Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Published: September 26, 2017 doi: 10.3791/56334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1, 1
1BIOS Lab on a Chip group, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, MESA+ Institute for Nanotechnology and Max Planck Center for Complex Fluid Dynamics, University of Twente, 2Microsystems, Eindhoven University of Technology, 3Applied Stem Cell Technologies, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente

Summary

פרסום זה מתאר את הזיוף של המכשיר איברים על שבב עם אלקטרודות משולב על כימות ישירה של ההתנגדות החשמלית transendothelial (TEER). עבור אימות, מחסום הדם - מוח היה חיקה בתוך המכשיר הזה microfluidic, תפקידה מחסום היה במעקב. שיטות הציג אלקטרודה ואינטגרציה כמת TEER ישירה חלים בדרך כלל.

Abstract

האיברים בצ'יפס, במבחנה מודלים המערבים את התרבות של רקמות (האנושי) בתוך מכשירים microfluidic, הן במהירות המתעוררים הבטחתה לספק שימושי חקר כלי לימוד מחלה ובריאות האדם. כדי לאפיין את הפונקציה מכשול של שכבות תאים תרבותי בתוך איבר על שבב התקנים, נמדד לרוב transendothelial או transepithelial ההתנגדות החשמלית (TEER). למטרה זו, אלקטרודות בדרך כלל משולבים לשבב על ידי שיטות לעבד לספק מדידות יציב יותר מאשר מושגת עם ידני החדרת אלקטרודות לתוך פתחי הכניסה של השבב. אולם, האלקטרודות לעתים קרובות ה"בלתי בדיקה ויזואלית של השכבה תא למד או לדרוש חדר נקי יקר תהליכי ייצור. כדי להתגבר על מגבלות אלה, המכשיר המתוארים כאן מכיל ארבע אלקטרודות משולב בקלות להציב, קבוע מחוץ לאזור תרבות, ביצוע בדיקה ויזואלית אפשרי. באמצעות האלקטרודות ארבע שניתן לכמת את ההתנגדות של שישה נתיבים מדידה, שממנו TEER יכול להיות ישירות מבודדים, עצמאית של ההתנגדות של microchannels תרבות בינוני-מלא. מחסום הדם - מוח ששוכפל במכשיר הזה, TEER שלו נוטרו להראות את הישימות של המכשיר. השבב הזה, האלקטרודות משולבת ושיטת נחישות TEER חלים בדרך כלל באיברים-על-צ'יפס, הן כדי לחקות איברים אחרים או כדי לשלב מערכות איברים על שבב קיימות.

Introduction

האיברים-על-צ'יפס במהירות מתעוררים כמו חדש, מבטיח כיתת במבחנה רקמות מודלים. 1 במודלים אלו, התאים מתורבתים בתוך מכשירים microfluidic מתוכננים כך שהם מחקים את microenvironment פיזיולוגית של תאים אלה. 1 , 2 התוצאה התנהגות פיזיולוגית או פתולוגית מציאותית יותר של תאים אלה ממה שניתן לצפות קונבנציונאלי במבחנה דגמים של עיצוב פשוט ותפקוד בסיסיים. 3 , 5 , 6 . בנוסף, איברים-על-צ'יפס מספקים סביבה לשליטה יותר מאשר הדגמים ויוו ולשלב יכול בריאים וחולים רקמות ממקור אנושי כדי להעתיק במדויק את הפיזיולוגיה האנושית והן פתולוגיה. ההתקדמות לאחרונה מסוכמים בפיתוח של דם – המוח מחסומים על שבבי (BBBs---צ'יפס) מראים כי השדה הוא נע במהירות קדימה. 7

יתרון נוסף של איברים על שבבי הוא בכך שהם מאפשרים בזמן אמת ומתמשך ניטור של הרקמה תרבותי בתוך המכשיר על ידי מיקרוסקופ, בעזרת ניתוח הביוכימי וחיישני משולב. 1 , 2 לדוגמה, מדידת התנגדות חשמלית, transendothelial או transepithelial (TEER) היא שיטה חזקה עבור ניטור לא פולשני הפיתוח ובהפסקות על הקמת המכשול רקמות. 8 , 9 , 10 TEER הוא ההתנגדות החשמלית על פני מחסום הסלולר ולכן מעיד על תקינות מכשול, חדירות. 10 איברים-על-ומשחקים הסלולר מחסומים בדרך כלל מתורבתים על קרום המפריד בין שני ערוצי fluidic, המייצג את הפסגה, basolateral תאי הרקמה הזאת מכשול. צ ' יפס כזה, מדידות TEER יכול להיות בנוחות נערך עם אלקטרודות מוכנס לתוך פתחי הכניסה ועודפים של בין שני הערוצים. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . עם זאת, ההכנסה ידנית ו reinsertion של האלקטרודות במיוחד עלולים לגרום בקלות שגיאות השמה ובכך בווריאציות במחתרת נמדד כמו למשל הבדלי ההתנגדות של נתיבים ארוכים או קצרים יותר באמצעות microchannels משמעותי לעומת ההתנגדות מכשול התא. 16 כדי למנוע שגיאות reinsertion, מכשירים עם אלקטרודות משולב הוצעו. עם זאת, רוב האלקטרודות משולב לחסום את התצוגה בעת בדיקת תרביות רקמה17,18,19,20,21 ו/או לדרוש מיוחדים חדר נקי תהליכי ייצור. 17 , 22

המכשיר איברים על שבב המתוארים בפרסום זה, הראשון מוחל בפרסום קודמות,16 משלב את היציבות של אלקטרודות משולב עם ראות על שכבת תאים נמדד ועל פבריקציה נוספת קלה. עיצוב, ייצור של השבב הזה מתואר באיור1. בקיצור, המכשיר הזה מורכב משני חלקים polydimethylsiloxane (PDMS) עם ערוץ. שמירות אשר מודבקת יחדיו ללא זליגת עם קרום פוליקרבונט עם 0.4 מיקרומטר נקבוביות שביניהם. ארבע אלקטרודות הפלטינה חוט נוסף, קבוע למקום עם photocurable דבק טוב מחוץ לאזור תרבות. כל השלבים האלה פבריקציה נוספת יכול להתבצע עם ציוד כללי, ללא צורך סביבה חדר נקי. נוסף על כך, מדידות עכבה 6 יכול להיעשות באמצעות האלקטרודות ארבע, ובכך לאפשר בידוד ישיר של TEER מדודה, ללא תלות ההתנגדות של microchannels את שהובילו חתך, ובכך למזער את ההשפעה של וריאציות הלא-ביולוגיים במערכת כגון (מחדש) ההכנסה שגיאות. 16

כדי להציג את הישימות של התקן זה ומידות TEER ישירה, מחסום הדם - מוח (BBB) ששוכפל בשבב זה. מחסום ביולוגי זה מורכב של תאים מיוחדים אנדותל ומסדיר תחבורה בין הדם והמוח לתת הומאוסטזה המוח. 23 , 24 לחקות BBB, התעלה העליונה של המכשיר microfluidic היה רצוף האנושי תאי אנדותל מוחין microvascular מהקו תא hCMEC/D3 (באדיבות שסופק על-ידי ד ר פ-או Couraud, INSERM, פריז, צרפת). 25 הציג שיטה זו, עם זאת, באופן כללי יותר רלוונטי לכל מכשיר איברים על שבב עם שני תאים, המאפשרים קביעת TEER ישירה באמצעות בקלות משולב אלקטרודות.

כתב יד זה, תחילה תהליך ייצור של המכשיר איברים על שבב עם אלקטרודות משולב מתואר. הבא, את זריעה השגרה והתרבות של תאי אנדותל המוח בתוך המכשיר הוא הסביר, כמו גם המידות TEER על שבב. במקטע ' תוצאות ', מדידות TEER נציג מוצגים, עיבוד נתונים מובהר. לבסוף, הפונקציה מכשול של BBB-על-השבב, להשגחה במהלך שלושה ימים, מוצג, מציג את הישימות של המכשיר הציג והשיטות לעקוב אחר TEER.

Protocol

1-ייצור של המכשיר איברים על שבב

  1. לעשות העתק PDMS של תבנית עם העיצובים ערוץ, מפוברק בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטי, ולקבל את החלקים PDMS של השבב microfluidic.
    1. שוקלים כ 27 גרם PDMS בסיס סוכן וסוכן ריפוי 2.7 גרם; היחס המוני צריך להיות 10:1. . זה טוב עבור לוח PDMS בעובי 3 מ מ על תבנית בקוטר 130 מ מ (5 אינץ ') שילוב רכיבים אלה ביסודיות.
    2. דגה את התערובת ב desiccator במשך כ 45 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
    3. בינתיים, להתכונן העובש נוזל התערובת PDMS על-ידי היצמדות הסרט השקוף מסביב העובש או למקם את העובש בעל וופל מתאים.
    4. שופכים את התערובת PDMS degassed על העובש. אם אוויר בועות נותרה בתערובת PDMS או על פני השטח עובש, דגה אותו שוב במשך כ-30 דקות
    5. לרפא את התערובת PDMS בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 4 h אפשר להתקרר.
    6. בשכונה קרוס-flow, למשוך את PDMS ריפא מ העובש; העובש חוזר מיד לעשות יותר עותקים משוכפלים PDMS.
    7. לחתוך המשוכפל PDMS העליון נפרד וחלקים שבב התחתון באמצעות קווי חיתוך ב- PDMS.
    8. אגרוף ארבעה חורים בחלקים העליונים בעזרת אגרוף ביופסיה חד בקוטר 1 מ"מ ועד טופס אינלטס שקעים. אגרוף מ בפנים בחוץ כדי למנוע איסוף בשבב PDMS פסולת. לכסות את החלקים שבב עם הסרט השקוף כדי להגן עליהם מפני אבק.
    9. לחתוך פוליקרבונט ממברנות מ מוסיף Transwell לריבועים של בערך 3 × 3 מ מ 2-
  2. להרכיב קרום נקבובי ללא זליגת בין שני חלקים PDMS על מנת להרכיב מתקן דו שכבתי לממשק עם קרום נקבובי.
    הערה: פרוטוקול זה הוא ממאמרו של Griep et al. 19, Chueh et al. 26
    1. הכן מרגמה PDMS/טולואן באמצעות g 0.7 של הסוכן הבסיס PDMS, g 0.07 של ריפוי סוכן µL 540 של טולואן, וכתוצאה מכך יחס משקל של 5:3. מערבולת המליטה ביסודיות.
    2. µL ספין-קואט 200 של פצצות מרגמה אל coverslip זכוכית-1500 סל ד 60 s (ramped-1000 סל"ד/s) לרכוש שכבה דק, אחיד של חומר מליטה.
    3. להעביר שכבה דקה של חומר מליטה coverslip עלו על החלק התחתון של החלק העליון של השבב עם רולר דיו. להכניס את החלק התחתון צלחת בתנור-בטוח.
    4. עם סט של פינצטה, לטבול את קצות קרום לתוך המליטה מצופים ספין ולמקם אותו בקפידה באמצע החלק התחתון
    5. מניחים בזהירות את החלק העליון בחלק התחתון תוך תשומת לב היישור.
      הערה: לא ללחוץ על גבי השבב, לא להחליק את החלק העליון מעל החלק התחתון כדי למנוע חומר המליטה הזנת הערוצים ואת סתימת הקרום.
    6. לכסות את פתחי הכניסה צ'יפס עם הסרט השקוף למנוע הצטברות אבק מלהיכנס השבב ולאפות אותם ב 60 מעלות צלזיוס במשך ה 3
  3. להשתלב אלקטרודות הערוצים בצד.
    הערה: פרוטוקול זה הוא ממאמרו של Griep et al. 19, Douville et al. 18
    1. חותך את החוט פלטינה לחתיכות של 2 ס מ. נקי על ידי ששוטף את אצטון עבור 30 דקות יש לשטוף עם מים, אתנול, אפשר להתייבש.
    2. בשכונה קרוס-flow, לשים שבב על צלחת פלסטיק. הוספת 4 חוטים פלטינה לתוך הערוצים אלקטרודה של שבב בעזרת זוג מספריים, לכופף אותן למטה אל המנה פלסטיק כדי לאפשר קיבוע למנה בשלב הבא. הוסף את החוטים 0.7-1 מ מ לתוך ערוץ תרבות, מעבר לצומת ערוץ בצורת T.
    3. להחיל טיפה של דבק UV-לריפוי בכניסה ערוץ אלקטרודה ולאפשר את הדבק למלא את הערוץ מסביב האלקטרודה בידי כוחות נימי.
    4. לעבור על UV ולריפוי הדבק כאשר הוא מגיע לסוף התעלה אלקטרודה.
      התראה: . אל תסתכל לתוך ממקור אור UV – זה עלול לפגוע העיניים שלך.
    5. שמלמדות האלקטרודות משולב 4 לצלחת פלסטיק עם דבק דו קומפוננט. דבר זה מאפשר טיפול קל יותר האלקטרודות במהלך המדידות ללא הסיכון של משיכת האלקטרודות מהשבב.
    6. לכסות את שבבי עם הסרט השקוף ואופים אותם ב- 60 ° C עבור 2 ח' אפשר לקרר ולאחסן ללא אבק עד השימוש. בדרך זו הם יכולים להיות מאוחסנת בבטחה עבור עד חודש.

2. התרבות תאי אנדותל המוח, נגזר על שבב

  1. מעיל האסימונים כדי לקדם את התא מצורף.
    1. מילוי בשני ערוצים עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) להרטיב אותם לפני היכרות עם ריאגנטים. בדוק במיקרוסקופ אם יש בועות אוויר בתוך הערוצים. אם כך, להסיר אותם על ידי שטיפה עם PBS נוספת.
    2. למלא שני ערוצים עם 30 µL של µg/mL 20 האנושי fibronectin ב- PBS. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. לבדוק אם בועות אוויר ו, במידת הצורך, לרוקן את הערוצים עם PBS ואת מילוי עם פתרון fibronectin.
    3. ועצירה האסימונים עם צמיחה אנדותל בינוני של דגירה אותם ב 37 ° C ו- 5% CO 2 באינקובטור עבור ה 2
    4. למדוד את TEER של chips ריק כפי שמתואר בשלב 3 כדי להבטיח כי כל האלקטרודות במגע ישיר עם נוזל הערוצים. צ ' יפס ריקים, ערכים TEER טיפוסי הם 0-1 Ω ס מ 2-
  2. זרע תאים לתוך התעלה העליונה.
    1. להסיר את המדיום תרבות מבקבוק תרבות (אזור תרבות 2 75 ס מ) עם טפט confluent מוחי microvascular אנדותל תאים אנושיים (hCMEC/D3).
    2. לרחוץ את התאים עם PBS. להוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA, דגירה-CO של 37 ° C ו- 5%-2 2-5 דקות עד התאים יש מנותקת הבקבוקון תרבות.
    3. לבטל את טריפסין בינונית תרבות בתוספת 20% סרום שור עוברית (FBS). לספור את התאים ולחשב את המספר הכולל של תאים ההשעיה.
    4. בינתיים, centrifuge את התאים hCMEC/D3-g x 390 עבור 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
    5. Resuspend בגדר תא בהיקף המתאים של מדיום הגידול אנדותל (EGM-2) להגיע בריכוז של 5 x 10 6 תאים/מ ל.... התוצאה היא צפיפות זריעה של 2 x 10 5 תאים/cm 2 בשבב.
    6. לאט פיפטה 30 µL של ההשעיה לתא מעורב היטב לתוך התעלה העליונה ולהסיר את פיפטה לים בתנועה שוטפת תוך לחצים עדיין.
    7. לבדוק את צפיפות זריעה תחת מיקרוסקופ. התפלגות אחידה של תאים לאורך התעלה העליונה צריכה להיות מושגת.
    8. Incubate שבבי-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 לפחות 1 ח' לשטוף תאים שאינם מצורפים אנדותל תרבות בינונית.
  3. לשמור על התרבות אנדותל על שבב.
    1. פעמיים ביום, להוסיף פיפטה תרבות בינוני מלא טיפים ביישוב פתחי הכניסה ולהחליף המדיום בתוך השבב על ידי זרימת מונחה-כבידה.
      הערה: כדי להימנע בועות אוויר או להיכנס אליה microchannels את הורסת את שכבת תאים, הקפד ליצור קשר נוזל-נוזל בין קצה פיפטה הנוזל על גבי השבב לפני הוספת את הטיפ כניסת. זה ניתן להקל על-ידי הוספת טיפה קטנה ב ב / עודפים לפני הכניסה פיפטה.
    2. גם להוסיף פיפטה עצה מאגרים שקעים כדי למנוע ייבוש הערוצים.
    3. דגירה האסימונים-CO של 37 ° C ו- 5%-2-

3. מדידות TEER על שבב

  1. להגדיר את התמוe TEER מכשיר מדידה, הכוללת מגבר הנעילה, מעגל כבלים לווין כפי שצוין ואן דר הלם ואח. 16. לחלופין, אנלייזרים potentiostats או עכבה מתאימים גם מדידות TEER אלה מבוססות על עכבה.
  2. לקחת את השבב של החממה ולאפשר לו להגיע בטמפרטורת החדר במשך לפחות 10 דקות להסיר כל נוזל מתוך קערה פלסטיק מסביב האלקטרודות כדי למנוע אלקטרודה גישור מחוץ השבב.
  3. סעו הספקטרום עכבה 200 Hz עד 1 מגה-הרץ עבור כל צירוף של שתי אלקטרודות, וכתוצאה מכך ספקטרה עכבה 6 לכל לשבב רק 5-10 דק. הסימון אם ספקטרום עכבה יש את הצפוי מגניטודות והצורות כדי לאמת את המדידה TEER, כמו המתוארות בסעיף התוצאות.
  4. להחזיר את השבב החממה-CO של 37 ° C ו- 5%-2 לאחר שסיים את המידה.
  5. לעבד ספקטרום עכבה שהושג להגיע בערך מנורמל TEER.
    1. לקבל נמדד התנגדות Equation 1 בין אלקטרודות Equation 2 ו Equation 3, כפי מסומן ב איור 2B ו- D, מן המישור resistive-10 קילו-הרץ בספקטרום עכבה המתאים.
    2. חישוב TEER את התנגדויות נמדד 6 המקביל שבב אחד בבת אחת באמצעות הצבע באמצעות המשוואה 2G איור 16:
      Equation 20
      , במשוואה הזו Equation 4 הוא אזור התרבות שדרכו נמדדה ההתנגדות, < img alt = " משוואה 5"src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ > היא התנגדותם של המכשול הסלולר ואת הקרום, Equation 6, Equation 7, Equation 8 ו- Equation 9 הן ההתנגדות הערכים הנמדדים דרך המחסום הסלולר, Equation 10, Equation 11 ערכי ההתנגדות נמדדים ערוצי ישר. 16 המשוואה נגזרת את המעגל השקול מאויר באיורים איור 2C.
  6. להפחית את TEER ריק מ TEER בנקודות כל הזמן כדי להשיג את התפתחות TEER בזמן.

Representative Results

התוצאות סכמטי של ספקטרוסקופיה עכבה חשמלית באמצעות שבב ללא תאים (קו רציף) ובאמצעות מחסום הסלולר (קו מקווקו) מוצגים באיור 2A. ניתן לזהות לארבעה אזורים עיקריים, אחד הנשלט על ידי רכיב חשמלי מסוים. להלן כ 1 kHz, קיבול שכבה כפולה-הממשק בינוני אלקטרודה-תרבות שולט, המאופיינת מדרון שלילי עבור הגודל עכבה ו משמרת שלב מתקרב-90 °. התדירות שבה שולטת קיבול שכבה כפולה, תלוי באזור האלקטרודה נחשפים לתרבות בינוני. רמת התנגדות מעל קילוהרץ 1 (ללא תאים) או 100 קילו-הרץ (עם תאים) עם שינוי פאזה קרוב 0 °, מקביל ההתנגדות של המדיום תרבות בתוך הערוצים microfluidic, בהתאם ערוץ אורך, שטח חתך הרוחב הפנימי קרום, בהתאם נקבוביות עובי. כאשר מודדים דרך מחסום הסלולר, מישור נוסף התנגדות בין 1 ל 10 קילו-הרץ נתפסת כמו גם המקסימלי המקומי הדיאגרמה שלב. באזור זה יש חשיבות קריטית מצפני TEER כמו עלייה ברורה עכבה תוצאות כאשר התאים נמצאים בנתיב נמדד, ולכן נקרא האזור"עניין". המדרון נוספת בין 10 ו- 100 kHz מקביל קיבול מכשול התא, אשר נובע בקרום bilayer השומנים חשמלית בידוד תלויה שטח השכבה תא. 27 לגבולות של אזורים אלה, כמו גם את מגניטודות עכבה תלויים במערכת נחקר ושנה עם, בין דברים אחרים, ערוץ מידות, מוליכות תרבות בינוני, מיקום האלקטרודות סוג התא. לקריאה נוספת על תאוריה ותרגול של עכבה חשמלית ספקטרוסקופיה על יוצרי מכשול רקמות במאמר סקירה מאת בנסון. et al. מומלץ. 28

נתוני נציג את המידות TEER מוצגים עבור שבב ריק והן שבב עם שכבת תאי אנדותל hCMEC/D3 המוח ב איור 2E ולא 2F, בהתאמה. בקיצור, ספקטרוסקופיה עכבה בוצעה באמצעות שש מדידות עם ארבע אלקטרודות: שתי מדידות באמצעות תא תרבות בינוני מלא ערוצים (קווים מלאים) ומדידות ארבע דרך הערוצים, כמו גם את הקרום ואם קיים - מחסום הסלולר (קווים מקווקווים). נתיבים אלה מידה 6 ניתן לזהות במעגל resistive המקבילה של איור 2B, אשר נגזר חתך סכימטי (איור 2C), מבט מלמעלה (איור דו-ממדי). המדידות שבב ריק (איור 2E) להציג את צורת ספקטרה עכבה אופיינית ללא תאים, כמופיע באיור2 א. המדידות עברו את המחסום הסלולר (קווים מקווקווים ב 2F איור) דומים ספקטרום עכבה אופיינית עם תאים איור2 א. שים לב כי גודל עכבה והן השלב משמרת עלייה לקראת 1 מגה-הרץ. זו היא התגובה הטיפוסית של ההתקנה מדידה בתדרים הגבוהים והיא לא ממוצא ניסיוני.

כדי לקבוע את TEER באמצעות אלה ספקטרה עכבה ניסיוני, קודם ההתנגדות שבב נמדד נקבע, וזו ההתנגדות הכוללת של שכבת תאים, ערוצי ממברנה. למטרה זו, תדירות הבדיקה מתאים באזור עניין נבחר, שצבעה המקסימלי המקומי העלילה שלב עם תאים וקרוב 0 ° ההתחלתי ללא תאים: 10 קילו-הרץ. עם התנגדויות נמדד 6-10 קילו-הרץ, כפי שנמדד בין האלקטרודות ארבע, TEER ישירות מחושבת באמצעות המשוואה ב 2F איור.

כדי להראות כי המכשיר הציג מתאים לקביעת TEER איברים-על-אסימונים, BBB ששוכפל בתוך השבב ונשאר TEER שלה היה להשגחה במהלך 3 ימים של תרבות. איור 3A ש-TEER הממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM) מוצג עבור ארבעה BBBs---צ'יפס, והתוצאה היא רמה של 22 ± Ω 1.3 ס מ2, אשר הוא להשוות TEER של הקו הסלולרי כפי שדווחו בספרות. 29 . יתר על כן, לאחר סיום הניסוי, קרינה פלואורסצנטית מכתים של הגרעינים, ניתן לראות המוח אנדותל נוצר של טפט רציפה בתוך המכשיר (איור 3B). Immunofluorescence מכתים צמוד לצומת החלבון Zonula Occludens-1 (זואי-1) הראה כי תאי אנדותל המוח מתוחזק פנוטיפ ספציפי BBB שלהם ויצרו מתחמי מהחיבור חזק.

Figure 1
איור 1: עיצוב והרכבה של המכשיר איברים על שבב עם אלקטרודות משולב.
(א) תצוגה מורחבת של השבב microfluidic, המורכב חלק PDMS העליון עם התעלה העליונה (TC), קרום (ז), חלק תחתון חלק PDMS עם הערוץ התחתון (לפנה ס). חוט פלטינה ארבע אלקטרודות (E1-4) מוכנס ותוקנו בערוצים בצד. בתעלה העליונה, מעל הקרום, תאי אנדותל hCMEC/D3 המוח היו תרבותי לשכפל BBB. (B) התאספו שבב, מקובע צלחת פלסטיק. הודפס מחדש ומותאמות עם רשות מן Elsevier. 16 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: עכבה נציג נתונים ונחישות של TEER.
(א) עכבה סכמטית ספקטרום בסה כ מציג עכבה הגודל (Ω) ו ההתחלתי (°) לעומת התדירות (Hz), אופייני עבור עכבה חשמלית ספקטרוסקופיה על שבבי ללא תאים (קו רציף) ועם תאים (קו מקווקו). ישנם ארבעה אזורים עיקריים, אחד הנשלט על ידי: קיבול שכבה כפולה האלקטרודות, ההתנגדות תרבות בינוני, ההתנגדות מכשול תא ו קיבוליות של קרום התא. האזור"עניין" מציין בו התרומה של השכבה תא ניתן כימות (חץ אדום). (B) המעגל resistive השקול של השבב, מציג את הערוץ העליון נגדים R1 ו R3, התחתון ערוץ נגדים R2 ו R4 ממברנה ואת EC מכשול resistor Rm. (ג) סכמטית חתך מציג את תאי אנדותל (EC) תרבותי בתעלה העליונה. (ד) הצג סכימתי העליון של BBB צ'יפ מציג את התצורה של האלקטרודות ואזור התרבות של 0.25 מ מ2 שדרכו נמדד על עכבה (ה) נציג עכבה ספקטרום של שבב ריק מלא תא תרבות בינוני. אנדותל תאי מוח (נ) ספקטרום עכבה נציג של שבב ב hCMEC/D3 אילו היו תרבות במשך 3 ימים. (G) הנוסחה לחישוב TEER מ התנגדויות נמדד בין כל שישה שילובים של ארבע אלקטרודות. הודפס מחדש ומותאמות עם רשות מן Elsevier. 16 אנא לחץ כאן כדי להציג לגרסה גדולה יותריון של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פיתוח TEER הנציגה של BBB על שבב.
(א) TEER הממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM) של ארבעה BBBs---שבבי במהלך תקופה תרבות של שלושה ימים, להגיע מישור-22 ± 1.3 Ω ס מ2 (הממוצע ± SEM). לשם השוואה, הנתונים של שבבי ריק הינה כלולה, מציג וריאציה שולית, סטייה Ω 0 ס מ2 באותה תקופה לעומת כל וריאציה, TEER של שבבי עם תאים. (B) זריחה מיקרוסקופיה של גרעינים מוכתם גילה של טפט רציפה של אנדותל, הן PDMS והן הקרום במיקום המצוין של שיבוץ. (ג) Immunofluorescence גילה הנוכחות של חלבון צמוד לצומת Zonula Occludens-1, המציין כי BBB ספציפיים צמתי צר בין התאים להצמיח TEER נמדד. הודפס מחדש ומותאמות עם רשות מן Elsevier. 16 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כתב יד זה, הוצגו ההנדסה של המכשיר איברים על שבב ונחישות ישירה של ההתנגדות החשמלית transendothelial (TEER) של מכשול הסלולר תרבותי במכשיר. שיטת הציג שילוב אלקטרודות ללא ציוד חדר נקי, הקביעה TEER ישירה באמצעות אלקטרודות ארבע ישימה לכל מכשיר איברים על שבב עם שני תאים microfluidic. השבב הפריסה ואת הגיאומטריה יכול להיות מותאם כדי להתאים לדרישות של הניסויים בדיוק, כל עוד ארבע אלקטרודות מופרדות ב שני תאים. האלקטרודות ארבעה אפילו ניתן נוח להוסיף את פתחי הכניסה של האסימונים הקיימים, ובלבד הם הם מקובעים במקום למשך כל המדידות שש. ניתן למטב השיטה ללא זליגת מליטה על ממברנות שונות וגיאומטריה ערוץ על-ידי שינוי היחס PDMS/טולואן. תוכן גבוהה טולואן יוצרת שכבה מצופים ספין דק יותר של חומר מליטה26 וייתכן מתאים יותר רדודים, צר יותר ערוצי בחלקים PDMS. תוצאות תוכן התחתון טולואן ב מרגמה עבה שכבה26 , וייתכן שהוא מתאים יותר להקיף קרום עבה בין החלקים PDMS.

כפי שניתן לראות ספקטרום עכבה סכמטית איור 2 א, ספקטרום ניסיוני איור 2E ולא 2F, מדידות עכבה מושפעים את קיבול שכבה כפולה-הממשק אלקטרודה-בינוני. בשל גודלו הקטן של האלקטרודות בתוך microchannels את, קיבול שכבה כפולה יכול לשלוט על פני רמה resistive המכשול הסלולר עכבה ספקטרה, שמסבך כימות TEER. כדי להתגבר על זה, יכול להיות מוכנס האלקטרודות לעומק ערוצי תרבות לפני קיבוע. זה יגביר את פני השטח של האלקטרודה חשוף למדיום תרבות ועם זה קיבול שכבה כפולה יגדל גם כן. התוצאה היא משמרת של המדרון קיבולי לתדרים נמוכים יותר, כך רמת התנגדות של המכשול סלולרית יכולה להיות מוכרת יותר בקלות, כימות. למרות ההתנגדות של נתיב נמדד בין שתי אלקטרודות יהיו קטנים, זה לא תשפיע על כימות TEER בעקבות השיטה שהוצגו.

בזמן מדידת דרך המחסום הסלולר, זה אפשרי כי רמת התנגדות נוספת ניתן לזיהוי. זו יכולה להיות התוצאה של חיבור fluidic בין שני הערוצים, לדוגמה אם הקרום לקוי מוקף המליטה, המוביל אל נתיב נמדד מסביב למכשול הסלולר. בנוסף, יכול להיות חשמל גישור מחוץ לשבב אם האלקטרודות מחוברים באמצעות droplet של תרבות בינוני. זה בדרך כלל בשילוב עם עכבה נמדד התחתון, יכולה להיפתר על ידי הסרת הגשר הזה של תרבות בינוני. לבסוף, אם יש רמת התנגדות אין והוא עכבה נמדד סדרי גודל גבוה מהצפוי, ייתכן שיש קשר רופף חיווט חשמלי או על מקור הכוח.

בעתיד, הרלוונטיות פיזיולוגיים של הנוכחי BBB-על-השבב יכול להיות מוגברת על ידי חשיפת תאי אנדותל להטיית מתח ברמות פיזיולוגיים, אשר מדווח לקדם BBB בידול, ולהגביר את מחסום אטימות וקשה להשיג קונבנציונלי במבחנה דגמים. 29 . בנוסף, הערוץ התחתון של המכשיר הציג מספק תא מתאים בשביל לתאים במוח, נגזר להיות תרבותי משותף עם אנדותל. זה צפוי גם להגדיל את הפונקציה מכשול ומאפשר גם המחקר של אינטראקציות מורכבות בין סוגי תאים הרלוונטיים בתנאים פתולוגי. 29

לסיכום, המכשיר איברים על שבב המתוארים בפרסום זה יכול להיות מפוברק בעזרת ציוד מעבדה סטנדרטיים ו מוצג לספק מדידות TEER ישירה באמצעות ארבע אלקטרודות משולב הפוגעים לא בדיקה ויזואלית של התא למדה שכבה. תחולתה של התקן זה בשטח איברים-על-צ'יפס הודגם על-ידי מחקה BBB בשבב זה ובפיקוח של TEER במהלך תקופת תרבות. יכול להיות חיקה שורה של איברים אחרים (מכשול) על-ידי כלילת סוגי תאים רלוונטיים אחרים לתוך השבב הזה. בנוסף, שיטה למדידת TEER ניתן להחיל בקלות בהתקנים אחרים שני מבוסס תא איברים על שבב להגיע בערכים TEER משמעותי הדירים ניתן להשוות בין התקנים ומערכות.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו להכיר בהכרת תודה בומר יוהן עבור ייצור של עובש, Mathijs קיטיקונדול עבור דיונים פוריים וסיוע עם ייצוג נתונים.

מחקר זה מומן על ידי: שמיועד ביו Microdevices של l.i. ב Segerink, מירה מכון הנדסה ביו-רפואית ורפואה טכני, האוניברסיטה של טוונטה; הממונה איברים-על-שבבי לספירה ון דר מיר, מירה מכון עבור הנדסה ביו-רפואית ורפואה טכני, האוניברסיטה של טוונטה; VESCEL, ERC Advanced גרנט א ואן דן ברג (גרנט 669768 מס).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit Dow Corning 1673921
Scotch Magic tape 3M
Biopsy punch, 1.0 mm diameter Integra Miltex 33-31AA-P/25
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size Corning 3401 Cut from Transwell culture inserts
Toluene Sigma-Aldrich 244511
Platinum wire, 200 µm diameter Alfa Aesar 10287
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA 81
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol Henkel 30673
hCMEC/D3 cells Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml Gibco 33016015
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) Lonza CC-3162 Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots
Trypsin-EDTA, 0.05% Gibco 15400-054
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-079
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Oven Binder 9010-0190
Spin coater: Spin 150 Polos SPIN150-NPP
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 Manufactured in-house
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter
Incubator Binder CB E2 150
Boxense LocSense Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  2. Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).
  3. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  4. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  5. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  6. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  7. Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
  8. Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).
  9. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  11. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
  12. Deosarkar, S. P., et al. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725 (2015).
  13. Ferrell, N., et al. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).
  14. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  15. Partyka, P. P., et al. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).
  16. Van der Helm, M. W., et al. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).
  17. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  18. Douville, N. J., et al. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).
  19. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  20. Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).
  21. Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).
  22. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  24. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  25. Weksler, B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  26. Chueh, B. -H., et al. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).
  27. Golowasch, J., Nadim, F. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).
  28. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).
  29. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).

Tags

הנדסה ביו-רפואית גיליון 127 איברים-על-צ'יפס מיקרו-מלאכותית ההתנגדות החשמלית transendothelial ההתנגדות החשמלית transepithelial מחסום הדם - מוח מיקרופלואידיקה
ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Helm, M. W., Odijk, M.,… More

van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., Segerink, L. I. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J. Vis. Exp. (127), e56334, doi:10.3791/56334 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter