Summary
Deze publicatie beschrijft de fabricage van een apparaat van de orgel-on-chip met geïntegreerde elektroden voor directe kwantificering van signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER). Voor een validatie, de bloed - hersen barrière werd geïmiteerd binnen dit microfluidic apparaat en zijn functie als barrière werd gecontroleerd. De gepresenteerde methoden voor de integratie van de elektrode en directe kwantificering van de TEER zijn algemeen toepasbaar.
Abstract
Organen-op-chips, in vitro modellen waarbij de cultuur van (menselijke) weefsels binnen microfluidic apparaten, zijn snel opkomende en belofte aan nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van de menselijke gezondheid en ziekte onderzoek. Karakteriseren de barrièrefunctie van cel lagen binnen orgel-on-chip apparaten gekweekt, wordt vaak signaalcomplexen of transepithelial elektrische weerstand (TEER) gemeten. Te dien einde zijn elektroden meestal geïntegreerd in de chip door Microbewerking methoden om meer stabiele metingen dan met handmatige invoer van elektroden in de inhammen van de chip. Echter deze elektroden vaak visueel onderzoek van de bestudeerde cellaag belemmeren of vereisen dure cleanroom processen voor fabricage. Deze beperkingen wilt opheffen, bevat het hier beschreven apparaat vier gemakkelijk geïntegreerde elektroden die zijn geplaatst en vaste buiten het gebied van cultuur, visuele inspectie mogelijk te maken. Met behulp van deze vier elektroden die de weerstand van zes meting paden kan worden gekwantificeerd, waaruit de TEER kan worden rechtstreeks geïsoleerd, onafhankelijk van de weerstand van kweekmedium gevulde microchannels. De bloed - hersen-barrière is gerepliceerd in dit apparaat en zijn TEER was gecontroleerd zodat de toepasbaarheid van het apparaat. Deze chip, de geïntegreerde elektroden en de methode voor TEER sleutelbepaling gelden over het algemeen in organen-op-chips, zowel om na te bootsen andere organen of te integreren in bestaande orgel-on-chip systemen.
Introduction
Organen-op-chips zijn snel ontpopt zich als een nieuwe en veelbelovende klasse van in vitro weefsel modellen. 1 in deze modellen, cellen worden gekweekt in microfluidic-apparaten die zijn ontworpen op een zodanige wijze dat zij de fysiologische communicatie van die cellen bootsen. 1 , 2 dit resulteert in meer realistische fysiologische of pathologische gedrag van die cellen dan conventionele in vitro modellen van eenvoudig ontwerp en basisfunctie kan verwachten. 3 , 5 , 6 voorts organen-op-chips zorgen voor een beter beheersbare omgeving dan in vivo modellen en kunnen nemen zowel in gezonde als zieke weefsels van menselijke oorsprong om te repliceren getrouw zowel menselijke fysiologie en pathologie. De onlangs samengevatte vooruitgang in de ontwikkeling van blood - brain belemmeringen op chips (BBBs-op-chips) tonen aan dat het veld snel bewegende vooruit. 7
Een ander voordeel van organen-op-chips is dat ze in staat stellen real-time en doorlopende bewaking van het weefsel gekweekte binnen in het apparaat door microscopie, on-line biochemische analysen en geïntegreerde sensoren. 1 , 2 bijvoorbeeld, het meten van signaalcomplexen of transepithelial elektrische weerstand (TEER) is een krachtige methode om het toezicht op niet-gebeurt de ontwikkeling en verstoring van de barrière-vormende weefsels. 8 , 9 , 10 TEER is de elektrische weerstand over een cellulaire barrière en is daarom een indicatie van de barrière integriteit en de permeabiliteit. 10 in organen-op-chips, cellulaire barrières worden algemeen gekweekt op een membraan die scheidt twee fluidic kanalen, die vertegenwoordigt het apicale en basolaterale compartimenten van dat weefsel barrière. In dergelijke spaanders, kunnen TEER metingen gunstig plaatsvinden met elektroden ingevoegd in de inhammen en de afzetmogelijkheden van de twee kanalen. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 echter handmatige invoer en herintegratie van de elektroden kunnen gemakkelijk resulteren in plaatsing fouten en dus variaties in de gemeten weerstand als bijvoorbeeld de verschillen in de weerstand van langere of kortere paden door microchannels aanzienlijk worden vergeleken met de cel barrière weerstand. 16 te elimineren herintegratie fouten, apparaten met geïntegreerde elektroden zijn voorgesteld. Echter, de meeste van deze geïntegreerde elektroden blokkeren de weergave bij de inspectie van de weefselkweek17,18,19,20,21 en/of vereisen gespecialiseerde Cleanroom procédés voor de fabricage. 17 , 22
Het orgel-on-chip-apparaat zoals beschreven in deze publicatie, voor het eerst toegepast in een eerdere publicatie,16 combineert de stabiliteit van geïntegreerde elektroden met zicht op de gemeten cellaag en gemakkelijk fabricage. Het ontwerp en de fabricage van deze chip is afgebeeld in Figuur 1. Kortom, dit apparaat bestaat uit twee Polydimethylsiloxaan (PDMS) delen met kanaal opdrukken die zijn samen gebonden lekkage-vrij met een polycarbonaat membraan met 0.4 µm poriën tussendoor. Vier platina draad elektroden zijn ingevoegd en vastgesteld op zijn plaats met een photocurable lijm goed buiten het gebied van cultuur. Al deze stappen fabricage kan plaatsvinden met algemene laboratoriumapparatuur, zonder de noodzaak voor een cleanroom-omgeving. Op de top van dit, zes impedantie metingen kunnen worden gedaan met behulp van deze vier elektroden, waardoor directe isolatie van de gemeten TEER, onafhankelijk van de weerstand van de microchannels voorafgaand aan de doorsnede en dus het minimaliseren van de invloed van niet-biologische variaties in het systeem zoals (her) plaatsingskosten fouten. 16
Om te laten zien de toepasselijkheid van dit apparaat en de directe metingen van de TEER, dat de bloed - hersenbarrière (BBB) in deze chip is gerepliceerd. Deze biologische barrière bestaat uit gespecialiseerde endotheliale cellen en regelt vervoer tussen bloed en hersenen aan hersenen homeostase bieden. 23 , 24 om na te bootsen de BBB, het bovenste kanaal van het microfluidic-apparaat was bekleed met menselijke cerebrale microvasculaire endotheliale cellen van de cellijn van de hCMEC/D3 (vriendelijk geleverd door Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Parijs, Frankrijk). 25 de onderhavige methode is, echter meer in het algemeen van toepassing op elk apparaat orgel-on-chip met twee compartimenten, waardoor directe TEER bepaling gemakkelijk met geïntegreerde elektroden.
In dit manuscript, voor het eerst het fabricageproces van het orgel-on-chip-apparaat met geïntegreerde elektroden is beschreven. Volgende, de seeding procedure en cultuur van de endotheliale cellen van de hersenen binnen in het apparaat wordt uitgelegd, alsook de metingen van de TEER op de chip. Representatieve metingen van de TEER worden weergegeven in de sectie resultaten en gegevensverwerking wordt verduidelijkt. Tot slot is de barrièrefunctie van de BBB-on-chip, gedurende 3 dagen, gevolgd gepresenteerd, met inbegrip van de toepasselijkheid van de gepresenteerde apparaat en methoden voor het controleren van TEER.
Protocol
1. fabricage van het orgel-on-chip-apparaat
- maken een PDMS replica van een schimmel met de kanaal ontwerpen, vervaardigd met behulp van standaard fotolithografie technieken, en het verkrijgen van het PDMS delen van de microfluidic-chip.
- Wegen ongeveer 27 g PDMS baseren agent en 2.7 g uithardende agent, moet de massa verhouding 10:1. Dit is goed voor een 3 mm dikke PDMS plaat over een mal met 130 mm (5 inch) diameter. Deze componenten meng.
- Ontgas het mengsel in een exsiccator gedurende ongeveer 45 min. tot het verwijderen van luchtbellen.
- Ondertussen de vloeibare PDMS mengsel de mal voorbereiden door duidelijke tape rond de schimmel vast te houden of plaats de schimmel in een houder geschikt wafer.
- Giet de ontgaste PDMS mengsel op de mal. Als alle lucht bubbels bleef in het PDMS mengsel of aan het oppervlak van de schimmel, ontgas het weer voor ongeveer 30 min.
- Genezen het PDMS mengsel in een oven bij 60 ° C gedurende 4 h. toestaan om af te koelen.
- In een cross-flow kap, trekken de uitgeharde PDMS van de schimmel; de mal onmiddellijk kan worden gebruikt voor het maken van de replica's meer PDMS.
- Snij de PDMS replica in aparte boven- en onderkant chip delen snijden lijnen met de PDMS.
- Punch vier gaten in de bovenste delen met behulp van een punch scherpe biopsie met 1 mm diameter formulier inhammen en verkooppunten. Punch van binnen naar buiten om te voorkomen dat PDMS puin verzamelen in de chip. Betrekking hebben op de delen van de chip met duidelijke tape om hen te beschermen tegen stof.
- Polycarbonaat membranen van Transwell inzetstukken gesneden in vierkanten van ongeveer 3 × 3 mm 2.
- Assemble een poreuze membraan lekkage-gratis tussen twee PDMS delen om het monteren van een twee-laag apparaat met een poreuze membraan geïnterfacet.
Opmerking: Dit protocol is aangepast van Griep et al. 19 en Chueh et al. 26- voorbereiden een PDMS/tolueen mortier met behulp van 0.7 g van PDMS basis agent, 0,07 g uithardende agent en 540 µL van tolueen, resulterend in een 5:3-gewichtsverhouding. Vortex de mortel grondig.
- Spin-jas 200 µL van mortel op een glas dekglaasje aan bij 1500 t/min voor 60 s (ramped op 1000 rpm/s) te verwerven van een dunne, uniforme laag mortel.
- Breng een dunne laag mortel van het dekglaasje aan op een deel van de onderste en een bovenste deel van de chip met een Inktrol. Het onderste gedeelte zet in een oven-safe schotel.
- Met een pincet, dompel de randen van een membraan in de mortel spin beklede en breng dit zorgvuldig in het midden van de onderste part.
- Zorgvuldig plaats het bovenste gedeelte op het onderste deel terwijl aandacht te besteden aan de uitlijning.
Opmerking: Druk op de chip niet doen uitoefenen en schuift niet het bovenste gedeelte over het onderste deel om te voorkomen dat mortel van invoeren van de kanalen en verstoppingen van de membraan. - Dekking van de chips inhammen met duidelijke tape om te voorkomen van de stof uit het invoeren van de chip en bak ze op 60 ° C gedurende 3 h.
- Elektroden te integreren in de kanalen kant.
Opmerking: Dit protocol is aangepast van Griep et al. 19 en Douville et al. 18- platina-draad in stukjes van ongeveer 2 cm. Clean cut door dompelen hen in aceton voor 30 min. spoelen met water en ethanol en laten drogen.
- In de kap van een cross-flow, een chip te plaatsen op een kunststof schotel. Steek vier platina draden in de kanalen van de elektrode van een chip met behulp van een pincet en buig ze naar beneden op de kunststof schotel om fixatie op de schotel in een latere stap. Steek de draden 0,7-1 mm in de cultuurzender, voorbij de T-vormige kanaal kruising.
- Toepassen van een daling van UV-uithardende lijm bij de ingang van de elektrode-kanaal en laat de lijm te vullen het kanaal rond de elektrode door capillaire krachten.
- Zet UV en genezen de lijm wanneer het einde van het elektrode-kanaal bereikt.
Let op: Kijk niet in de UV-lichtbron zoals dit schade aan uw ogen toebrengen kan. - Fixeren de vier geïntegreerde elektroden aan de kunststof schotel met een twee-componenten epoxy lijm. Hierdoor gemakkelijker behandeling van de elektroden tijdens de metingen zonder het risico van het trekken van de elektroden van de chip.
- Betrekking hebben op de chips met duidelijke tape en bak ze op 60 ° C voor 2 h. toestaan te koelen en bewaren van stofvrije tot gebruik. Op deze manier kunnen zij veilig opgeslagen voor maximaal een maand.
2. Cultuur van hersenen-afgeleide endotheliale cellen op de chip
- jas de chips ter bevordering van de bijlage van de cel.
- Vul beide kanalen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) te nat hen vóór de invoering van de reagentia. Kijk onder een Microscoop als er luchtbellen in de kanalen. Zo ja, verwijderen door te spoelen met extra PBS.
- Vul beide kanalen met 30 µL van 20 µg/mL menselijke fibronectine in PBS. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur. Controleren op luchtbellen en, indien nodig, spoel de kanalen met PBS en bijvullen met fibronectine oplossing.
- Spoel de chips met endothelial groeimedium en incubeer hen bij 37 ° C en 5% CO 2 in een incubator voor 2 h.
- Meten de TEER van de lege chips zoals beschreven in stap 3 om ervoor te zorgen dat alle van de elektroden staan in direct contact met vocht in de kanalen. In lege spaanders, typische TEER waarden zijn 0-1 Ω cm 2.
- Zaad van cellen in de bovenste kanaal.
- Verwijderen van het kweekmedium uit een cultuur kolf (75 cm 2 cultuur gebied) met een confluente enkelgelaagde van menselijke cerebrale microvasculaire endotheliale cellen (hCMEC/D3).
- Wassen de cellen met PBS. Voeg 2 mL trypsine-EDTA 0,05% en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 2-5 minuten totdat de cellen hebben losgemaakt van de cultuur-kolf.
- Deactiveren de trypsine met kweekmedium aangevuld met 20% foetale runderserum (FBS). Cellen tellen en het berekenen van het totale aantal cellen in suspensie.
- Ondertussen centrifugeren van de cellen van de hCMEC/D3 bij 390 x g gedurende 5 minuten en verwijder supernatant.
- Resuspendeer de pellet van de cel in de juiste hoeveelheid endothelial groeimedium (BAVA-2) om te komen tot een concentratie van 5 x 10 6 cellen/mL. Dit resulteert in een seeding dichtheid van 2 x 10 5 cellen/cm 2 in een chip.
- Langzaam 30 µL van het goed gemengd celsuspensie Pipetteer in het bovenste kanaal en de pipet uit de inlaat in een vloeiende beweging te verwijderen terwijl het nog steeds druk uit te oefenen.
- Check de seeding dichtheid onder een microscoop. Een gelijkmatige verdeling van de cellen in de bovenste kanaal moet worden bereikt.
- De spaanders bij 37 ° C en 5% CO 2 voor ten minste 1 h. spoelen van niet-ingeschrevenen cellen met endothelial kweekmedium Incubate.
- Handhaven van de op de chip endothelial cultuur.
- Twee keer per dag, voeg kweekmedium gevulde pipet tips als stuwmeren in de inhammen en het medium binnen de chip vervangen door zwaartekracht-gedreven stroom.
Opmerking: Om te voorkomen dat de luchtbellen uit het invoeren van de microchannels en de vernietiging van de cellaag, zorg ervoor dat vloeistof-vloeistof contact tussen het uiteinde van de pipet en de vloeistof op de top van de chip te maken voordat u de tip invoegt in een inham. Dit kan worden vergemakkelijkt door het toevoegen van een kleine daling bij het in / uitlaat vóór Pipetteer invoeging. - Ook toevoegen pipette uiteinde stuwmeren in de verkooppunten om te voorkomen dat de kanalen drogen.
- Broeden de spaanders bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Twee keer per dag, voeg kweekmedium gevulde pipet tips als stuwmeren in de inhammen en het medium binnen de chip vervangen door zwaartekracht-gedreven stroom.
3. TEER metingen op de chip
- th instellene TEER meting apparaat, bestaande uit een versterker lock-in en een sonde kabel circuit zoals is opgegeven in Van der Helm et al. 16 als alternatief, potentiostats of impedantie analysers zijn ook geschikt voor deze TEER impedantie gebaseerde metingen.
- Nemen de chip uit de incubator en laat ze tot kamertemperatuur voor ten minste 10 min. verwijderen elke vloeistof uit de kunststof schotel rond de elektroden om te voorkomen dat elektrode overbruggen buiten de chip.
- Nemen de impedantie-spectrum van 200 Hz tot 1 MHz voor elke combinatie van twee elektroden, wat resulteert in 6 impedantie spectra per spaander in slechts 5-10 min. Check als de impedantie spectra hebben de verwachte groottes en vormen voor het valideren van de TEER-meting, als is beschreven in de sectie resultaten.
- Zet de chip terug in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 na het beëindigen van de meting.
- Verwerken van de verkregen impedantie spectra om te komen tot een genormaliseerde waarde van TEER.
- Krijgen de gemeten weerstand
tussen de elektroden 
en 
, zoals aangegeven in figuur 2B en D, van de resistieve plateau op 10 kHz in de overeenkomstige impedantie spectra. - Berekenen de zes gemeten weerstand overeenkomt met één chip in één keer met TEER punt met behulp van de vergelijking van Figuur 2 g 16:
in deze vergelijking,
is het gebied van de cultuur waardoor het verzet werd gemeten, < img alt = " Vergelijking 5"src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ > is de weerstand van de cellulaire barrière en het membraan, 
, 
, 
en 
zijn de weerstand waarden gemeten door de cellulaire barrière en 
en 
zijn de weerstand waarden gemeten in de rechte kanalen. 16 de vergelijking is afgeleid van het equivalent circuit geïllustreerd in figuur 2C.
- Krijgen de gemeten weerstand
- De lege TEER van de TEER op alle tijdstippen te verkrijgen van de ontwikkeling van de TEER in tijd aftrekken.
tussen de elektroden 
en 
, zoals aangegeven in figuur 2B en D, van de resistieve plateau op 10 kHz in de overeenkomstige impedantie spectra.
is het gebied van de cultuur waardoor het verzet werd gemeten, < img alt = " Vergelijking 5"src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ > is de weerstand van de cellulaire barrière en het membraan, 
, 
, 
en 
zijn de weerstand waarden gemeten door de cellulaire barrière en 
en 
zijn de weerstand waarden gemeten in de rechte kanalen. 16 de vergelijking is afgeleid van het equivalent circuit geïllustreerd in figuur 2C.Representative Results
De schematische resultaten van elektrische impedantie spectroscopie door middel van een chip zonder cellen (vaste lijn) en een cellulaire barrière (gestippelde lijn) worden weergegeven in figuur 2A. Vier regio's kunnen worden geïdentificeerd, elk gedomineerd door een specifieke elektrische component. Onder ongeveer 1 kHz domineert de dubbellaagse capaciteit op de elektrode-cultuur middellange interface, gekenmerkt door een negatieve helling voor impedantie omvang en een faseverschuiving naderen-90 °. De frequentie waarop de dubbellaagse capaciteit domineert, is afhankelijk van het gebied van de elektrode blootgesteld aan kweekmedium. De resistieve plateau boven 1 (zonder cellen) of 100 kHz (met cellen) met een faseverschuiving dicht bij 0 °, komt overeen met de weerstand van het kweekmedium binnen de microfluidic kanalen, afhankelijk van de lengte van het kanaal en oppervlakte van de dwarsdoorsnede en binnen de membraan, afhankelijk van de porositeit en de dikte. Bij het meten door een cellulaire barrière, wordt een extra resistieve plateau tussen 1 en 10 kHz gezien evenals een lokaal maximum in het fasediagram. Deze regio is van cruciaal belang voor de bepaling van de TEER als een duidelijke stijging van de impedantie resultaten wanneer cellen aanwezig in het gemeten pad zijn, en daarom het "gebied van belang" wordt genoemd. De extra helling tussen 10 en 100 kHz correspondeert met de cel barrière capaciteit, die voortvloeit uit de elektrisch isolerende lipide dubbelgelaagde membranen en is afhankelijk van de totale oppervlakte van de cellaag. 27 de grenzen van deze regio's, alsmede de impedantie grootheden zijn afhankelijk van het systeem wordt bestudeerd en wijzigen met, onder andere dingen, kanaal afmetingen, kweekmedium geleidbaarheid, elektrode positie en celtype. Om verder te lezen over de theorie en de praktijk van de elektrische impedantie spectroscopie op barrière-vormende weefsels het review artikel door Benson et al. wordt aanbevolen. 28
Representatieve gegevens van de TEER-metingen weergegeven voor zowel een lege chip en een chip met een hCMEC/D3 hersenen endothelial cellaag in figuur 2E en 2F, respectievelijk. Kortom, impedantie spectroscopie werd uitgevoerd met behulp van zes metingen met vier elektroden: twee metingen via cel kweekmedium gevulde kanalen (ononderbroken lijnen) en vier metingen via de kanalen evenals het membraan en - indien aanwezig - de cellulaire barrière (onderbroken lijnen). Deze zes meting paden kunnen worden geïdentificeerd in het gelijkwaardige resistieve circuit van figuur 2B, die is afgeleid van de Schematische doorsnede (figuur 2C) en bovenaanzicht (figuur 2D). De lege chip metingen (figuur 2E) tonen de typische vorm van impedantie spectra zonder cellen, zoals geïllustreerd in figuur 2A. De metingen door de cellulaire barrière (onderbroken lijnen in de figuur 2F) lijken op de typische impedantie spectra met cellen in de figuur 2A. Opmerking dat zowel de omvang van de impedantie en de fase verschuiving verhoging naar 1 MHz. Dit is de typische reactie van de setup van de meting bij hoge frequenties en is niet van experimentele oorsprong.
Om te bepalen van de TEER die met behulp van deze experimentele impedantie spectra, wordt eerst de weerstand gemeten chip bepaald, dat is de totale weerstand van de cellaag, kanalen en membraan. Te dien einde een geschikte uitlezing frequentie in de regio van belang werd gekozen, die op de lokale maximum in de fase plot met cellen en dicht bij de faseverschuiving 0 ° zonder cellen: 10 kHz. Met de zes gemeten weerstanden bij 10 kHz, zoals gemeten tussen de vier elektroden, wordt de TEER direct berekend met behulp van de vergelijking in figuur 2F.
Om aan te tonen dat het gepresenteerde apparaat geschikt is voor het bepalen van de TEER in organen-op-chips, de BBB is gerepliceerd binnen de chip en zijn TEER was gecontroleerd gedurende 3 dagen van cultuur. In figuur 3A die de gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) TEER ook voor vier BBBs-op-chips weergegeven wordt, resulterend in een plateau van 22 ± 1,3 Ω cm2, die vergelijkbaar is met de TEER van deze cellijn zoals gemeld in de literatuur. 29 verder, na beëindiging van het experiment en fluorescentie kleuring van de kernen, blijkt dat de hersenen endotheel een voortdurende enkelgelaagde binnen in het apparaat (figuur 3B vormden). Immunofluorescentie kleuring van strakke junction eiwit Zonula Occludens-1 (ZO-1) is gebleken dat de endotheliale cellen van hersenen hun BBB-specifieke fenotype onderhouden en strakke regulates complexen gevormd.
Figuur 1: Constructie- en montage van het apparaat van de orgel-on-chip met geïntegreerde elektroden.
(A) geëxplodeerde weergave van de microfluidic-chip, bestaande uit een bovenste gedeelte van het PDMS met het bovenste kanaal (TC), een membraan (M) en een bodem PDMS deel met het kanaal van de bodem (BC). Vier platina draad elektroden (E1-4) zijn ingevoegd en vast in de zijde-kanalen. In het bovenste kanaal en op de top van het membraan, werden hCMEC/D3 hersencellen endothelial gekweekt om te repliceren de BBB. (B) gemonteerd chip, bevestigd aan een kunststof schotel. Herdrukt en aangepast met toestemming van Elsevier. 16 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: De impedantie van de representatieve gegevens en bepaling van TEER.
(A) schematische impedantie spectrum weergegeven: impedantie omvang (Ω) en faseverschuiving (°) ten opzichte van frequentie (Hz), typisch voor elektrische impedantie spectroscopie op chips zonder cellen (vaste lijn) en met cellen (gestippelde lijn). Er zijn vier belangrijkste gebieden, elk gedomineerd door: de capaciteit van de dubbele laag op de elektroden, het kweekmedium verzet, de cel barrière weerstand en de capaciteit van de celmembraan. De "gebied van belang" geeft aan waar de bijdrage van de cellaag kan worden gekwantificeerd (rode pijl). (B) gelijkwaardig resistieve circuit van de chip, met de bovenste kanaal weerstanden R1 en R3, de onderkant kanaal weerstanden R2 en R4 en de membraan en weerstand Rmvan de barrière van de EG. (C) schematische dwarsdoorsnede toont de endotheliale cellen (EG) gekweekt in het bovenste kanaal. (D) schematisch bovenaanzicht van de BBB chip met de configuratie van de elektroden en het gebied van de cultuur van 0,25 mm2 waardoor de impedantie wordt gemeten. (E) vertegenwoordiger impedantie spectra van een lege chip gevuld met cel kweekmedium. (F) vertegenwoordiger impedantie spectra van een chip in welke hCMEC/D3 brain endotheliale cellen cultuur waren voor 3 dagen. (G) formule voor het berekenen van TEER uit de gemeten weerstand tussen alle zes combinaties van vier elektroden. Herdrukt en aangepast met toestemming van Elsevier. 16 gelieve Klik hier om een grotere versIon van dit cijfer.
Figuur 3: Vertegenwoordiger TEER ontwikkeling van BBB-on-chip.
(A) gemiddelde TEER ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) van vier BBBs-op-chips cultuur gedurende drie dagen, een plateau op 22 ± 1,3 Ω cm2 (gemiddelde ± SEM) te bereiken. Ter vergelijking uitmaakt gegevens van lege chips, marginale variatie en deviatie van 0 Ω cm2 in dezelfde periode vergeleken met de variatie en TEER waarde van chips met cellen tonen. (B) fluorescentie microscopie van gebeitst kernen bleek een continue enkelgelaagde van endotheel, zowel op PDMS en het membraan op de locatie die is aangegeven in de inzet. (C) immunofluorescentie bleek de aanwezigheid van strakke junction eiwit Zonula Occludens-1, die aangeeft dat de strakke kruispunten BBB-specifieke tussen de cellen aanleiding tot de gemeten TEER geven. Herdrukt en aangepast met toestemming van Elsevier. 16 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
In dit manuscript, werden de engineering van een orgel-on-chip-apparaat en de directe bepaling van de signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER) van een cellulaire barrière gekweekt in het apparaat gepresenteerd. De onderhavige methode elektroden zonder cleanroom apparatuur en de directe TEER bepaling met behulp van vier elektroden te integreren is van toepassing op elk apparaat orgel-on-chip met twee compartimenten van de microfluidic. De indeling van de chip en de meetkunde kunnen worden aangepast aan de eisen van de beoogde experimenten, zolang de vier elektroden worden gescheiden in twee compartimenten. De vier elektroden kunnen zelfs gunstig in de inhammen van bestaande fiches, worden ingevoegd, op voorwaarde dat ze zijn gefixeerd op zijn plaats voor de duur van de zes metingen. De lekkage-vrije hechting-methode kan worden geoptimaliseerd voor verschillende membranen en kanaal meetkundes door het veranderen van de verhouding tussen de PDMS/tolueen. Een hoger gehalte aan tolueen resulteert in een dunnere spin-gecoate laag mortel26 en wellicht meer geschikt voor ondieper en smaller kanalen in de PDMS delen. Een lagere tolueen inhoud resultaten in een dikkere Mortier laag26 en wellicht meer geschikt voor dikkere membranen tussen de PDMS onderdelen omsluiten.
Zoals kan worden gezien in de schematische impedantie spectra in figuur 2A en de experimentele spectra in figuur 2E en 2F, worden de impedantie metingen beïnvloed door de capaciteit van de dubbele laag op de elektrode-medium-interface. Als gevolg van de geringe omvang van de elektroden binnen de microchannels, kan de dubbele laag capaciteit domineren over de resistieve plateau van de cellulaire barrière in impedantie spectra, complicerende kwantificering van de TEER. Om dit te verhelpen, de elektroden kunnen worden ingevoegd verder in de kanalen van de cultuur voor fixatie. Dit zal het verhogen van de oppervlakte van de elektrode blootgesteld aan het kweekmedium en daarmee de dubbellaagse capaciteit ook zal toenemen. Dit resulteert in een verschuiving van de capacitieve helling aan lagere frequenties, zodat de resistieve plateau van de cellulaire barrière gemakkelijker herkend en gekwantificeerde worden kan. Hoewel de weerstand van het gemeten pad tussen twee elektroden kleiner worden zal, zal dit geen invloed op de kwantificering van de TEER na de onderhavige methode.
Tijdens het meten via de cellulaire barrière, is het mogelijk dat het extra resistieve plateau niet wordt herkend. Dit kan zijn het resultaat van een fluidic verbinding tussen de twee kanalen, bijvoorbeeld als het membraan is slecht omsloten door de mortel, wat leidt tot een gemeten pad rond de cellulaire barrière. Daarnaast kan er elektrische overbruggen buiten de chip als de elektroden zijn verbonden door een druppel van kweekmedium. Dit wordt doorgaans gecombineerd met een lagere impedantie van de gemeten en kan worden opgelost door het verwijderen van deze brug van kweekmedium. Tot slot, als er geen resistieve plateau en de gemeten impedantie ordes van grootte hoger is dan verwacht, kan er een losse verbinding in de bedrading of op de stroombron.
In de toekomst kan de fysiologische relevantie van de huidige BBB-on-chip worden verhoogd door het blootstellen van de endotheliale cellen als u wilt schuintrekken stress op fysiologische niveaus, die aan het bevorderen van BBB differentiatie en verhoging van dichtheid van de barrière is gemeld en is moeilijk te bereiken in conventionele in vitro modellen. 29 het kanaal van de onderkant van de gepresenteerde apparaat biedt bovendien een geschikt compartiment voor hersenen-afgeleide cellen te samen met het endotheel worden gekweekt. Dit ook naar verwachting toenemen de barrièrefunctie en maakt het ook mogelijk de studie van de complexe interacties tussen de relevante celtypes onder pathologische omstandigheden. 29
Kortom, het orgel-on-chip-apparaat zoals beschreven in deze publicatie kan worden vervaardigd met behulp van de gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden en wordt getoond aan het bieden van directe TEER metingen met behulp van vier geïntegreerde elektroden die visuele inspectie van de bestudeerde cel niet belemmeren laag. De toepasselijkheid van dit apparaat op het gebied van de organen-op-chips werd aangetoond door het nabootsen van de BBB in deze chip en controle van de TEER tijdens de periode van de cultuur. Een gastheer van andere organen (barrier) kan worden geïmiteerd door andere relevante celtypes in deze chip. Bovendien, kan de methode voor het meten van de TEER gemakkelijk worden toegepast in andere twee compartiment-orgel-on-chip apparaten om tot reproduceerbare en zinvolle TEER waarden die kunnen worden vergeleken op apparaten en systemen te komen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen dankbaar Johan Bomer voor de fabricage van de schimmel en Mathijs Bronkhorst voor vruchtbare discussies en hulp bij gegevensvertegenwoordiging.
Dit onderzoek werd gefinancierd door: SRO biomedische Microdevices van L.I. Segerink, MIRA Instituut voor biomedische technologie en technische geneeskunde, Universiteit Twente; SRO organen-op-Chips van A.D. van der Meer, MIRA Instituut voor biomedische technologie en technische geneeskunde, Universiteit Twente; en VESCEL, ERC Advanced Grant A. van den Berg (grant nr. 669768).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Scotch Magic tape | 3M | ||
| Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
| UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
| hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
| Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Oven | Binder | 9010-0190 | |
| Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
| UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
| Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Incubator | Binder | CB E2 150 | |
| Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Van der Meer, A. D., Van den Berg, A.
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
- Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
- Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).
- Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
- Deosarkar, S. P., et al. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725 (2015).
- Ferrell, N., et al. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Partyka, P. P., et al. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).
- Van der Helm, M. W., et al. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Douville, N. J., et al. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weksler, B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Chueh, B. -H., et al. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).
- Golowasch, J., Nadim, F. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
