 들어, 활성 강화: H3K4me1 및 H3K27ac)는 근 위 발기인 지구에서 그들을 구분 (예를 들어, 활성 발기인: H3K4me3)6,,78. 다른 한편으로, 정체성 규정 하는 주요한 세포 기능을 가진 유전자는 일반적으로 넓은 chromatin 도메인 기본 유전자의 transcriptionally 활성 또는 비활성 상태에 따라 H3K4me3 또는 H3K27me3, 각각 표시 된9 발견 ,10. 마찬가지로, 주요 셀 정체성 유전자의 표현을 자주 여러 고 공간적 제어를 클러스터 강화 (즉, 슈퍼 강화), 광범위 한 H3K27ac 표시 된 도메인11로 확인 될 수 있다 보인다.
현재, 히스톤 수정 지도 칩 (칩 microarrays 결합) 같은 이전 방법에 비해 더 적은 소음, 큰 범위, 및 낮은 적은 유물 높은 해상도 제공 하는 칩 seq 기술을 사용 하 여 생성 됩니다. 비용12. 그럼에도 불구 하 고, epigenomic 맵 칩 seq 기술을 사용 하 여 생성의 한계, 주로 관심의 샘플에서 칩을 성공적으로 수행 하는 능력을 연관 있다. 전통적인 칩 프로토콜은 일반적으로 수백만의 세포를 체 외에서 세포를이 방법의 적용 라인 또는 세포는 제한 쉽게 격리 수 vivo에서 (예를 들어, 혈액 세포) 필요 합니다. 지난 몇 년 동안, 여러 수정된 칩 프로토콜 낮은 셀 숫자와 호환 설명된13,14,,1516되었습니다. 그러나, 이러한 프로토콜은 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 seq)와 결합 하도록 특별히 설계 된 그리고 그들은 일반적으로 임시 라이브러리 준비 방법13,14, 를 사용 하 여 15 , 16.
여기, 우리는 히스톤 수정 프로필 중간에 낮은 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀)를 사용 하 여 조사 하는 데 사용할 수 있는 칩 프로토콜 설명 (즉, 칩 정량) 중 선택한 loci 또는 전역 (즉, 칩 seq) (그림 1). 칩 seq 기술 결합 때 우리의 칩 프로토콜 표준 라이브러리 준비 방법, 따라서 많은 실험실10에 광범위 하 게 액세스할 수 있도록 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 여러 히스톤 부호를 조사 하기 위해 사용 되었습니다 (예를 들어, H3K4me3, H3K27me3, 및 H3K27ac) 다른 닭 배아 조직 (예를 들어, 척추 신경 관 (SNT), frontonasal 굴지, 및 epiblast)에. 그러나, 우리는 그것은 다른 유기 체는 생물학적 및 임상 관련 샘플만 얻을 수 낮은 금액에 광범위 하 게 적용 해야 예상.
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Protocol
기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 승인이 독일 동물 보호 지침에 따라 닭 배아 실험을 수행 하는 데 필요한 했다. 로컬 지침에 따라 닭 HH44 (18 일) 배아와 이전 실험만 IACUC 승인이 필요합니다. 그러나,이 연구에 사용 된 배아 배아 개발의 초기 단계에서 모두 있었다 (즉, HH19 (72 h)).
참고:이 프로토콜의 목적에서 정량 또는 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 seq) 히스톤 수정 조사를 효과적으로 결합 될 수 있다 칩 분석 결과 대 한 자세한 설명을 제공 하는 낮은 풍부 배아 샘플 (5 x 10 4에서 배열-각 칩 반응에 대 한 5 x 10 5 셀) 및 다른 조직 유형 ( 그림 1). 프로토콜은 바인딩 프로필 녹음 방송 요인과 공동 활성 (예를 들어, p300)의 조사에 적용 해야 합니다. 그러나, 이러한 규제 단백질의 더 낮은 풍부 때문 큰 핸드폰 번호 필요 (5 x 10 5-각 칩 반응에 대 한 5 x 10 6 셀) 될 가능성이 있습니다.
1.의 달걀과 닭고기 SNT의 기정
참고: 조직에 조직에서 및 동물 모델을 동물 모델에서 microdissections에 대 한 절차는 기술적으로 다른. 이 섹션 해 부 프로토콜에서 가져오는 데 사용 상 완 SNT 섹션 단계 HH19 닭 배아 예를 들어 자세히 설명 합니다.
- 닭 배아 단계 HH19를 3 일 동안 37 ° C와 80% 습도에 가로 방향에서 현지 개종에서 가져온 비옥한 백색 레그 혼 닭이 달걀을 품 어.
- 햄버거와 해밀턴 단계 닭 배아 발달 준비 시스템 17 결정.
- 차가운 조건 하에서 모든 microdissections 수행; 그렇지 않으면, chromatin 무결성 노출 될 수 있습니다.
- HH19 배아 분리.
- 배아를 액세스할 수 있도록 하는 blastoderm 낮은 바늘 (0.90 x 40 m m)와 10 mL 주사기를 사용 하 여 알 부 민 3 mL 추출.
- 좋은 위를 사용 하 여 계란에 작은 개통을 확인 하 고 로크 솔루션의 1 mL을 추가 (제조 법에 대 한 보충 자료 참조) 여분 미 발달 세포 막의 제거를 촉진 하기 위하여.
- 배아의 시각화를 쉽게 하는 blastoderm에서 바늘 (0.55 x 25 m m 2) 1 mL 주사기를 사용 하 여 10% 인도 검정 잉크/로크 솔루션을 주입.
- 의료 수술 잘가 위 집게를 사용 하 여 태아를 둘러싸는 여분 미 발달 막 잘라.
- 구멍된 숟가락을 사용 하 여 4.5 cm 배양 접시 20 mL PBS 솔루션 x 1의를 포함 하는 배아를 전송.
- 는 amnion 및 좋은 시저 및 집게는 stereomicroscope에서 사용 하 여 여분 미 발달 막의 나머지 부분을 멀리 해 부.
- Caudally SNT ( 그림 2)을 흉부 지역으로 확장, 태아의 상 완 수준에서 가로 SNT 세그먼트를 잘라.
- 옆/ventrally SNT (예를 들어, 옆 격판덮개 mesoderm, ectoderm, notochord, 및 대동맥)를 둘러싸고 조직 제거 집게 ( 그림 2)를 사용 하 여.
- 3.5 cm 따뜻한 (37 ℃) 트립 신 (Trypsin/EDTA 솔루션 1: 250)의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에에서 각 해 부 치킨 SNT 세그먼트 몰입할.
- 트립 신 치료 중지는 stereomicroscope에서 감지 되는 SNT 주위 비 신경 조직의 완화.
참고: trypsinization 시간 긴밀 하 게 제어 해야-소화 및 신경 조직의 분산을 방지 하 고는 SNT의 구조적 무결성을 유지. - 트립 신 처리 후 나머지 엽 및 ectodermal 조직 준비 깨끗 한 SNT 섹션을 수동으로 제거.
- 전송 SNT 섹션 1.5 mL 튜브에와 플래시-액체 질소에서 그것은 동결. 일단 충분 한 SNT 섹션은 누적된 (풀 SNT 하나의 칩 반응 ~ 30 닭 배아에서 섹션)-80에 저장, ° c.
참고: 경우 충분 한 배아 조직 (즉, 5 x 10 5-5 x 10 6 셀) 단일 또는 몇 가지 닭 배아에서 해 부 수 어 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 다음 단계로 바로 진행 가능. 표 1에 있는 문제 해결 가이드를 참조 하십시오.
참고: 주의! 액체 질소는 매우 낮은 온도, 적절 한 보호 착용.
2. DNA에 교차 결합 시키는 단백질: 하루 1
참고: 달리 명시 하지 않는 한 얼음에 모든 단계를 수행.
- 10 %DMEM 추가 500 µ L FBS 및 10 µ L 1 M 나-낙 산 염 냉동된 조직에 직접의 또는, 양자 택일로, 갓 해 부 조직에 즉시. 다시 부드럽게 1 mL 피 펫으로 일시 중단 하 여 셀을 균질.
참고: 없음-낙 산 염의 추가 선택 사항 이지만 권장 histone acetylation 조사 하는 경우. DMEM-10 %FBS, 대신 0.1 %BSA 1 x PBS에 샘플을 resuspended 수 있습니다. FBS 또는 BSA의 추가 선택 사항 이지만 그것은 이후 원심 분리 단계에서 샘플 판 용이. - 37% 포름알데히드 (1% 포름알데히드 최종)의 13.5 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 회전에 그것을 배치.
참고: 주의! 포름알데히드는 독성이. - 튜브 2.5 M 글리신의 25 µ L을 추가 하 고는 포름알데히드를 풀기 위해 상 온에서 10 분 동안 회전에 그것을 배치.
- 탁상 원심 분리기에서 4 ° C에서 5 분 동안 850 x g에서 튜브를 회전합니다. 삭제는 상쾌한.
- 감기 500 µ L 한번 펠 릿을 세척 갓된 씻어 850 g x 5 분, 4 ° C에서 원심 분리기 (제조 법에 대 한 보충 자료 참조)를 버퍼링 하 고는 상쾌한 삭제.
3. 세포의 용 해 및 쥡니다
- 준비 완전 한 세포의 용 해 버퍼 (파운드) (제조 법에 대 한 보충 자료 참조)와 얼음에 진정. 1 mL 사용 파운드, protease 억제제 집중 (25 x), 40 µ L 및 100%의 10 µ L의 950 µ L PMSF.
- Pipetting으로 완전 한 파운드의 300 µ L에 펠 릿을 resuspend 고 10 분 락 플랫폼에 4 ° c.
- Sonicate 다음 설정을 사용 하 여 샘플: 온도 4 ° C = 총 시간 = 7 분, “에 ” 간격 = 30 s, “에서 ” 간격 = 30 s, 진폭 = 25%
참고: 쥡니다 조건 각 조직에 대 한 최적화 하 고 사용 sonicator 따라 달라 집니다. 200에서 600까지 깎인된 DNA 결과 최저 쥡니다 설정을 사용 하는 것이 좋습니다 bp 크기. 기울이기 quanti 조직 유형에 따라 크게 달라 집니다.타이, 쥡니다 볼륨, 가교 조건 및 장비. 표 1에 있는 문제 해결 가이드를 참조 하십시오. - 작은 세포질 파편을 4 ° C에서 10 분 동안 16000 x g에서 sonicated 샘플을 회전.
- 전송 lysate (상쾌한) 신선한 1.5 mL 튜브.
참고: 시작 물자 2 칩 실험에 대 한 충분 한 간주, 다음 완전 한 파운드의 300 µ L에 추가할 수 있습니다 sonicated chromatin (즉, 최종 볼륨: 600 µ L). - 10%의 추가 30 µ L octylphenol의 모든 300 µ L에 대 한 ethoxylate sonicated lysate (최종 농도: 1%) pipetting으로 혼합.
참고: 주의! Octylphenol ethoxylate는 심하게 독성 (구강, 피부, 흡입).
4. 항 체 외피
- 약 수는 330 µ L의 sonicated 두 1.5 mL 튜브 lysate: 칩 및 입력된 제어 (시작 물자의 10%)으로 30 µ L 300 µ L. 저장소는 " 30 µ L 입력된 컨트롤 샘플 "에서-20 ° c.
참고: 두 칩 반응의 660 µ L sonicated lysate 다음 동일한 샘플에서 수행 되는 경우 배포 될 수 있다 3 1.5 mL 튜브 (300 µ L 칩 #1, 칩 # 2, 300 µ L 및 입력된 제어 (각 칩의 시작 물자의 20%)으로 60 µ L ). - Sonicated chromatin aliquot 및 혼합 반전의 300 µ L에 항 체의 3-5 µ g 추가.
참고:이 연구에서 각 칩 반응 수행 되었다 히스톤 H3 트라이 K4에 갠 특정 항 체와 (H3K4me3), K4에 갠 히스톤 H3 디 (H3K4me2), 히스톤 H3 트라이 K27에 갠 (H3K27me3), 및 히스톤 H3 트라이 acetylation K27에서 (H3K27me3). 이 프로토콜의 성공은 전적으로 사용 하는 항 체의 품질에 의존 이다. 항 체는 특정 특정 단백질의 immunoprecipitation에서 효율적 이어야 한다. 사용할 수 있는 immunoprecipitate 가교 된 단백질-DNA에 복잡 한 항 체의 크기를 결정 중요 하다. 또한, 항 체의 특이성은 올바른 단백질 검출 되도록 서쪽 오 점 하 여 확인할 수 있습니다. 여러 일반 밴드를 검출 하는 항 체 칩에 대 한 권장 하지 않습니다. - 장소 4 ° C에서 하룻밤 (12-16 h) 항 체를 바인딩할 락 플랫폼에 튜브는 chromatin.
주: 표 1에 있는 문제 해결 가이드를 참조 하십시오.
5. 마그네틱 구슬의 준비: 주 2
- Aliquot 50-100 µ L 1.5 mL microfuge에 각 칩 반응에 대 한 단백질 G/자석 구슬 슬러리의 얼음에 관
- 세척 3 번 감기 블록 솔루션으로 자석 구슬 (제조 법에 대 한 보충 자료 참조) (4 ° C). 반전 또는 flicking 500 µ L 찬 블록 솔루션 및 믹스를 추가 합니다. 자석 홀더도 튜브를 넣어 고 튜브의 측면에 정착 구슬 기 다. 명확한 액체를 부 어와 반복. 마지막 세척 후 젤 로드 팁 모든 액체 제거.
6. Immunoprecipitation는 Chromatin의
- 씻어 구슬에 항 체 바인딩 chromatin의 300 µ L을 추가 하 고 혼합 반전.
- 구슬에 항 체를 바인딩할 적어도 4 h 4 ° C에서 튜브 회전자에 세로로 회전.
7. 세척, Elute, 그리고 반대는 Crosslinks
- RIPA 워시 버퍼 진정 얼음, 65 ℃, 물 목욕을 설정 하 고 쿨 4 원심 분리기 (제조 법에 대 한 보충 자료 참조) ° c.
- 차가운 RIPA 워시 버퍼의 1 mL에 4 번 chromatin 바인딩된 비즈를 세척 하 고 얼음에 계속. 이렇게 하려면, 반전 또는 flicking 차가운 RIPA 워시 버퍼와 섞어 1 mL를 추가 합니다. 자석 홀더는 튜브를 삽입 하 고 튜브의 측면에 정착 구슬 기다립니다. 명확한 액체를 부 어 하 고 반복.
참고: RIPA 워시 버퍼와 세척 수 최적화를 해야 샘플 유형, 샘플 풍부, 및 사용 되는 항 체의 따라. 세척의 수를 증가 것 이다 백그라운드를 축소 하지만 또한 다운스트림 분석 정량 또는 칩이 손상 수 있습니다 복구 된 DNA의 총량을 감소 것입니다 - 테/50 m m NaCl의 1 mL 튜브에 추가 하 고 위에서 설명한 대로 자석 홀더를 사용 하 여 액체를 제거 하기 전에 신선한 1.5 mL microfuge 관 테/50 m m NaCl chromatin 바인딩된 구슬 전송.
- 900 x g 4 ° C에서 3 분에 구슬 회전, 튜브 자석 홀더에 다시 놓고 나머지 모든 테 젤 로드 팁 제거.
- 차입 버퍼의 추가 210 µ L (제조 법에 대 한 보충 자료 참조) 실내 온도와 터치 하 여 resuspend.
- 흔들어 동안 열 블록에 65 ° C에서 15 분 동안 Elute.
- 실내 온도에서 1 분 동안 16000 x g에서 구슬 회전 하 고 튜브 자석 홀더.
- 구슬 정착 되 면 신선한 microfuge 관 (~ 200 µ L) 상쾌한 전송.
- (단계 4.1에서에서 냉동) 실내 온도-20 ° C에서 입력된 컨트롤 샘플 (30 µ L)을 녹여, 차입 버퍼 (90 µ L)의 3 볼륨을 추가 하 고 간단히 vortexing에 의해 혼합.
- 65 ° C에서 하룻밤 (12-16 h)는 crosslinks를 칩 및 제어 샘플을 품 어.
8. 다이제스트 세포질 단백질 및 RNA: 하루 3
- 8.1At 온도 룸, 튜브 (SDS 희석) 당 TE 버퍼 1 볼륨을 추가 하 고 혼합 반전: 테의 120 µ L에 추가 컨트롤 샘플의 120 µ L 및 칩 샘플의 200 µ L에 테의 200 µ L.
- 추가 RNase A 0.2 mg/mL 최종 농도를 반전 혼합: 컨트롤 샘플의 240 µ L를 20 mg/mL RNase A 칩 샘플의 400 µ L의 4 µ L 20 mg/mL RNase A의 2.4 µ L을 추가.
- RNA를 소화 하기 위해 2 시간을 위한 물 욕조에 37 ° C에서 튜브를 품 어.
- 추가 가수분해 K 0.2 mg/mL 및 반전의 최종 농도에 혼합: 20 mg/mL 가수분해 K의 2.4 µ L에 추가 컨트롤 샘플의 240 µ L 및 20 mg/mL 가수분해 K 칩 샘플의 400 µ L의 4 µ L.
- 2 h 물 욕조에 55 ° C에서 단백질을 소화 하 고 DNA를 정화 하 품.
9. 칩-정량
참고: 보충 자료에 설명 된 대로 DNA 추출 및 정화, 수행.
참고: 보충 자료, 200-500 bp DNA 파편 ( 그림 3) 가져온 확인에 설명 된 대로 쥡니다 효율 확인.
참고: 중요 한 단계 칩 실제로 작동 하는 경우 확인 하는 것입니다. 관심사의 단백질에 대 한 게놈 바인딩 사이트 알고 있는, 뇌관 디자인 될 수 있다 정량 PCR (정량)에 대 한 알려진된 사이트 칩 DNA에 구체적으로 농축 됩니다 경우 확인 하려면 부정 제어 영역 준수할 것으로 예상에 비해 칸디날짜 단백질입니다. 예를 들어,이 일 H3K4me3에 대 한 수행 하는 칩과 칩 정량 결과 보여준다 (활성 발기인 히스톤 마크) 및 H3K27me3 (비활성 발기인 히스톤 마크) SNT 섹션 HH14 병아리 태아에서 분리 ( 그림 4A ).
- 같은 튜브 각 뇌관 쌍 (정방향 및 역방향)을 혼합 하 고 준비 20 µ M에서 재고 농도 사용 하 여 각 dH 2 O (표 2).
참고: 각 뇌관 쌍의 효율 칩 정량 분석 하기 전에 평가 해야 합니다. - 사용 칩 및 20% 입력된 제어 단계 8.5 정량 최적화에서에서 얻은 DNA.
참고: DNA는 일반적으로 입력 정량 분석 (칩 반응에 사용 되는 시작 물자의 1%)로 20 배 희석. - PCR의 각 10 µ L에 대 한 PCR 관에는 다음 구성 요소를 혼합: DNA mastermix (칩 또는 1% 입력)에서 dH2O, SYBR 녹색 믹스의 2.5 µ L 및 DNA의 1 µ L의 2 µ L 추가; mastermix 뇌관으로 dH2O, SYBR 녹색 믹스의 2.5 µ L의 앞으로 역 뇌관 믹스의 0.125 µ L 2.375 µ L 추가.
- 2 s와 짧게 1 분에 900 x g에서 원심 분리기에 대 한 vortexing에 의해 샘플을 혼합
- 수행 실시간 PCR (여기 사용 뇌관 및 자전거의 예를에서 찾을 수 있습니다 표 2와 표 3, 각각).
참고: 칩 정량 데이터 분석: 칩 신호 입력의 %로 계산 됩니다. 짧게, 한 번 Ct 값 가져온 각 정량 반응, 100 또는 6.644 사이클의 희석 비율 (100의 log2) 입력 DNA 반응을 얻은 Ct 값에 적용 됩니다. 그런 다음 관심 (즉, 뇌관 쌍)의 특정된 지역에 대 한 칩 신호는 다음과 같이 계산:
입력 조정 Ct (입력)-6.644 =
칩 신호 = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. 칩 seq 라이브러리 준비; 최종 선: 하루 4
- 100 희석 차입 버퍼의 60 µ L에서 칩-DNA의 ng (자료 표 참조).
- 끝의 추가 40 μ 믹스를 복구 하 고 부드럽게 10 번 플라스틱.
- 열 cycler에 30 분 동안 30 ° C에서 품.
- 소용돌이 자석 구슬 끝 복구 혼합을 포함 하는 튜브에 160 μ를 추가. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 15 분을 품 어.
- 자석 홀더에 튜브를 놓고 기다리는 측면에 튜브.. 정착 구슬
- 명확한 액체를 붓는 다.
- 자석 홀더에 튜브를 유지 하면서 추가 200 μ 갓 80 %EtOH.
- 품 30 s 및 삭제는 상쾌한 실내 온도에. 반복 한 번..
- 자석 홀더에 실 온에서 15 분 동안 튜브를 유지. 일단 펠 릿 건조, 마그네틱 홀더에서 튜브를 제거.
- 물의 resuspension 버퍼의 20 μ에 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 10 번을 철저 하 게 혼합 플라스틱.
- 실 온에서 2 분 동안 품.
- 자석 홀더는 튜브를 삽입 하 고 튜브의 측면에 정착 구슬에 대 한 기다립니다. 새로운 튜브에는 상쾌한의 17.5 μ 전송.
11. 칩 seq 라이브러리 준비; Adenylate 3 ' 끝
- A 미행 혼합을 새의 추가 12.5 μ 튜브와 부드럽게 10 번 위아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 열 cycler에 튜브를 놓고 다음과 같은 프로그램에 따라 품 어: 30 분, 5 분 및 4 ° C에서 홀드 70 ° C에 대 한 37 ° C
12. 칩 seq 라이브러리 준비; 어댑터 선
- 물의 resuspension의 추가 2.5 μ 버퍼, 결 찰 믹스의 2.5 μ와 적절 한 RNA 어댑터 인덱스의 2.5 μ. 부드럽게 10 번 위아래로 pipetting으로 철저 하 게 믹스.
- 30 °에서 10 분에 대 한 열 cycler에 품.
- 정지 결 찰 버퍼의 10 배를 pipetting으로 철저 하 게 혼합 추가 5 μ.
- 소용돌이 자석 구슬 42.5 μ 샘플에 추가. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 15 분을 품 어.
- 자석 홀더에 튜브를 놓고 튜브 측에 정착 하 여 명확한 액체를 부 어 구슬에 대 한 대기
- 자석 홀더에 튜브를 유지 하면서 추가 200 μ 갓 80 %EtOH.
- 품 30 s 및 삭제는 상쾌한 실내 온도에. 한번 반복.
- 자석 홀더에 튜브를 유지 하 고, 15 분에 대 한 건조 하자 샘플.
- 자석 홀더에서 튜브를 제거 하 고 물의 resuspension 버퍼의 52.5 μ에 펠 릿을 resuspend. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 2 분 동안 실내 온도에 incubate 하 고 자석 홀더는 튜브를 삽입 튜브 측에 정착 구슬에 대 한 기다립니다. 새로운 튜브에 분명 상쾌한의 50 μ 전송.
- 소용돌이 자석 구슬 50 μ 샘플에 추가. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 15 분을 품 어.
- 자석 홀더에 튜브를 놓고 구슬 튜브 측에 정착 하 고 맑은 액체를 부 어 때까지 기다리는.
- 자석 홀더에 튜브를 유지 하면서 추가 200 μ 갓 80 %EtOH.
- 품 30 s 및 삭제는 상쾌한 실내 온도에. 한번 반복.
- 자석 홀더에 튜브를 유지 하 고, 샘플 공기 15 분 건조
- 자석 홀더에서 튜브를 제거 하 고 물의 resuspension 버퍼의 27.5 μ에 펠 릿을 resuspend. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 믹스.
- 품 2 분 동안 실내 온도에 튜브 자석 홀더 놓고 튜브 측에 정착 구슬에 대 한 대기 합니다. 새로운 튜브에 분명 상쾌한의 25 μ 전송.
13. 칩 seq 라이브러리 준비; DNA 파편 증폭
- 0.2 mL PCR에에서 서식 파일의 장소 12.5 µ L 튜브. 10 번 위아래로 pipetting으로 PCR 뇌관 칵테일의 2.5 μ, 향상 된 PCR 혼합. 믹스 10 μ 철저 하 게 추가 합니다. 열 cycler에 튜브를 놓고 사용 하는 표 4에 설명 된 조건.
- 소용돌이 자석 구슬 25 μ 샘플에 추가. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 15 분을 품 어.
- 튜브 자석 홀더 장소, 구슬 튜브 측에 정착 하 고 맑은 액체를 부 어 때까지 기다리는.
- 자석 홀더에 튜브를 유지 하면서 추가 200 μ 갓 80 %EtOH. 30 s 및 삭제는 상쾌한 실내 온도에서 품 어. 한번 반복.
- 에 자석 홀더, 하자 샘플 공기 튜브 15 분 건조 유지 자석 홀더에서 튜브를 제거 하 고 물의 resuspension 버퍼의 32.5 μ에 펠 릿을 resuspend. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 믹스.
- 품 어 PCR 튜브/플레이트 실 온에서 2 분. 실 온에서 마그네틱 스탠드에 PCR 튜브/접시를 놓고, 튜브의 측면에 정착 하 여 새로운 튜브에는 상쾌한의 30 μ를 전송 구슬에 대 한 대기.
14. 칩 seq 라이브러리 준비; 유효성 검사 라이브러리
참고: 라이브러리의 유효성 검사는 DNA와 RNA 품질 관리 시스템을 사용 하 여 수행 됩니다. 사다리의 준비: 처음으로 게놈 DNA 사다리의 aliquot 1 µ L 튜브/잘 고 추가 샘플 버퍼의 3 µ L.
- 샘플의 준비: 3 µ L의 샘플 버퍼 튜브에 1 µ L 라이브러리 샘플 (10-100 ng / µ L)의 혼합. 회전 감소 그리고 샘플 튜브의 맨 아래에 위치 5 s. 스핀에 대 한 최대 속도에 소용돌이.
- 품질 관리 시스템에는 샘플을 로드.
- 실행 완료 되 면 아무 뇌관 이합체는 샘플 ( 그림 5)에; 뇌관 이합체 밴드 약 135에 해당 되도록 최대 값에 대비를 설정 하 여 결과 분석 혈압. 도 약한 밴드 있으면 차입 버퍼를 추가 하 여 한 두 번째 정리를 진행 (자료 테이블 참조) 50 µ L 볼륨 하 고 혼합된 자석 구슬의 47.5 µ L을 추가. 샘플의 농도 너무 낮은 경우 (< 2 nM), PCR (13.1 단계) 실행을 진행, 15, 샘플의 12.5 µ L 볼륨 대신 18 주기를 사용 하 여 단계의 12.16.
- 라이브러리 정량 상용 키트를 사용 하 여 개별적으로 계량.
참고: 라이브러리의 풀 수 있는 시퀀싱 할 목표로 30 M 읽기/샘플 1 x 50 nt 프로토콜의 단일 읽기와 시퀀서를 사용 하 여.
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Representative Results
우리의 칩 프로토콜의 성능을 설명 하기 위해 수행 하는 칩 seq 실험 HH19 닭 배아에서 풀링된 SNT 섹션을 사용 하 여, HH22의 상 악 굴지 닭 배아, 그리고 무대 HH3 닭 배아의 바인딩 프로필을 조사 하 다양 한 히스톤 수정 (즉, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3, 및 H3K27me3). 일단 칩 DNAs 가져온 쥡니다 효율 해당 입력된 DNAs (그림 3)의 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 평가 되었습니다. 다음, 칩 및 입력된 DNAs 사용 되었다 칩 정량 분석을 위해 측정 수 바운드 또는 언바운드 조사 히스톤 수정 (그림 4A)에 의해 예상 loci에서 풍부 하. 그림 4A, H3K27me3 및 H3K4me3 농축에 나와 있는 예제에서 HH19 SNT 섹션에서 레벨 SOX17 및 SOX2, 비활성 및 활성이 SNT에 각각은 2 개의 유전자의 발기인 지구 주위 칩 정량에 의해 평가 되었다. 예상 했던 대로, SOX2 발기인 강하게 표시 되었다 H3K27me3, 아니라 H3K4me3에 의해 SOX17 발기인 반대 패턴 (그림 4A) 보였다 동안. 몇 가지 loci를 평가 하 여 다운스트림 칩 seq 분석에 대 한 많은 DNA 자료를 잃지 않고 칩의 품질을 예측 가능 하다. 일단 칩의 품질 확인 했다 칩 seq 라이브러리 준비 되었고 시퀀스. 대표 loci 각 조사 닭 배아 조직에 대 한 표시 됩니다: (i) PAX7 (그림 4B); 주위 SNT HH19 여자 태아에서 H3K27me3 및 H3K4me3에 대 한 프로필 (ii) SNAI1 (그림 4C); 주위 HH22 닭 배아의 상 악 굴지에 H3K4me2 및 H3K27ac에 대 한 프로필 그리고 (iii) HH3 단계 닭 배아 TBX3/TBX5 소재 시 (그림 4D) 주위에 H3K27me3에 대 한 프로 파일. 이러한 칩 seq 실험은 명확 하 게 우리의 칩 프로토콜 배아 조직의 광범위에 생물학 물자의 제한 된 양의에서 epigenomic 프로 파일을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다 설명 합니다.
그림 1: 낮은 풍부 배아 샘플 닭 배아에서 분리 된 칩 프로토콜의 개요 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: SNT 기정 프로토콜의 개요 브리핑. 가로 SNT 세그먼트는 HH19 닭 태아의 상 완 수준에서 차단 된다. 트립 신 치료 후 비 신경 조직은 기계적으로 집게를 사용 하 여 제거 됩니다. 아니, notochord; SNT, 척추 신경 관; 그래서, somite. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 최적의 쥡니다의 예. 닭 SNT HH19 샘플 30 s에는 sonicator를 사용 하 여 "높은" 진폭에서 45 s OFF 펄스 11 사이클 sonicated 했다. crosslinks을 반대 했다 고 순화 된 DNA는 1.5 %agarose 젤에 해결 되었습니다. 최적의 조각 크기 11 주기, 200-500 bp.에서 배열 후 관찰 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 칩 정량 또는 칩이 칩 분석의 대표 예제 (A) H3K27me3 (왼쪽)와 H3K4me3 (오른쪽) 레벨 표시 영역에서 HH19 병아리 태아에서 분리 된 s n T 섹션을 사용 하 여 수행 하는 칩 정량 분석에 의해 측정 되었다. SOX2 발기인 지역 SNT에 적극적 이며 따라서 H3K27me3; 아니라 H3K4me3에 의해 표시 SOX17 발기인 지역 SNT에 적극적 이며 H3K27me3 H3K4me3;에 따라서 농축입니다. Chr6 Neg 닭고기 염색체 6에에서 intergenic 지역 나타내고 부정적인 제어로 제공. 오차 막대는 3 기술 복제에서 표준 편차를 나타냅니다. (B) 칩 seq (자홍색으로 H3K27me3, H3K4me3, 파란색에서 및 빨간색에서 입력) HH14 SNTs 병아리 태아에서 프로필 PAX7 로커 스 주위에 표시 됩니다. (C) 칩 seq (H3K4me2 주황색에서, 녹색, H3K27ac 및 빨간색에서 입력) HH22 병아리 태아의 상 악 굴지에서 프로필 SNAI1 소재 시 주위에 표시 됩니다. (D) 칩 seq HH3 병아리 태아에서 (자홍색으로 H3K27me3) 및 빨간색에서 입력 프로 파일 TBX3/TBX5 소재 시 주위에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 자동 RNA 품질 관리 시스템을 사용 하 여 칩 seq 라이브러리 유효성 검사의 예. 동일한 칩 seq 라이브러리 (A) 전에 자동된 RNA 품질 관리 시스템으로 분석 되었다 (B) 뇌관 이합체 정리 후. 뇌관 이합체는 약한 ~ 135 bp 밴드 (A)에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
단계 | 문제 | 가능한 이유 | 솔루션 |
1,2,3,4 5와 11 | 칩-정량 및 칩 seq에 따라 잡음 비율 낮은 칩 신호 | 조직의 품질 손상. | 마이크로-해 차가운 조건;에서 수행 그렇지 않으면 chromatin 무결성 노출 될 수 있습니다. |
가교 된 샘플의 원심 분리 후 샘플 손실입니다. | 10-20% 혈 청 또는 반복 원심 분리 단계 DMEM 매체를 사용 하 고 10 분을 시간을 증가. | ||
가교 기간입니다. | 가교 시간을 최적화 합니다. 증가 가교 번 공동 활성 할 바인딩되지 DNA에 직접 공동 repressors 등 특정 단백질의 검출을 용이 하 게 수 있습니다. | ||
PBS에서 여러 세척으로 샘플 손실입니다. | 세척;의 수 감소 1500 x g에서 원심 분리 단계를 반복할 수 있습니다. | ||
너무 오랫동안 또는 너무 짧은 DNA 크기에 따른 차선 쥡니다. | 시간 과정 실험 쥡니다 조건 최적화를 수행 합니다. 200에서 500에 이르기까지 최적의 조각 크기 혈압 | ||
항 체 칩에 적합 하지 않은입니다. | 내 인 성 단백질에 대 한 서로 다른 항 체 또는 한 것 표현된 단백질 (예: 깃발, HA)에 추가 하는 태그에 대 한 항 체를 사용 합니다. | ||
12 | 낮은 또는 정량, 아무 신호도 입력 DNA에 대 한 | 차선의 뇌관 | 뇌관 효율성 및 특이성; 새로운 뇌관 디자인. |
DNA의 부족 한 금액 | 충분 하지 않은 시작 소재입니다. 정량 Pcr 반응 마다 사용 하는 DNA의 양을 증가. |
뇌관 | 시퀀스 |
SOX2 F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
SOX2-R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
SOX17-F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
SOX17-R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
Chr6-neg-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
Chr6-neg-R | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
표 2: 칩-정량 pcr 뇌관 시퀀스.
Preincubation | ||
온도 | 시간 | |
95 ° C | 5 분 | |
증폭 | ||
온도 | 시간 | |
95 ° C | 10 s | |
60 ° C | 10 s | 45 |
72 ° C | 10 s | 사이클 |
녹는 곡선 | ||
온도 | 시간 | |
95 ° C | 5 s | |
65 ° C | 1 분 | |
냉각 | ||
40 ° C | 30 s |
표 3: 칩-정량 pcr PCR 조건.
초기 변성 | ||
온도 | 시간 | |
95 ° C | 3 분 | |
증폭 | ||
온도 | 시간 | |
98 ° C | 20 s | |
60 ° C | 15 s | 15 |
72 ° C | 30 s | 사이클 |
마지막 확장 | ||
온도 | 시간 | |
72 ° C | 5 s | |
냉각 | ||
4 ° C | 보류 |
표 4: 칩 seq 라이브러리 준비 하는 동안 DNA 파편의 확대를 위한 PCR 조건.
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Discussion
다른 세포질 문맥4,,518에 척 추가 있는 게놈의 기능적인 주석을 개선 하기 위해 Epigenomic의 히스톤 수정 칩 seq를 사용 하 여 프로 파일링을 사용할 수 있습니다. 이러한 epigenomic 프로필 사용할 수 있습니다, 다른 것 들 중, 증강 요소, (즉, 활성, 준비, 또는 태세), 강화의 규제 상태를 정의 하 고 다른 생물에 주요 셀 정체성 레 귤 레이 터를 정의 식별 하 또는 병 적인 컨텍스트 (예: 광범위 한 H3K4me3 발기인 도메인 및 슈퍼 강화)6,7,,910,11,19. 그러나, 일반적으로 수백만의 세포를 요구 한다, 칩 분석 실험의 제한을 인해 대부분 히스톤 수정 셀 라인 생체 외에서 생성 된 프로필과 셀 수 있는 유형 정렬 비보에 대량 4. 가장 최근에 여러 칩 seq 프로토콜 설명 되었습니다 매우 낮은 세포 수, 세포 유형의 범위 크게 확대와 호환 되는 및 어떤 epigenomic에 프로 파일 될 수 있습니다, 원칙적으로, 조직 생성13 ,14,,1516. 적어도 어떤 경우에 비표준 장비 및 시 약14,,1516를 요구 하는 특정 임시 도서관 준비 방법에 의존 하는이 새로운 칩 seq 프로토콜 각.
여기, 우리가 다른 배아 조직10에서 vivo에서 얻은 중간 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀) 낮은 작동 칩 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 칩 분석 실험의 감도 증가, 순차적 셀 등 귀중 한 자료의 진보적인 손실 귀 착될 수 있다 핵 세포 칩, 동안 일반적으로 사용 하는 몇 가지 단계를 제거는 우리. 따라서, 가교, 후 샘플 단일 세포의 용 해 버퍼 처리 됩니다 하 고 이후 샘플 손실을 최소화 하기 위해 sonicated. 중요 한 것은, 우리의 칩 프로토콜 정량 분석, 관심의 선택한 loci의 epigenomic 분석 활성화와 호환 됩니다. 또한, 우리의 칩 프로토콜 표준 칩 seq 라이브러리 준비 방법, 따라서 차세대 시퀀싱 기술에 액세스할 수 있는 대부분의 실험실에 잠재적으로 유용한 것으로 결합할 수 있습니다.
칩 칩 seq 프로토콜 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라 히스톤 수정의 바인딩 프로필 조사 뿐만 아니라 다른 중요 한 transcriptional 레 귤 레이 터, 녹음 방송 요인 등 공동 활성 제 (예를 들어, 바인딩 사이트를 밝히기 p 300와 CBP)20. 일반적으로, 칩 (칩 seq) 녹음 방송 요인 및 공동 활성 제는 없는 및 히스톤으로 풍부한, 히스톤 부호 칩 보다는 상당히 더 시작 자료가 필요 합니다. 따라서, 설명된 프로토콜 반드시 대부분 녹음 방송 요인에 대 한 작동 하지 않을 수도 또는 공동 활성 세포를 시작 하는 수 않으면 상당히 증가 (예를 들어, 5 x 105 -5 x 106 셀) 또는 매우 특정 하 고 효율적인 항 체를 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 추가 최적화 및 지속적으로 개선 라이브러리 준비 방법, 우리 예상 제한 된 셀룰러 자료에서 칩 seq 대부분 규제 단백질에 대 한 실현 될 것 이다.
비록 우리의 칩과 칩 seq 프로토콜 광범위 하 게 다양 한 히스톤 수정 및 배아 조직에 대 한 검증 된, 우리가 우리가 고려 높은 품질 epigenomic 프로 파일 생성에 필수적인 몇 가지 중요 한 단계를 강조 하 고 싶습니다. 첫째, 배아 샘플 갓 chromatin 무결성을 손상 하지 않는 조건 하에서 고립 될 필요가 있다. 충분 한 자료 축적 때까지 차가운 조건 또는 플래시 동결 풀링된 샘플 해 수행 포함 됩니다. 또 다른 중요 한 단계는 정확 하 게 높은-품질 칩을 수행 하기 위해 최적화가 필요한 쥡니다. 최적의 쥡니다 조건 자주 따라 달라 조직 유형, 조직, 또는 사용 중인 sonicator의 금액. 마지막으로, 성공적인 칩 궁극적으로 및 관심사의 단백질에 대 한 항 체 칩 호환의 가용성에 의존합니다.
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Disclosures
저자는 공개 해야 경쟁 금융 관심사를 있지 않습니다.
Acknowledgments
저자는이 프로토콜의 설립 동안에 그의 우수한 기술 지원에 대 한 1 월 Appel 감사합니다. Rada Iglesias 실험실에서 작업 CMMC 교내에서 지원 자금, DFG 연구 보조금 (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1, 그리고 테 1007/3-1), UoC 고급 연구원 그룹 그랜트, 그리고 CECAD 그랜트.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
SDS | Carl Roth | 1833 | |
Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
Glycine | |||
RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
Rotator | Stuart | SB3 | |
Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
Timer | Sigma | N/A | |
Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
Mixer | LMS | VTX 3000L | |
Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
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