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Genetics

क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप) कम बहुतायत भ्रूण के नमूनों के लिए प्रोटोकॉल

Published: August 29, 2017 doi: 10.3791/56186
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,3
1Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC), University of Cologne, 2Cologne Center for Genomics (CCG), University of Cologne, 3Cologne Excellence Cluster for Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), Research Center and Systems Biology of Ageing Cologne, University of Cologne

Summary

यहां, हम एक क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) और चिप seq पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए कम बहुतायत चिकन भ्रूण के नमूनों से वैश्विक epigenomic प्रोफाइल उत्पंन करते हैं ।

Abstract

क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) पोस्ट के स्थानीयकरण-अनुवाद संशोधित histones, citrullinated वेरिएंट, प्रतिलेखन कारकों, या क्रोमेटिन-संशोधित एंजाइमों एक दिया लोकस पर या एक जीनोम व्यापक पैमाने पर मानचित्रण के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक है । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ चिप परख के संयोजन (यानी, चिप-Seq) दुनिया भर में जीन विनियामक नेटवर्क को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है और जीनोम के कार्यात्मक एनोटेशन में सुधार करने के लिए, विशेष रूप से गैर कोडिंग विनियामक दृश्यों । चिप प्रोटोकॉल आम तौर पर सेलुलर सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, इस प्रकार दुर्लभ कोशिका प्रकार या छोटे ऊतक बायोप्सी की जांच करने के लिए इस विधि की प्रयोज्यता precluding । आदेश में चिप परख जैविक सामग्री है कि आम तौर पर जल्दी हड्डीवाला embryogenesis के दौरान vivo में प्राप्त किया जा सकता है की राशि के साथ संगत बनाने के लिए, हम यहां एक सरलीकृत चिप प्रोटोकॉल जिसमें कदम पूरा करने के लिए आवश्यक की संख्या का वर्णन परख के लिए नमूना नुकसान को कम किया गया । इस चिप प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक मध्यम सेल संख्या (5 एक्स 104 -5 एक्स 105 कोशिकाओं) के लिए कम का उपयोग कर विभिन्न भ्रूण चिकन और वयस्क माउस के ऊतकों में विभिन्न citrullinated संशोधनों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल चिप के साथ संगत है seq मानक पुस्तकालय तैयारी के तरीकों का उपयोग प्रौद्योगिकी, इस प्रकार अत्यधिक प्रासंगिक भ्रूण के ऊतकों में वैश्विक epigenomic नक्शे प्रदान ।

Introduction

citrullinated पद-शोधों के संशोधनों को प्रत्यक्ष रूप से विभिन्न क्रोमेटिन-निर्भर प्रक्रियाओं में शामिल कर रहे हैं, जिनमें प्रतिलेखन, प्रतिकृति और डीएनए की मरम्मत1,2,3है. इसके अलावा, विभिंन citrullinated संशोधनों सकारात्मक दिखाने (जैसे, H3K4me3 और H3K27ac) या नकारात्मक (जैसे, H3K9me3 और H3K27me3) जीन अभिव्यक्ति के साथ सहसंबंध और मोटे तौर पर सक्रिय या दमन citrullinated के निशान के रूप में परिभाषित किया जा सकता है, क्रमशः२,३. नतीजतन, वैश्विक citrullinated संशोधन नक्शे, भी epigenomic नक्शे के रूप में भेजा, शक्तिशाली और सार्वभौमिक उपकरण के रूप में उभरा है कार्यात्मक हड्डीवाला जीनोम4व्याख्या,5। उदाहरण के लिए, ऐसे बढ़ाने के रूप में बाहर का नियामक अनुक्रम विशिष्ट क्रोमेटिन हस्ताक्षर की उपस्थिति के आधार पर पहचाना जा सकता है (उदा, सक्रिय बढ़ाने: H3K4me1 और H3K27ac), जो उन्हें समीपस्थ प्रवर्तक क्षेत्रों से अलग (उदा., सक्रिय प्रवर्तक: H3K4me3)6,7,8. दूसरी ओर, प्रमुख सेल पहचान विनियामक कार्यों के साथ जीन आमतौर पर व्यापक क्रोमेटिन H3K4me3 या H3K27me3 के साथ चिह्नित डोमेन, अंतर्निहित जीन की transcriptionally सक्रिय या निष्क्रिय स्थिति पर निर्भर करता है के साथ पाया जाता है, क्रमशः9 ,10. इसी तरह, प्रमुख सेल पहचान जीन की अभिव्यक्ति अक्सर कई और स्थानिक संकुल बढ़ाने (यानी, सुपर बढ़ाने), जो व्यापक H3K27ac के रूप में पहचाना जा सकता है-डोमेन के रूप में चिह्नित11के द्वारा नियंत्रित किया जा रहा है ।

वर्तमान में, citrullinated संशोधन नक्शे चिप का उपयोग कर उत्पंन कर रहे है seq प्रौद्योगिकी, चिप के रूप में पिछले दृष्टिकोण की तुलना में जो चिप (microarrays को युग्मित चिप) उच्च संकल्प प्रदान करता है, कम कलाकृतियों, कम शोर, अधिक कवरेज, और कम 12लागत । फिर भी, epigenomic चिप का उपयोग नक्शे की पीढ़ी-seq प्रौद्योगिकी अपनी अंतर्निहित सीमाएं हैं, ज्यादातर क्षमता के साथ जुड़े के लिए सफलतापूर्वक ब्याज के नमूनों में चिप प्रदर्शन । पारंपरिक चिप प्रोटोकॉल आमतौर पर कोशिकाओं है, जो इस विधि की प्रयोज्यता को इन विट्रो सेल लाइनों या कोशिकाओं है कि आसानी से vivo में अलग किया जा सकता है (जैसे, रक्त कोशिकाओं) की सीमा के लाखों की आवश्यकता है । पिछले कुछ वर्षों में, कम सेल संख्या के साथ संगत संशोधित चिप प्रोटोकॉल की एक संख्या13,14,15,16वर्णित किया गया है । हालांकि, इन प्रोटोकॉल विशेष रूप से अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (यानी, चिप-seq) के साथ युग्मित किया जा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और वे आम तौर पर एड हॉक लाइब्रेरी तैयारी विधियों13,14का उपयोग करें, 15 , 16.

यहां, हम एक चिप प्रोटोकॉल है कि मध्यवर्ती सेल संख्या (5 x 104 -5 x 105 कोशिकाओं) या तो चयनित loci (यानी, चिप-qPCR) या दुनिया भर में (यानी के लिए कम का उपयोग कर citrullinated संशोधन प्रोफाइल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णित है, चिप-seq) (चित्रा १). जब चिप के लिए युग्मित-seq प्रौद्योगिकी, हमारे चिप प्रोटोकॉल मानक पुस्तकालय तैयारी के तरीकों के साथ एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार यह मोटे तौर पर कई प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाने10। इस प्रोटोकॉल के लिए विभिंन चिकन भ्रूण के ऊतकों में कई citrullinated चिह्न (जैसे, H3K4me3, H3K27me3, और H3K27ac) की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (जैसे, रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका ट्यूब (SNT), frontonasal प्रमुखता, और epiblast) । हालांकि, हमें आशंका है कि यह मोटे तौर पर अन्य जीवों के लिए लागू किया जाना चाहिए जिसमें जैविक रूप से और/या नैदानिक रूप से प्रासंगिक नमूने केवल कम मात्रा में प्राप्त किए जा सकते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > जर्मन पशु देखभाल दिशानिर्देश के अनुसार, चिकन भ्रूण प्रयोगों को करने के लिए कोई संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) अनुमोदन आवश्यक था । स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुसार, चिकन HH44 (18-दिन) भ्रूण और पुराने के साथ केवल प्रयोगों को IACUC अनुमोदन की आवश्यकता होती है । हालांकि, भ्रूण विकास ( यानी, HH19 (७२ एच)) के पहले के चरणों में इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले भ्रूण थे ।

< p class = "jove_content" > नोट: इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए चिप परख का एक विस्तृत विवरण प्रदान करना है तो यह प्रभावी रूप से qPCR या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ संयुक्त किया जा सकता है ( यानी, चिप seq) में citrullinated संशोधनों की जांच कम बहुतायत भ्रूण के नमूनों (से लेकर 5 x 10 4 -5 x 10 5 प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया के लिए कोशिकाओं) और विभिंन ऊतक प्रकार (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ) । प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों और सह उत्प्रेरक ( जैसे, p300) के बंधन प्रोफाइल की जांच करने के लिए लागू किया जाना चाहिए । हालांकि, इन विनियामक प्रोटीन की कम बहुतायत के कारण, बड़े सेल नंबर की संभावना है (5 x 10 5 -5 x 10 6 कोशिकाओं प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया के लिए) ।

< p class = "jove_title" > 1. अंडे और चिकन SNT के Microdissection की तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: microdissections के लिए प्रक्रिया तकनीकी रूप से ऊतक से ऊतक और पशु मॉडल से पशु मॉडल के लिए अलग है । इस खंड का वर्णन विस्तार से विच्छेदन प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में मंच से बाहु SNT वर्गों-HH19 चिकन भ्रूण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया ।

  1. गर्मी उपजाऊ सफेद भाफ मुर्गी अंडे, एक स्थानीय ब्रीडर से प्राप्त, क्षैतिज अभिविन्यास में ३७ & #176; सी और 3 दिनों के लिए ८०% आर्द्रता चरण-HH19 चिकन भ्रूण पाने के लिए.
  2. हैमबर्गर और हैमिल्टन चिकन भ्रूण विकास मचान प्रणाली के अनुसार चरणों का निर्धारण < सुप वर्ग = "xref" > १७ .
  3. शीत शर्तों के तहत सभी microdissections निष्पादित करें; अंयथा, क्रोमेटिन अखंडता समझौता किया जा सकता है ।
  4. HH19 भ्रूण को अलग कर.
    1. भ्रूण सुलभ बनाने के लिए, एक सुई (०.९० x ४० मिमी) के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एल्ब्युमिन के 3 मिलीलीटर निकालने blastoderm.
      2. कम करने के लिए
    2. ठीक कैंची का उपयोग कर अंडे में एक छोटे से खोलने बनाने और लोके समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें ( अनुपूरक सामग्री नुस्खा के लिए देखें) अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली को हटाने की सुविधा ।
    3. एक सुई (०.५५ x 25 मिमी 2 ) के साथ एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 10% भारतीय काली स्याही/लोके समाधान के लिए भ्रूण के दृश्य को आसान बनाने के blastoderm ।
    4. अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली कि चिकित्सा सर्जिकल ठीक कैंची और संदंश.
      5. का उपयोग कर भ्रूण चारों ओर से काट
    5. एक छिद्रित चंमच का उपयोग करने के लिए एक ४.५ cm पेट्री डिश 1x पंजाबियों समाधान के 20 मिलीलीटर युक्त करने के लिए भ्रूण हस्तांतरण ।
  5. दूर टुकड़े amnion और अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली का शेष भाग ठीक कैंची और एक संदंश के तहत stereomicroscope का उपयोग कर ।
  6. भ्रूण के बाहु स्तर पर अनुप्रस्थ SNT खंड को काट, वक्ष क्षेत्र में caudally को अलग करने के लिए SNT (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) का विस्तार ।
  7. ऊतकों कि बाद में/ventrally घेर SNT ( जैसे, पार्श्व प्लेट त्वक, बाह्यत्वक, notochord, और महाधमनी) का उपयोग संदंश (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
  8. में विसर्जित प्रत्येक विच्छेदित चिकन SNT सेगमेंट एक ३.५ सेमी पेट्री डिश जिसमे 5 मिलीलीटर गर्म (३७ & #176; C) trypsin (trypsin/EDTA समाधान 1:250).
  9. बंद trypsin उपचार जब SNT के आसपास गैर तंत्रिका ऊतकों के ढीला एक stereomicroscope.
    के तहत पता चला है नोट: trypsinization समय कसकर अधिक पाचन और तंत्रिका ऊतक के फैलाव से बचने के लिए और SNT के संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  10. trypsin उपचार के बाद, शेष mesenchymal और ectodermal ऊतकों को मैंयुअल रूप से स्वच्छ SNT अनुभाग तैयार करने के लिए निकालें ।
  11. SNT खंड एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब और फ्लैश-यह तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करने के लिए स्थानांतरण । एक बार पर्याप्त SNT वर्गों (पूल से SNT वर्गों जमा कर रहे है ~ 30 एक चिप प्रतिक्रिया के लिए चिकन भ्रूण), पर स्टोर-८० & #176; C.
    नोट: यदि पर्याप्त भ्रूण ऊतक ( यानी, 5 x 10 5 -5 x 10 6 कोशिकाओं) एक या कुछ चिकन भ्रूण से विच्छेदित किया जा सकता है, तो ठंड आवश्यक नहीं है और यह अगले चरणों के लिए सीधे आगे बढ़ना संभव है । कृपया समस्या निवारण मार्गदर्शिका को तालिका 1 .
    में देखें नोट: सावधानी! तरल नाइट्रोजन एक अत्यंत कम तापमान है, उचित संरक्षण पहनते हैं ।
< p class = "jove_title" > 2. डीएनए को Crosslinking प्रोटीन: दिन 1

< p class = "jove_content" > नोट: बर्फ पर सभी कदम प्रदर्शन जब तक अंयथा कहा ।

  1. Add ५०० & #181; l के साथ DMEM 10% FBS और 10 & #181; l के 1 M ना-butyrate सीधे जमे हुए ऊतक के लिए या, वैकल्पिक रूप से, तुरंत नए सिरे से विच्छेदित ऊतक को. Homogenize कोशिकाओं को फिर से एक 1 मिलीलीटर पिपेट.
    के साथ धीरे सस्पैंड द्वारा नोट: Na-butyrate के अलावा वैकल्पिक है, लेकिन अगर जांच citrullinated acetylation की सिफारिश की । DMEM के बजाय-10% FBS, नमूनों ०.१% BSA के साथ 1x पंजाब में reसस्पैंड किया जा सकता है । FBS या BSA के अलावा वैकल्पिक है, लेकिन यह बाद के केंद्रापसारक कदम में नमूने छर्रों की सुविधा ।
  2. Add १३.५ & #181; L का ३७% formaldehyde (1% formaldehyde final) और इसे कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक रोटेटर पर रखें ।
    नोट: सावधानी! Formaldehyde विषाक्त है ।
  3. Add 25 & #181; २.५ मीटर glycine के एल ट्यूब और formaldehyde बुझाने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक रोटेटर पर रखें.
  4. 5 मिनट के लिए ८५० x g पर ट्यूब स्पिन 4 & #176; सी में एक तालिका शीर्ष केंद्रापसारक । supernatant.
    5. को छोड़ें
  5. के साथ एक बार गोली धो ५०० & #181; शीत हौसले से तैयार धोने बफर के एल ( अनुपूरक सामग्री नुस्खा के लिए देखें), ८५० x g और 4 & #176 पर केंद्रापसारक 5 मिनट के लिए सी, और supernatant.
    6. त्यागें
< p class = "jove_title" > 3. Lysis और Sonication

  1. पूरा Lysis बफर (पौंड) (नुस्खा के लिए अनुपूरक सामग्री देखें) तैयार है और बर्फ पर ठंडा । 1 मिलीलीटर के लिए, उपयोग ९५० & #181; l of LB, ४० & #181; l of छेड़ने अवरोधक ध्यान (25x), व 10 & #181; l का १००% PMSF.
  2. ३०० में गोली reसस्पैंड & #181; pipetting द्वारा पूर्ण पौंड के एल और यह एक कमाल का मंच पर 10 मिनट के लिए 4 में जगह & #176; C.
  3. Sonicate निंन सेटिंग्स का उपयोग कर नमूने: Temp = 4 & #176; C, कुल समय = 7 मिनट, & #8220; पर & #8221; अंतराल = 30 s, & #8220; बंद & #8221; अंतराल = 30 s, आयाम = 25%
    नोट: Sonication शर्तों प्रत्येक ऊतक के लिए अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता है और इस्तेमाल किया sonicator के आधार पर भिंन होगा । यह आकार में २०० से ६०० बीपी से लेकर कतरनी डीएनए में परिणाम है कि सबसे कम sonication सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । कतरनी बहुत ऊतक प्रकार, quanti के आधार पर बदलता हैty, sonication मात्रा, crosslinking शर्तों, और उपकरण । कृपया समस्या निवारण मार्गदर्शिका को तालिका 1 .
    4. में देखें
  4. स्पिन sonicated नमूना पर 10 मिनट के लिए १६,००० x g पर 4 & #176; सी सेलुलर मलबे गोली करने के लिए.
  5. lysate (supernatant) एक ताजा १.५-एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: यदि प्रारंभिक सामग्री दो चिप प्रयोगों के लिए पर्याप्त समझा है, तो ३०० & #181; l पूर्ण पौंड का sonicated क्रोमेटिन ( यानी, अंतिम मात्रा: ६०० & #181; l) में जोड़ा जा सकता है.
  6. Add 30 & #181; l का 10% octylphenol ethoxylate के लिए हर ३०० & #181; l के sonicated lysate (अंतिम एकाग्रता: 1%) और pipetting द्वारा मिश्रण.
    नोट: सावधानी! Octylphenol ethoxylate तीव्र विषाक्त (मौखिक, अधययन, साँस लेना) है.
< p class = "jove_title" > 4. एंटीबॉडी की मशीने

  1. Aliquot ३३० & #181; l के sonicated lysate में दो १.५-एमएल ट्यूबों: ३०० & #181; l for चिप और 30 & #181; l के रूप में इनपुट नियंत्रण (प्रारंभिक सामग्री का 10%). stores & #34; 30 & #181; L इनपुट control sample & #34; at-20 & #176; C.
    नोट: यदि दो चिप प्रतिक्रियाओं एक ही नमूना से किया जाता है, फिर ६६० & #181; l का sonicated lysate तीन १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में वितरित किया जा सकता है (३०० & #181; l for चिप # 1, ३०० & #181; l for चिप # 2, and ६० & #181; एल के रूप में इनपुट नियंत्रण (प्रत्येक चिप के प्रारंभिक सामग्री का 20%) ).
  2. Add 3-5 & #181; के g लए एंटीबॉडी का ३०० & #181; L के sonicated क्रोमेटिन aliquot और पलटन को मिश्रण.
    नोट: इस अध्ययन में, प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया K4 (H3K4me3) पर citrullinated H3 त्रिकोणीय मिथाइलयुक्त के लिए एक एंटीबॉडी विशिष्ट के साथ प्रदर्शन किया था, citrullinated H3 di मिथाइलयुक्त पर K4 (H3K4me2), citrullinated H3 त्रिकोणीय मिथाइलयुक्त पर K27 (H3K27me3), और citrullinated H3 त्रिकोणीय acetylation पर K27 (H3K27me3) । इस प्रोटोकॉल की सफलता पूरी तरह से इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की गुणवत्ता पर निर्भर है । एंटीबॉडी एक विशिष्ट प्रोटीन के immunoprecipitation में विशिष्ट और कुशल होना चाहिए । यह crosslinked प्रोटीन-डीएनए जटिल immunoprecipitate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एंटीबॉडी की मात्रा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, एंटीबॉडी की विशिष्टता पश्चिमी दाग द्वारा जांच की जा सकती है सुनिश्चित करने के लिए कि यह सही प्रोटीन का पता लगाता है । एक एंटीबॉडी कि एकाधिक विशिष्ट बैंड का पता लगाता है चिप के लिए अनुशंसित नहीं है ।
  3. एक रॉकिंग प्लेटफार्म पर ट्यूब पर 4 & #176; ग रातोंरात (12-16 ज) को एंटीबॉडी से बाँध कर क्रोमेटिन.
    नोट: कृपया समस्या निवारण मार्गदर्शिका को तालिका 1 .
    4. में देखें
< p class = "jove_title" > 5. चुंबकीय मोतियों की तैयारी: Day 2

  1. Aliquot ५०-१०० & #181; प्रोटीन जी के एल/बर्फ पर एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में प्रत्येक चिप प्रतिक्रिया के लिए चुंबकीय मनका घोल ।
  2. ठंड ब्लॉक समाधान के साथ तीन बार चुंबकीय मोती धोने (नुस्खा के लिए अनुपूरक सामग्री देखें) (4 & #176; C). Add ५०० & #181; कोल्ड ब्लॉक सॉल्यूशन के एल और उल्टे या फ्लिक करके मिक्स करें । एक चुंबकीय धारक में ट्यूब रखो और मोतियों की प्रतीक्षा करने के लिए ट्यूब के पक्ष पर बसा । स्पष्ट तरल और दोहराने बंद डालो । अंतिम धोने के बाद, एक जेल-लोडिंग टिप के साथ सभी तरल निकालें ।
< p class = "jove_title" > 6. Immunoprecipitation के क्रोमेटिन

  1. जोड़ें ३०० & #181; एंटीबॉडी के एल-बाउंड क्रोमेटिन को धोया मोतियों और पलटने के लिए मिक्स.
  2. पर एक ट्यूब रोटेटर पर अनुलंब रूप से रोटेट करें 4 & #176; ग के लिए कम से 4 ज एंटीबॉडी को मोतियों से बांधने के लिए.
< p class = "jove_title" > 7. धो, Elute, और रिवर्स Crosslinks

  1. चिल RIPA धो बफर (देखें अनुपूरक सामग्री नुस्खा के लिए) बर्फ पर, ६५ & #176 के लिए जल स्नान सेट; ग, और शांत करने के लिए 4 के केंद्रापसारक & #176; ग.
  2. क्रोमेटिन-बाउंड मोतियों को चार बार धोकर ठंडे RIPA वॉश बफर के 1 मिलीलीटर में रख दें और बर्फ पर रखें । ऐसा करने के लिए, 1 मिलीलीटर ठंड RIPA धोने बफर और मिश्रण पलटने या झाड़ू से जोड़ें । चुंबकीय धारक में ट्यूब प्लेस और मोती ट्यूब के पक्ष पर बसने के लिए प्रतीक्षा करें । बंद डालो स्पष्ट तरल और दोहराने ।
    नोट: RIPA वॉश बफर के साथ बहाकर की संख्या नमूना प्रकार, नमूना बहुतायत के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, और एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जा रहा है । धुल की एक संख्या पृष्ठभूमि कम हो जाएगा, लेकिन यह भी बरामद डीएनए की कुल राशि है, जो qPCR या चिप-seq.
    3. द्वारा बहाव विश्लेषण समझौता कर सकते है कम हो जाएगा
  3. के 1 मिलीलीटर जोड़ें/50 मिमी NaCl ट्यूब करने के लिए और क्रोमेटिन-बाउंड मोतियों को ते में हस्तांतरण/50 mm NaCl एक ताजा १.५-एमएल microfuge ट्यूब करने के लिए चुंबकीय धारक का उपयोग करके तरल हटाने से पहले, जैसा कि ऊपर वर्णित है ।
  4. 3 मिनट के लिए ९०० x g पर मोतियों को स्पिन करें 4 & #176; C, ट्यूब को वापस चुंबकीय धारक में रखें, और एक जेल-लोडिंग टिप के साथ शेष सभी को निकाल दें ।
  5. Add २१० & #181; रेफरेंस बफर के एल ( अनुपूरक सामग्री को रेसिपी के लिए) कमरे के तापमान पर देखें और फ़्लिक करके फिर से सस्पेंड करें ।
  6. Elute पर 15 मिनट के लिए ६५ & #176; C एक हीट ब्लॉक में मिलाते हुए.
  7. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए १६,००० x g पर मोतियों स्पिन और ट्यूब चुंबकीय धारक में जगह है ।
  8. supernatant (~ २०० & #181; L) को एक बार ताजा microfuge ट्यूब के पास मोतियों को बसा दिया ।
  9. गल इनपुट कंट्रोल के नमूने (30 & #181; l) से-20 & #176; ग से कमरे के तापमान (४.१ चरण में जमे हुए), (९० & #181; l) रेफरेंस बफर के 3 खंड जोड़ें, और संक्षेप में भंवर द्वारा मिश्रण.
  10. मशीन पर चिप और नियंत्रण नमूने ६५ & #176; ग रातोंरात (12-16 ज) crosslinks.
    11. रिवर्स करने के लिए
< p class = "jove_title" > 8. डाइजेस्ट सेलुलर प्रोटीन और आरएनए: दिन 3

  1. 8.1 कमरे के तापमान पर, प्रति ट्यूब (एसडीएस को पतला करने के लिए) और मिश्रण करने के लिए पलटना करने के लिए ते का 1 खंड जोड़ें: add १२० & #181; l के ते १२० & #181; l of control sample and २०० & #181; l का के ल ते २०० & #181; l का चिप नमूना.
  2. जोड़ें RNase एक करने के लिए एक ०.२ मिलीग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता और मिश्रण करने के लिए पलटना: Add २.४ & #181; एल के 20 मिलीग्राम/एमएल RNase a to २४० & #181; l के कंट्रोल सैंपल और 4 & #181; l का 20 mg/मब RNase a से ४०० & #181; l का चिप नमूना.
  3. पर ट्यूब ३७ & #176; सी के लिए एक जल स्नान में 2 h आरएनए को पचाने के लिए.
  4. जोड़ें Proteinase K ०.२ मिलीग्राम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए/एमएल और मिश्रण करने के लिए पलटना: Add २.४ & #181; l के 20 mg/मब Proteinase k से २४० & #181; l के कंट्रोल सैंपल और 4 & #181; l का 20 mg/मब Proteinase k से ४०० & #181; l का चिप नमूना.
  5. में ५५ & #176; ग 2 ज के लिए एक पानी के स्नान में प्रोटीन को पचाने और डीएनए शुद्ध ।
< p class = "jove_title" > 9. चिप-qPCR

< p class = "jove_content" > नोट: डीएनए निष्कर्षण और शुद्धि प्रदर्शन, जैसा कि अनुपूरक सामग्री में वर्णित .

< p class = "jove_content" > नोट: अनुपूरक सामग्री में वर्णित के रूप में sonication दक्षता की पुष्टि करें कि २००-to ५००-बीपी डीएनए अंशों प्राप्त कर रहे है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ) ।

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: एक महत्वपूर्ण कदम के लिए निर्धारित अगर चिप वास्तव में काम किया है । यदि ब्याज के प्रोटीन के लिए जीनोमिक बाइंडिंग साइटों जाना जाता है, प्राइमर मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए यदि ज्ञात साइटों विशेष चिप डीएनए में समृद्ध कर रहे हैं, नकारात्मक के साथ तुलना में नहीं नियंत्रण क्षेत्रों से बंधे होने की उंमीद कैंडीतिथि प्रोटीन । एक उदाहरण के रूप में, यह काम चिप-qPCR H3K4me3 (सक्रिय प्रमोटर citrullinated मार्क) और H3K27me3 (निष्क्रिय प्रमोटर citrullinated मार्क) के लिए प्रदर्शन चिप्स के साथ प्राप्त परिणामों से पता चलता है SNT लड़की भ्रूण से अलग वर्गों में (< मजबूत वर्ग = "HH14" > चित्रा 4a ).

  1. मिश्रण प्रत्येक प्राइमरी जोड़ी (आगे और रिवर्स) एक ही ट्यूब में और 20 & #181 पर एक शेयर एकाग्रता तैयार; मी प्रत्येक प्रयोग डीएच २ हे ( टेबल २ ).
    नोट: प्रत्येक प्राइमरी जोड़ी की दक्षता चिप qPCR विश्लेषण से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
  2. चिप और 20% इनपुट नियंत्रण qPCR अनुकूलन के लिए ८.५ कदम में प्राप्त डीएनए का उपयोग करें ।
    नोट: इनपुट डीएनए आम तौर पर पतला है 20x (शुरू सामग्री का 1% चिप प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया) qPCR विश्लेषण के लिए.
    3. प्रत्येक 10 & #181 के लिए
  3. ; पीसीआर के एल, एक पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित घटक मिश्रण: dna mastermix के लिए, add 2 & #181; l of dH2O, २.५ & #181; l के SYBR ग्रीन मिक्स, और 1 & #181; एल ऑफ डीएनए (चिप या 1% इनपुट से); प्राइमरी के साथ mastermix के लिए , add २.३७५ & #181; l of dH2O, २.५ & #181; l के SYBR ग्रीन मिक्स, and ०.१२५ & #181; l of फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरी मिक्स.
  4. 2 एस के लिए भंवर और संक्षेप में 1 min.
    5. के लिए ९०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा नमूने मिश्रण
  5. वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन (प्राइमरों और साइकिल चालन की स्थिति का एक उदाहरण यहां इस्तेमाल किया तालिका 2 और तालिका 3 , क्रमशः में पाया जा सकता है) ।
    नोट: चिप qPCR डेटा विश्लेषण: चिप संकेतों इनपुट के प्रतिशत के रूप में गणना कर रहे हैं । संक्षेप में, एक बार सीटी मूल्यों प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया के लिए प्राप्त कर रहे हैं, १०० या ६.६४४ चक्र (१०० के log2) की एक कमजोर पड़ने कारक सीटी इनपुट डीएनए प्रतिक्रियाओं के लिए प्राप्त मूल्यों के लिए लागू किया जाता है । फिर, ब्याज की एक दिया क्षेत्र के लिए ( यानी, प्राइमरी जोड़ी), चिप संकेतों के रूप में इस प्रकार की गणना कर रहे हैं:
    समायोजित इनपुट = सीटी (इनपुट)-६.६४४
    चिप संकेत = १०० एक्स पावर (2; समायोजित इनपुट का औसत-सीटी वैल्यू चिप नमूना)
< p class = "jove_title" > 10. चिप-seq पुस्तकालय की तैयारी; मरंमत समाप्त: 4 दिन

  1. को पतला १०० चिप के एनजी-डीएनए में ६० & #181; रेफरेंस बफर की एल (देखें सामग्री टेबल ).
  2. Add ४० & #956; समा मरम्मत का L मिश्रण और पिपेट धीरे 10 बार. & #160;
  3. में 30 & #176; सी एक थर्मल साइकिल चालक पर 30 मिनट के लिए सी ।
  4. भंवर चुंबकीय मोती और जोड़ें १६० & #956; एल अंत मरंमत मिश्रण युक्त ट्यूब के लिए । pipetting द्वारा अच्छी तरह से 10 बार मिश्रण । कमरे के तापमान पर 15 मिनट की मशीन ।
  5. जगह ट्यूब चुंबकीय धारक में और मोतियों के लिए प्रतीक्षा करने के लिए ट्यूब के पक्ष पर बसा..
  6. बंद डालो स्पष्ट तरल ।
  7. चुंबकीय धारक पर ट्यूब रखते हुए, जोड़ २०० & #956; L हौसले से तैयार की ८०% ेतोः.
  8. 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और supernatant त्यागें । एक बार दोहराएँ..
  9. कमरे के तापमान पर चुंबकीय धारक पर 15 मिनट के लिए ट्यूब रखें । एक बार गोली सूखी है, चुंबकीय धारक से ट्यूब हटा दें ।
  10. 20 में गोली reसस्पेंड & #956; resuspension बफर के एल. धीरे से पिपेट 10 बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
  11. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन ।
  12. प्लेस ट्यूब चुंबकीय धारक में और मोतियों की प्रतीक्षा करने के लिए ट्यूब के पक्ष पर बसा । स्थानान्तरण १७.५ & #956; supernatant के L लए एक नई ट्यूब.
< p class = "jove_title" > 11. चिप-seq पुस्तकालय की तैयारी; Adenylate 3 & #39; समाप्त होता है

  1. Add १२.५ & #956; क L क-पट मिश्रण का नया ट्यूब और & #160 तक; अच्छी तरह से धीरे से ऊपर और नीचे 10 बार pipetting मिश्रण । एक थर्मल साइकिल चालक पर ट्यूब प्लेस और निंनलिखित कार्यक्रम के अनुसार मशीन: ३७ & #176; ग के लिए 30 min, ७० & #176; c 5 मिनट के लिए और 4 & #176 पर होल्ड करें; c
< p class = "jove_title" > 12. चिप-seq पुस्तकालय की तैयारी; Ligate adapters

  1. Add २.५ & #956; l का पुनर्निलंबन बफर, २.५ & #956; l के बंधाव mix और २.५ & #956; l उपयुक्त आरएनए एडेप्टर इंडेक्स का. धीरे से ऊपर और नीचे 10 बार pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  2. 30 में 10 मिनट के लिए एक थर्मल साइकिल चालक पर मशीन & #176;.
  3. Add 5 & #956; L ऑफ स्टॉप बंधाव बफर और मिश्रण धन्यबाद by & #160; pipetting 10 गुना.
  4. भंवर चुंबकीय मोती और जोड़ें ४२.५ & #956; L के नमूने के लिए । pipetting & #160 द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं; 10 गुना । कमरे के तापमान पर 15 मिनट की मशीन ।
  5. जगह ट्यूब चुंबकीय धारक में और मोतियों के लिए प्रतीक्षा करने के लिए ट्यूब के पक्ष पर बसा है और बंद डाल स्पष्ट तरल
  6. चुंबकीय धारक पर ट्यूब रखते हुए, जोड़ २०० & #956; L हौसले से तैयार की ८०% ेतोः.
  7. 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और supernatant त्यागें । एक बार दोहराएं ।
  8. चुंबकीय धारक पर ट्यूब रखने के लिए और, 15 मिनट के लिए नमूना हवा सूखी चलो..
  9. चुंबकीय धारक से ट्यूब निकालें और ५२.५ में गोली reसस्पेंड & #956; resuspension बफर के एल । pipetting द्वारा अच्छी तरह से 10 बार मिश्रण । 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन, चुंबकीय धारक में ट्यूब जगह और मोती ट्यूब के पक्ष में बसने के लिए रुको । स्थानान्तरण ५० & #956; क L द साफ supernatant को एक नई ट्यूब.
  10. भंवर चुंबकीय मोती और जोड़ें ५० & #956; L के नमूने के लिए । pipetting & #160 द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं; 10 गुना । कमरे के तापमान पर 15 मिनट की मशीन ।
  11. चुंबकीय धारक में ट्यूब जगह और मोतियों की प्रतीक्षा के लिए ट्यूब के पक्ष पर बसा है और बंद स्पष्ट तरल डालना ।
  12. चुंबकीय धारक पर ट्यूब रखते हुए, जोड़ २०० & #956; L हौसले से तैयार की ८०% ेतोः.
  13. 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और supernatant त्यागें । एक बार दोहराएं ।
  14. चुंबकीय धारक पर ट्यूब रखने के लिए और, 15 min.
    15. के लिए नमूना हवा सूखी चलो
  15. चुंबकीय धारक से ट्यूब निकालें और २७.५ में गोली reसस्पेंड & #956; resuspension बफर के एल । 10 बार pipetting करके अच्छी तरह मिलाएं ।
  16. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन, चुंबकीय धारक में ट्यूब जगह और मोती के लिए ट्यूब के पक्ष में बसने के लिए रुको । अंतरण 25 & #956; क L क्त supernatant का एक नई ट्यूब.
< p class = "jove_title" > 13. चिप-seq पुस्तकालय की तैयारी; डीएनए अंशों के प्रवर्धन

  1. Place १२.५ & #181; एक ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूब में टेंपलेट के एल । Add २.५ & #956; पीसीआर प्राइमरी कॉकटेल, 10 & #956; l का बढ़ा हुआ पीसीआर मिक्स. & #160; pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण 10 बार ऊपर और नीचे । एक थर्मल साइकिल चालक पर ट्यूब प्लेस और तालिका 4 .
    2. में वर्णित शर्तों का उपयोग करें
  2. भंवर चुंबकीय मोती और जोड़ें 25 & #956; L के नमूने के लिए । pipetting & #160 द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं; 10 गुना । कमरे के तापमान पर 15 मिनट की मशीन ।
  3. जगह ट्यूब चुंबकीय धारक में, मोतियों के लिए प्रतीक्षा करने के लिए ट्यूब के पक्ष पर बसा है और बंद स्पष्ट तरल डालना ।
  4. चुंबकीय धारक पर ट्यूब रखते हुए, जोड़ २०० & #956; L हौसले से तैयार की ८०% ेतोः. 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और supernatant त्यागें । एक बार दोहराएं ।
  5. चुंबकीय धारक पर ट्यूब रखने के लिए और, 15 मिनट के लिए नमूना हवा शुष्क करते हैं । चुंबकीय धारक से ट्यूब निकालें और ३२.५ & #956 में गोली reसस्पेंड; resuspension बफर के एल । 10 बार pipetting करके अच्छी तरह मिलाएं ।
  6. पीसीआर ट्यूब कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए प्लेट/ कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर पीसीआर ट्यूब/प्लेट लगाएं, मोतियों को ट्यूब की तरफ से सेटल करने के लिए इंतजार करें और 30 & transfer #956; supernatant के एल एक नई ट्यूब के लिए ।
< p class = "jove_title" > 14. चिप-seq पुस्तकालय की तैयारी; लायब्रेरी मांयता

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: पुस्तकालय की मांयता एक डीएनए और आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली का उपयोग किया जाता है । सीढ़ी की तैयारी: aliquot 1 & #181; l जीनोमिक डीएनए सीढ़ी के पहले ट्यूब में/अच्छी तरह से और जोड़ें 3 & #181; l के नमूना बफ़र.

  1. तैयारी का नमूना: mix 1 & #181; l के पुस्तकालय का नमूना (10-100 एनजी/& #181; l) 3 & #181 के साथ एक ट्यूब में नमूना बफर के एल. स्पिन नीचे और फिर 5 एस के लिए अधिकतम गति पर भंवर नीचे स्पिन ट्यूब के तल पर नमूना स्थिति के लिए ।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली में नमूनों लोड ।
  3. एक बार चलाने के पूरा हो गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए अधिकतम मान पर कंट्रास्ट सेट करके परिणामों का विश्लेषण करें कि कोई भी प्राइमरी dimers नमूने में मौजूद हैं (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 ); प्राइमर dimers १३५ बीपी के आसपास एक बैंड पर अनुरूप होना चाहिए । अगर एक कमज़ोर बैंड भी मौजूद है, तो रेफरेंस बफर को जोड़कर एक दूसरे को क्लीन-अप करने के लिए आगे बढ़ें (देखें सामग्री तालिका ) तक एक ५० & #181; l मात्रा और जोड़ ४७.५ & #181; l सने चुंबकीय मोतियों की माला. यदि नमूने की एकाग्रता बहुत कम है (& #60; 2 एनएम), पीसीआर (स्टेप १३.१) को चलाने के लिए आगे बढ़ें, 15 के बजाय 18 चक्र का प्रयोग करें, १२.५-& #181 के साथ; L मात्रा चरण १२.१६ से छोड़ दिया नमूना.
  4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर qPCR द्वारा व्यक्तिगत रूप से पुस्तकालयों को बढ़ाता है ।
    नोट: पुस्तकालयों की ढाणी में एक एकल पढ़ने के साथ एक sequencer का उपयोग कर अनुक्रम किया जा सकता 1 x ५० nt प्रोटोकॉल पर लक्ष्य 30 M पढ़ता/नमूना.

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Representative Results

हमारे चिप प्रोटोकॉल के प्रदर्शन को समझाने के लिए, हम HH19 चिकन भ्रूण, HH22 चिकन भ्रूण की दाढ़ की हड्डी, और चरण-HH3 चिकन भ्रूण की बाध्यकारी प्रोफाइल की जांच करने के लिए से परित SNT वर्गों का उपयोग चिप seq प्रयोगों का प्रदर्शन किया विभिन्न citrullinated संशोधन (अर्थात, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3, और H3K27me3). एक बार चिप DNAs प्राप्त किया गया था, sonication दक्षता agarose जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन किया गया था इसी इनपुट DNAs (चित्रा 3) । फिर, चिप और इनपुट DNAs चिप के लिए इस्तेमाल किया गया qPCR विश्लेषण के लिए loci पर संवर्धनों को मापने के लिए या तो बंधे या जांच citrullinated संशोधनों (चित्र 4a) से अनबाउंड की उंमीद थी । चित्रा 4a, H3K27me3 और HH19 SNT वर्गों में H3K4me3 संवर्धन के स्तर में दिखाया उदाहरण में qPCR और SOX17 के प्रवर्तक क्षेत्रों के आसपास चिप-SOX2 द्वारा मूल्यांकन किया गया, दो जीन कि निष्क्रिय और SNT में सक्रिय हैं, क्रमशः । जैसा कि उंमीद थी, SOX2 प्रमोटर दृढ़ता से H3K4me3 द्वारा चिह्नित नहीं बल्कि H3K27me3 द्वारा किया गया था, जबकि SOX17 प्रमोटर विपरीत पैटर्न (चित्र 4a) दिखाया । कुछ loci का मूल्यांकन करके, यह बहाव चिप-seq विश्लेषण के लिए बहुत डीएनए सामग्री को खोने के बिना चिप की गुणवत्ता का अनुमान करने के लिए संभव है । एक बार चिप्स की गुणवत्ता की पुष्टि की थी, चिप seq पुस्तकालयों तैयार किया गया और अनुक्रम । प्रतिनिधि loci जांच चिकन भ्रूण ऊतकों में से प्रत्येक के लिए दिखाए जाते हैं: (i) H3K27me3 और H3K4me3 के लिए प्रोफाइल के SNT में HH19 चिकी भ्रूण के आसपास PAX7 (चित्रा 4B); (2) SNAI1 (चित्रा 4c) के आसपास HH22 चिकन भ्रूण की दाढ़ की हड्डी की प्रमुखता में H3K4me2 और H3K27ac के लिए प्रोफाइल; और (iii) TBX3 के आसपास HH3-चरण चिकन भ्रूण में H3K27me3 के लिए प्रोफ़ाइल/TBX5 लोकस (चित्रा 4d) । इन चिप seq प्रयोगों स्पष्ट रूप से वर्णन है कि हमारे चिप प्रोटोकॉल भ्रूण के ऊतकों की एक विस्तृत रेंज में जैविक सामग्री की सीमित मात्रा से epigenomic प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: कम बहुतायत भ्रूण चिकन भ्रूण से अलग नमूनों के लिए चिप प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध सिंहावलोकन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: SNT Microdissection प्रोटोकॉल का संक्षिप्त अवलोकन. अनुप्रस्थ SNT खंड एक HH19 चिकन भ्रूण के बाहु स्तर पर काट रहा है । trypsin उपचार के बाद, गैर तंत्रिका ऊतक यांत्रिक रूप से संदंश का उपयोग कर हटा दिया जाता है । नहीं, notochord; SNT, रीढ़ की हड्डी तंत्रिका ट्यूब; और तो और, somite । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: इष्टतम Sonication का उदाहरण. एक चिकन SNT HH19 नमूना 11 चक्र के लिए sonicated था, पर 30 एस के साथ और ४५ एस पर "उच्च" एक sonicator का उपयोग कर आयाम । crosslinks उलट थे और शुद्ध डीएनए एक १.५% agarose जेल पर हल किया गया था । इष्टतम अंश आकार 11 चक्र, २००-५०० bp से लेकर के बाद मनाया जाता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: चिप द्वारा चिप विश्लेषण के प्रतिनिधि उदाहरण qPCR या चिप-seq । (एक) H3K27me3 (बाएं) और संकेत क्षेत्रों में H3K4me3 (सही) स्तर चिप द्वारा मापा गया qPCR विश्लेषण SNT HH19 चिकी भ्रूण से अलग वर्गों का उपयोग कर प्रदर्शन किया । SOX2 प्रवर्तक क्षेत्र SNT में सक्रिय है और इस प्रकार H3K27me3 द्वारा नहीं बल्कि H3K4me3 द्वारा चिह्नित है; SOX17 प्रवर्तक क्षेत्र SNT में निष्क्रिय है और इसलिए H3K27me3 में नहीं बल्कि H3K4me3 में समृद्ध है; Chr6 नेग चिकन गुणसूत्र 6 में एक intergenic क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । त्रुटि पट्टियां तीन तकनीकी प्रतिकृति से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख) चिप-seq (रानी में H3K27me3, नीले रंग में H3K4me3 में, और इनपुट लाल में) HH14 चिकी भ्रूण के SNTs से प्रोफाइल PAX7 लोकस के आसपास दिखाए जाते हैं । (ग) चिप-seq (नारंगी में H3K4me2, H3K27ac में हरा, और लाल रंग में इनपुट) HH22 चिकी भ्रूण की दाढ़ की हड्डी की प्रमुखता से प्रोफाइल SNAI1 लोकस के आसपास दिखाए जाते हैं । (घ) चिप-seq (लाल रंग में रानी और इनपुट में H3K27me3) HH3 चिकी भ्रूण से प्रोफाइल TBX3/TBX5 लोकस के आसपास दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: स्वचालित आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली का उपयोग चिप seq पुस्तकालय सत्यापन का उदाहरण. इसी चिप-seq पुस्तकालयों से पहले स्वचालित आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली के साथ विश्लेषण किया गया (A) और उसके बाद (B) प्राइमरी डिमर क्लीनअप । प्राइमर dimers (ए) में एक कमजोर ~ १३५ बीपी बैंड के रूप में देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चरणों समस्या संभावित कारण समाधान
1, 2, 3, 4 5 और 11 चिप-qPCR और/या चिप-seq के अनुसार शोर अनुपात करने के लिए कम चिप संकेत ऊतक गुणवत्ता समझौता किया । शीत स्थितियों में सूक्ष्म विच्छेदन करते हैं; अन्यथा क्रोमेटिन निष्ठा से समझौता किया जा सकता था ।
crosslinked नमूनों के केंद्रापसारक के बाद नमूना हानि । 10-20% सीरम या दोहराने केंद्रापसारक कदम के साथ DMEM माध्यम का प्रयोग करें और 10 मिनट के लिए समय में वृद्धि ।
पार से जोड़ने की अवधि । ऑप्टिमाइज़ crosslinking समय । वृद्धि हुई crosslinking बार ऐसे सह उत्प्रेरक और सह दमन है कि डीएनए के लिए सीधे नहीं बांध के रूप में कुछ प्रोटीन, का पता लगाने की सुविधा कर सकते हैं ।
पंजाब में कई धुल के कारण नमूना नुकसान । धुल की संख्या कम हो; केंद्रापसारक कदम १,५०० x जी पर दोहराया जा सकता है
या तो बहुत लंबा या बहुत कम डीएनए आकार में जिसके परिणामस्वरूप उपइष्टतम sonication । sonication शर्तों को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग करें । इष्टतम टुकड़ा २०० से ५०० बीपी को लेकर आकार
एंटीबॉडी चिप के लिए उपयुक्त नहीं है । अंतर्जात प्रोटीन के खिलाफ एक अलग एंटीबॉडी का प्रयोग करें या एक टैग के खिलाफ एक एंटीबॉडी एक exogenously व्यक्त प्रोटीन (उदाहरण के लिए ध्वज, हा) में जोड़ा ।
12 कम या qPCR में कोई संकेत, इनपुट डीएनए के लिए भी इष्टतम प्राइमर प्राइमरी दक्षता और विशिष्टता की जांच करें; डिजाइन नई प्राइमर ।
डीएनए की अपर्याप्त मात्रा नहीं पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री । प्रति qPCR प्रतिक्रिया इस्तेमाल डीएनए की मात्रा में वृद्धि ।

-पृष्ठ = "1" >तालिका 1: प्रोटोकॉल में शामिल विभिन्न चरणों के लिए मार्गदर्शिका समस्या निवारण.

प्राइमरों अनुक्रम
SOX2-च CCTTGCTGGGAGTACGACAT
SOX2-R GCCCTGCAGTACAACTCCAT
SOX17-च CCCTGAACTGTCATGTGTGG
SOX17-R CAAACAGTTGCCTTTGAGCA
Chr6-नेग-च CCGTCAATCTCTGCTTGTGA
Chr6-नेग-R TGGAATCTGCTTGTCACTGC

तालिका 2: चिप के लिए प्राइमर अनुक्रम-qPCR ।

गर्मी
तापमान समय
९५ ° c 5 min
वर्धन
तापमान समय
९५ ° c 10 एस
६० ° c 10 एस ४५
७२ ° c 10 एस चक्र
पिघलने वक्र
तापमान समय
९५ ° c 5 एस
६५ ° c 1 min
ठंडा
४० ° c 30 एस

तालिका 3: पीसीआर चिप के लिए शर्तें-qPCR ।

प्रारंभिक विकार
तापमान समय
९५ ° c 3 min
वर्धन
तापमान समय
९८ ° c 20 एस
६० ° c 15 एस 15
७२ ° c 30 एस चक्र
अंतिम विस्तार
तापमान समय
७२ ° c 5 एस
ठंडा
4 ° c पकड़

तालिका 4: चिप-seq लाइब्रेरी तैयारी के दौरान डीएनए अंशों के प्रवर्धन के लिए पीसीआर शर्तें ।

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Discussion

चिप-seq का उपयोग कर citrullinated संशोधन के Epigenomic profiling के लिए अलग सेलुलर संदर्भों में हड्डीवाला जीनोम के कार्यात्मक एनोटेशन में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है4,5,18। इन epigenomic प्रोफाइल इस्तेमाल किया जा सकता है, अन्य बातों के अलावा, बढ़ाने वाले तत्वों की पहचान करने के लिए, बढ़ाने के विनियामक राज्य को परिभाषित करने के लिए (यानी, सक्रिय, प्रधानमन्त्री, या शिष्ट), और विभिन्न जैविक में प्रमुख सेल पहचान नियामकों को परिभाषित करने के लिए या रोग संदर्भों (जैसे, व्यापक H3K4me3 प्रमोटर डोमेन और सुपर बढ़ाने वाले)6,7,9,10,11,19. हालांकि, चिप परख, जो आम तौर पर कोशिकाओं के लाखों की आवश्यकता है की अंतर्निहित सीमा के कारण, सबसे citrullinated संशोधन प्रोफाइल में उत्पंन किया गया है इन विट्रो सेल लाइनों और कोशिका प्रकार है कि बड़ी मात्रा में vivo में हल किया जा सकता है 4. सबसे हाल ही में, कई चिप-seq प्रोटोकॉल है कि अत्यंत कम सेल संख्या के साथ संगत कर रहे है वर्णित किया गया है, इस प्रकार नाटकीय रूप से सेल प्रकार और ऊतकों में जो epigenomic प्रोफाइल, सिद्धांत रूप में कर सकते हैं, की सीमा का विस्तार13 उत्पंन ,14,15,16. ये नए चिप-seq प्रोटोकॉल प्रत्येक विशिष्ट एड हॉक लाइब्रेरी तैयारी विधियों पर निर्भर करते हैं, जो कम से14,15,16में कुछ मामलों में, गैर-मानक उपकरण और/या रिएजेंट की आवश्यकता होती है ।

यहां, हम एक चिप प्रोटोकॉल है कि मध्यवर्ती सेल संख्या (5 x 104 -5 एक्स 105 कोशिकाओं) अलग भ्रूण ऊतक10से vivo में प्राप्त करने के लिए कम के साथ काम करता है का वर्णन । हमारे चिप परख की संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए, हम कई सामांय चिप के दौरान प्रयोग किया जाता है, ऐसे अनुक्रमिक सेल और परमाणु lysis, जो बहुमूल्य सामग्री का एक प्रगतिशील नुकसान में परिणाम कर सकते है के रूप में कदम समाप्त हो गया है । इस प्रकार, crosslinking के बाद, नमूने एक एकल lysis बफर के साथ इलाज कर रहे हैं और बाद में नमूना हानि को कम करने के लिए sonicated हैं. महत्वपूर्ण बात, हमारे चिप प्रोटोकॉल qPCR विश्लेषण के साथ संगत है, इस प्रकार ब्याज की चयनित loci के epigenomic विश्लेषण को सक्षम करने से । इसके अलावा, हमारे चिप प्रोटोकॉल मानक चिप seq पुस्तकालय तैयारी के तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, इस प्रकार संभावित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के उपयोग के साथ सबसे प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी जा रहा है ।

चिप और चिप-seq प्रोटोकॉल न केवल citrullinated संशोधनों की बाध्यकारी प्रोफाइल की जांच करने के लिए, लेकिन यह भी ऐसे प्रतिलेखन कारकों और सह के रूप में अंय महत्वपूर्ण transcriptional नियामकों के बंधन साइटों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उत्प्रेरक (जैसे, p300 और CBP)20. आमतौर पर, प्रतिलेखन कारकों और सह उत्प्रेरक, जो histones के रूप में प्रचुर मात्रा में नहीं है के लिए चिप्स (और चिप-seq), citrullinated के निशान के लिए चिप्स से काफी अधिक शुरू सामग्री की आवश्यकता है । इस प्रकार, वर्णित प्रोटोकॉल जरूरी सबसे प्रतिलेखन कारकों या सह के लिए काम नहीं कर सकते है उत्प्रेरक जब तक कोशिकाओं को शुरू करने की संख्या में काफी वृद्धि हुई है (उदा, 5 x 105 -5 x 106 कोशिकाओं) और/ कुशल एंटीबॉडी उपलब्ध हैं । फिर भी, आगे अनुकूलन और लगातार पुस्तकालय तैयारी तरीकों में सुधार के साथ, हम आशा करते है कि सीमित सेलुलर सामग्री से चिप seq सबसे विनियामक प्रोटीन के लिए व्यवहार्य हो जाएगा ।

हालांकि हमारे चिप और चिप seq प्रोटोकॉल citrullinated संशोधनों और भ्रूण के ऊतकों की एक किस्म के लिए बड़े पैमाने पर पुष्टि की गई है, हम कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि हम उच्च गुणवत्ता epigenomic प्रोफाइल पैदा करने के लिए आवश्यक विचार को उजागर करना चाहते हैं । सबसे पहले, भ्रूण नमूने क्रोमेटिन अखंडता समझौता नहीं है कि शर्तों के तहत हौसले से अलग होने की जरूरत है । इनमें ठंडी परिस्थितियों में प्रदर्शन करने वाले विच्छेदन या पर्याप्त सामग्री जमा होने तक फ्लैश-जमने वाले नमूनों को शामिल करते हैं । एक और महत्वपूर्ण कदम sonication, जो सही उच्च गुणवत्ता चिप्स प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित करने की जरूरत है । इष्टतम sonication शर्तों अक्सर ऊतक प्रकार, ऊतक की मात्रा, या sonicator इस्तेमाल किया जा रहा के आधार पर बदलती हैं । पिछले नहीं बल्कि कम, एक सफल चिप अंततः ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ विशिष्ट और चिप संगत एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर करता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों का खुलासा नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस प्रोटोकॉल की स्थापना के दौरान अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जन अपैल धंयवाद । राडा-Iglesias प्रयोगशाला में कार्य CMMC अंदर धन, DFG अनुसंधान अनुदान (रा 2547/1-1, रा 2547/2-1, और ते 1007/3-1), UoC उंनत शोधकर्ता समूह अनुदान, और CECAD अनुदान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
BSA powder Carl Roth 3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS) Sigma Aldrich D8537
Tris-HCL pH 8.0 Sigma Aldrich T1503
NaCl Carl Roth 3957.2
EDTA Carl Roth 8043.2
EGTA Carl Roth 3054.2
Na-Deoxycholate Sigma Aldrich D6750-24
N-lauroylsarcosine Sigma Aldrich 61743-25G
Hepes Applichem A3724,0250
LiCl Carl Roth 3739.2
NP-40 Sigma Aldrich I3021-100ml
SDS Carl Roth 1833
Protein G/magnetic beads Invitrogen 1004D
37% Formaldehyde Sigma Aldrich 252549-1L
Glycine
RNase Peqlab 12-RA-03
Proteinase K Sigma Aldrich 46.35 E
Na-butyrate Sigma Aldrich SLB2659V
Proteinase inhibitor Roche 5892791001
SYBRgreen Mix biozym 617004
dH2O Sigma Aldrich W4502
1 Kb ladder Thermofisher SM1333
Orange G Sigma Alrich 03756-25
Agarose Invitrogen 16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) Roth 3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) Gibco 31331-028
Gel loading tips Multiflex A.Hartenstein GS21
qPCR Plates Sarstedt 721,985,202
384 well Sarstedt 721,985,202
1.5 mL tubes Sarstedt 72,706
100 - 1,000 µL Filter tips Sarstedt 70,762,211
2 - 20 µL Filter tips Sarstedt 70,760,213
2 - 200 µL Filter tips Sarstedt 70,760,211
0.5 - 10 µL Filter tips Sarstedt 701,116,210
H3K27me3 antibody Active Motif 39155
H3K27ac antibody Active Motif 39133
H3K4me3 antibody Active Motif 39159
H3K4me2 antibody Active Motif 39141
End Repair Mix Illumina FC-121-4001
Paramagnetic beads Beckman Coulter A63881
Resuspension buffer Illumina FC-121-4001
A-Tailing Mix Illumina FC-121-4001
Ligation Mix Illumina FC-121-4001
RNA Adapter Indexes Illumina RS-122-2101
Stop Ligation Buffer Illumina FC-121-4001
PCR Primer Cocktail Illumina FC-121-4001
Enhanced PCR Mix Illumina FC-121-4001
Genomic DNA ladder Agilent 5067-5582
Elution Buffer Agilent 19086
Sample Buffer Agilent 5067-5582
Library Quantification Kit Kapa Biosystems KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs LSL Rhein Main KN: 15968
Needle (Neoject) A.Hartenstein 10001
Syringe (Ecoject 10 mL) Dispomed witt oHG 21010
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Hermle Z 216 MK
Thermoshaker ITABIS MKR13
Sonicator Active Motive EpiShear probe sonicator
Sonicator Diagenode Bioruptor Plus
Rotator Stuart SB3
Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes Eppendorf N/A
Timer Sigma N/A
Magnetic holder Thermo Fisher DynaMag-2 12321D
Table spinner Heathrow Scientific Sprout
Mixer LMS VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler Roche Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system Agilent Agilent 4200 TapeStation System
Forceps Dumont 5-Inox-H
Perforated spoon World precision instruments 501997

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १२६ क्रोमेटिन immunoprecipitation citrullinated संशोधन चिप-seq epigenomic भ्रूण के नमूने
क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप) कम बहुतायत भ्रूण के नमूनों के लिए प्रोटोकॉल
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Rehimi, R., Bartusel, M., Solinas,… More

Rehimi, R., Bartusel, M., Solinas, F., Altmüller, J., Rada-Iglesias, A. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples. J. Vis. Exp. (126), e56186, doi:10.3791/56186 (2017).

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