Summary
Cette publication décrit la fabrication d’un dispositif d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées pour la quantification directe de résistance électrique transendothéliale (TEER). Pour la validation, la barrière hémato - encéphalique a été imitée à l’intérieur de ce dispositif microfluidique et sa fonction de barrière a été suivie. Les méthodes présentées pour l’intégration de l’électrode et quantification directe de TEER sont généralement applicables.
Abstract
Organes-on-Chip, in vitro modèles mettant en cause la culture de tissus (humains) à l’intérieur de dispositifs microfluidiques, sont rapidement émergentes et la promesse de fournir utiles recherche outils pour étudier la maladie et la santé humaine. Afin de caractériser la fonction de barrière de couches de cellules cultivées à l’intérieur de l’orgue-sur-puce, souvent transendothéliale ou transépithélial résistance électrique (TEER) est mesurée. À cette fin, les électrodes sont généralement intégrés dans la puce par des méthodes de micro-usinage pour fournir des mesures plus stables que celui qui est obtenu avec l’insertion manuelle des électrodes dans les criques de la puce. Cependant, ces électrodes fréquemment entravent une inspection visuelle de la couche de cellules étudiées ou exigent cleanroom coûteux processus de fabrication. Pour surmonter ces limites, l’appareil décrit ici contient quatre électrodes facilement intégrés qui sont placées et fixées à l’extérieur de la zone de culture, permettant une inspection visuelle. En utilisant ces quatre électrodes de que la résistance des six voies de mesure peut être quantifiée, d'où la TEER peut être directement isolée, indépendante de la résistance des microcanaux remplis de milieu de culture. La barrière hémato - encéphalique ont été répliquée dans cet appareil et sa TEER a été suivie pour montrer l’applicabilité de l’appareil. Cette puce, les électrodes intégrées et la méthode de détermination de TEER sont généralement applicables dans les organes-on-Chip, aussi bien pour imiter les autres organes ou être intégré dans les systèmes existants d’orgue-on-chip.
Introduction
Organes-on-Chip est rapidement en train de devenir un nouveau et prometteur classe de in vitro des modèles de tissus. 1 dans ces modèles, les cellules sont cultivées à l’intérieur de dispositifs microfluidiques qui sont conçus de telle manière qu’ils imitent le microenvironnement physiologique de ces cellules. 1 , 2 cela se traduit par un comportement physiologique ou pathologique plus réaliste de ces cellules que peut-on attendre de classiques in vitro des modèles de conception simple et de la fonction de base. 3 , 5 , 6 en outre, organes-on-Chip fournit un environnement plus contrôlable que les modèles in vivo et peut intégrer des tissus sains et malades d’origine humaine à reproduire fidèlement la physiologie humaine et pathologie. Les progrès récemment résumées dans l’apparition de sang – cerveau obstacles sur les puces (GFGS-on-Chip) montrent que le domaine évolue rapidement vers l’avant. 7
Un autre avantage des organes-on-Chip, c’est qu’ils permettent une surveillance en temps réel et permanente des tissus cultivés à l’intérieur de l’appareil par microscopie, des analyses biochimiques en ligne et des capteurs intégrés. 1 , 2 par exemple, mesurer la résistance électrique transendothéliale ou transépithélial (TEER) est une méthode puissante pour la surveillance non invasive de la mise au point et la perturbation formant barrière des tissus. 8 , 9 , 10 TEER est la résistance électrique à travers une barrière cellulaire et est donc indicative de l’intégrité de la barrière et la perméabilité. 10 dans les organes-on-Chip, barrières cellulaires sont généralement cultivées sur une membrane qui sépare les deux canaux fluidiques, représentant l’apicale et basolatérale compartiments de ce tissu de barrière. Ces jetons, mesures de TEER peuvent se dérouler idéalement avec des électrodes insérées dans les entrées et sorties des deux canaux. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 Toutefois, insertion manuelle et la réinsertion des électrodes peuvent facilement entraîner dans erreurs de placement et donc dans les variations de la résistance mesurée comme par exemple les différences dans la résistance des chemins plus ou moins par le biais de microcanaux sont significatives par rapport à la résistance de barrière de cellule. 16 pour éliminer les erreurs de la réinsertion, dispositifs avec électrodes intégrées ont été proposées. Cependant, la plupart de ces électrodes intégrées bloquent la vue lors de l’inspection les vitroplants17,18,19,20,21 et/ou exigent spécialisés salle blanche des processus de fabrication. 17 , 22
Le dispositif de l’orgue-on-chip décrit dans cette publication, tout d’abord appliquée dans une publication antérieure,16 combine la stabilité des électrodes intégrées avec visibilité sur la couche de cellules mesurées et la fabrication facile. La conception et la fabrication de cette puce est représenté dans la Figure 1. En bref, cet appareil comprend deux parties polydiméthylsiloxane (PDMS) avec empreintes de canal qui sont collées ensemble sans fuite avec une membrane en polycarbonate avec 0,4 µm pores entre les deux. Quatre électrodes de fil de platine sont insérés et fixés en place avec un photodurcissable colle bien à l’extérieur de la zone de culture. Toutes ces étapes de fabrication peuvent être effectuées avec le matériel de laboratoire générales, sans la nécessité d’un environnement de salle blanche. En outre, six mesures d’impédance peuvent être faites à l’aide de ces quatre électrodes, permettant ainsi à isolement direct de la mesure TEER, indépendante de la résistance des microcanaux menant à la section efficace et afin de minimiser l’influence de variations du système tels que (re) erreurs d’insertion non biologiques. 16
Pour montrer l’applicabilité de ce dispositif et les mesures directes de TEER, que la barrière sang - encéphalique (BHE) a été transposée dans cette puce. Cette barrière biologique est constitué de cellules endothéliales spécialisés et réglemente le transport entre le sang et le cerveau pour fournir l’homéostasie du cerveau. 23 , 24 pour imiter le BBB, le canal du haut du dispositif microfluidique était bordé de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines de la lignée hCMEC/D3 (aimablement fourni par le Dr p.-O. Couraud, INSERM, Paris, France). 25 la méthode présentée est, cependant, plus généralement applicable à n’importe quel dispositif d’orgue-on-chip avec deux compartiments, permettant la détermination directe de TEER utilisant facilement intégrée des électrodes.
Dans ce manuscrit, tout d’abord le procédé de fabrication de l’appareil de l’orgue-on-chip avec électrodes intégrées est décrite. Suivant, la procédure semis et la culture de cellules endothéliales du cerveau à l’intérieur de l’appareil est expliquée, ainsi que les mesures de TEER sur puce. Dans la section résultats, mesures représentatives de TEER sont montrés et traitement des données est clarifiée. Enfin, la fonction barrière de la BBB-on-chip, surveillée pendant 3 jours, est présentée, montrant l’applicabilité de l’appareil présenté et les méthodes de surveillance TEER.
Protocol
1. fabrication de l’appareil de l’orgue-on-chip
- construire une réplique PDMS d’un moule avec les dessins de canal, fabriqués en utilisant des techniques de photolithographie standard et obtenir les pièces de PDMS de la puce microfluidique.
- Pèsent environ 27 g PDMS base agent et 2,7 g de salaison ; le rapport de masse doit être de 10:1. C’est bon pour une dalle PDMS une épaisseur de 3 mm sur un moule de diamètre 130 mm (5 pouces). Bien mélanger ces composants.
- Une solution contenant le mélange dans un dessiccateur pendant environ 45 min pour enlever les bulles d’air.
- Pendant ce temps, préparez le moule le mélange liquide de PDMS en coller un ruban transparent autour du moule ou placer le moule dans un support approprié wafer.
- Verser le mélange PDMS dégazé sur le moule. Si n’importe quel air bulles sont restés dans le mélange PDMS ou à la surface du moule, il dégazer à nouveau pendant environ 30 min.
- Guérir dans une étuve à 60 ° C pendant 4 h. laisser refroidir le mélange de PDMS.
- Sous une hotte à flux transversal, tirez le PDMS guéri du moule, le moule peut être réutilisé immédiatement pour faire des répliques PDMS plus.
- Couper la réplique PDMS en haut séparé et parties inférieures de copeaux à l’aide de lignes de coupe dans le PDMS.
- Percez quatre trous dans les parties supérieures en utilisant un poinçon pointu biopsie avec 1 mm de diamètre à forme entrées et sorties. Punch de l’intérieur vers l’extérieur pour empêcher les débris PDMS de s’accumuler dans la puce. Couvrir les parties de la puce avec ruban transparent pour les protéger contre la poussière.
- Couper les membranes en polycarbonate de Transwell inserts en carrés d’environ 3 × 3 mm 2.
- Assemble une membrane poreuse sans fuite entre deux pièces de PDMS afin d’assembler un dispositif diploblastique interfacée avec une membrane poreuse.
Remarque : Ce protocole est adapté du Griep et al. 19 et Chueh et al. 26- préparer un mortier PDMS/toluène à l’aide de 0,7 g d’agent de base PDMS, 0,07 g de salaison et 540 µL du toluène, résultant en un ratio de poids de 5:3. Vortex le mortier soigneusement.
- Spin-manteau 200 µL de mortier sur une lamelle de verre à 1500 tr/min pendant 60 s (rampe à 1000 tr/min/s) pour acquérir une couche mince et uniforme de mortier.
- Transfert en une mince couche de mortier de la lamelle sur une partie inférieure et une partie supérieure de la puce avec un ruban encreur. Mettre la partie inférieure dans un plat allant au four.
- Avec un ensemble de pince à épiler, trempez les bords d’une membrane dans le mortier d’enduit de spin et posez-le soigneusement au milieu de la partie de fond.
- Placer soigneusement la partie supérieure sur la partie inférieure en faisant attention à l’alignement.
Remarque : N’exercez pas de pression sur la puce et de ne pas faire glisser la partie supérieure sur la partie inférieure pour empêcher le mortier de pénétrer dans les canaux et le colmatage de la membrane. - Couvrir les entrées de puces avec ruban transparent pour empêcher la poussière de pénétrer dans la puce et les faire cuire à 60 ° C pendant 3 h.
- Intégrer des électrodes dans les chenaux secondaires.
Remarque : Ce protocole est adapté du Griep et al. 19 et Douville et al. 18- couper le fil de platine en morceaux d’environ 2 cm. Clean en les immergeant dans de l’acétone pour 30 min. Rincer à l’eau et l’éthanol et laisser pour sécher.
- Sous une hotte à flux transversal, mettre une puce sur un plat en plastique. Insérez les quatre fils de platine dans les canaux de l’électrode d’une puce à l’aide d’une paire de pincettes et plier vers le bas sur le plat en plastique pour permettre la fixation à plat dans une étape ultérieure. Insérez les fils 0,7-1 mm dans le canal de la culture, au-delà de l’intersection du canal en forme de T.
- Appliquer une goutte de colle UV polymérisable à l’entrée du chenal électrode et la prise de la colle remplir le canal autour de l’électrode par des forces capillaires.
- Allumez UV et guérir la colle lorsqu’il atteint l’extrémité du chenal électrode.
Mise en garde : Ne regardez pas dans la source de lumière UV, car cela peut nuire à vos yeux. - Fixer les quatre électrodes intégrées au plat en plastique avec un adhésif époxyde à deux composants. Ceci permet une manipulation plus facile des électrodes lors des mesures sans risque de tirer les électrodes de la puce.
- Couvrir les puces avec ruban transparent et les faire cuire au four à 60 ° C pendant 2 h. laisser refroidir et stocker la poussière jusqu'à l’utilisation. De cette façon, ils peuvent être en toute sécurité stockées pour jusqu'à un mois.
2. Culture de cellules endothéliales encéphales sur puce
- enrober les puces pour favoriser la fixation des cellules.
- Remplir les deux canaux avec phosphate solution saline tamponnée (PBS) à mouillez-les avant d’introduire des réactifs. Vérifier au microscope s’il y a les bulles d’air dans les canaux. Dans l’affirmative, supprimez-les en la rinçant avec appoint PBS.
- Remplir les deux canaux avec 30 µL de 20 µg/mL de fibronectine humaine dans du PBS. Incuber à 37 ° C pendant 3 heures. Recherchez les bulles d’air et, si nécessaire, rincer les canaux avec du PBS et recharge avec la solution de la fibronectine.
- Rincer les puces avec le milieu de croissance endothéliale et incuber à 37 ° C et 5 % de CO 2 dans un incubateur pendant 2 h.
- Mesurer la TEER des puces vierges tel que décrit à l’étape 3 pour s’assurer que toutes les électrodes sont en contact direct avec le liquide dans les canaux. En copeaux vides, des valeurs typiques de TEER sont 0-1 Ω cm 2.
- Cellules des graines dans le canal du haut.
- Enlever le milieu de culture, d’un flacon de culture (zone de culture de 2 75 cm) avec une monocouche confluente de humains cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (hCMEC/D3).
- Laver les cellules avec du PBS. Ajouter 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 2-5 minutes jusqu'à ce que les cellules ont détaché du flacon de culture.
- Désactiver la trypsine avec milieu de culture enrichi de 20 % sérum fœtal (SVF). Compter les cellules et calculer le nombre total de cellules en suspension.
- Pendant ce temps, centrifuger les cellules hCMEC/D3 à 390 x g pendant 5 min et retirer le liquide surnageant.
- Resuspendre le culot dans le volume approprié de milieu de croissance endothéliale (EGM-2) pour arriver à une concentration de 5 x 10 6 cellules/mL. Cela se traduit par une densité de semis de 2 x 10 5 cellules/cm 2 dans la puce.
- Lentement Pipetter 30 µL de la suspension cellulaire bien mélangée dans le canal du haut et retirez la pipette de l’entrée dans un mouvement fluide tout en exerçant toujours une pression.
- Vérifier la densité de semis sous un microscope. Une distribution uniforme des cellules tout au long de la chaîne devrait être réalisée.
- Incuber les puces à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant au moins 1 h. rincer toutes les cellules non inscrits avec milieu de culture endothélial.
- Maintenir la culture endothéliale sur puce.
- Deux fois par jour, insérer les pointes de pipette remplie de milieu de culture comme réservoirs dans les criques et remplacer le support à l’intérieur de la puce par écoulement gravitaire.
Remarque : Pour éviter les bulles d’air de pénétrer dans les microcanaux et détruisant la couche cellulaire, assurez-vous d’établir le contact fluide-fluide entre la pipette et le liquide sur le dessus de la puce avant d’insérer l’embout dans une crique. Cela peut être facilité en ajoutant une petite goutte à l’en / prise de courant avant l’insertion de la pipette. - Également ajouter des réservoirs de pointe de pipette dans les points de vente pour que les chaînes ne se dessèchent.
- Incuber les puces à 37 ° C et 5 % de CO 2.
- Deux fois par jour, insérer les pointes de pipette remplie de milieu de culture comme réservoirs dans les criques et remplacer le support à l’intérieur de la puce par écoulement gravitaire.
3. Les mesures de TEER sur puce
- mis en place the les appareils de mesure TEER, composé d’un amplificateur à verrouillage et un circuit de câble de sonde a été spécifiée dans Van der Helm et al. 16 par ailleurs, analyseurs de potentiostats ou impédance sont également appropriés pour ces mesures axées sur l’impédance de TEER.
- Prendre la puce de l’incubateur et laissez-le à température ambiante pendant au moins 10 mn Retirez tout fluide de la capsule en plastique autour des électrodes pour empêcher l’électrode pontage en dehors de la puce.
- Prendre le spectre d’impédance de 200 Hz à 1 MHz pour chaque combinaison de deux électrodes, ce qui entraîne les spectres d’impédance 6 par puce dans seulement 5-10 min. vérifier si les spectres d’impédance ont l’ampleur attendue et les formes pour valider la mesure TEER, telle qu’elle est décrit dans la section résultats.
- Remettre la puce dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO 2, après avoir terminé la mesure.
- Traiter les spectres obtenus impédance afin d’aboutir à une valeur normalisée de TEER.
- Get la mesure résistance
entre électrodes 
et 
, comme indiqué dans la Figure 2 b et D, depuis le plateau de résistif dans les spectres d’impédance correspondant à 10kHz. - Calculer la TEER utilisant les résistances mesurées six correspondant à une seule puce à la fois pointe à l’aide de l’équation de la Figure 2 16 :
dans cette équation,
est la zone de culture à travers laquelle on a mesuré la résistance < img alt = » Équation 5 » src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg » / > est la résistance de la barrière cellulaire et la membrane, 
, 
, 
et 
sont la résistance les valeurs mesurées à travers la barrière cellulaire et 
et 
sont les valeurs de résistance mesurées dans le chaînes droites. 16 l’équation est dérivée le circuit équivalent illustré à la Figure 2.
- Get la mesure résistance
- Soustraire la TEER vierge de la TEER à tous moments pour obtenir le développement de la TEER dans temps.
entre électrodes 
et 
, comme indiqué dans la Figure 2 b et D, depuis le plateau de résistif dans les spectres d’impédance correspondant à 10kHz.
est la zone de culture à travers laquelle on a mesuré la résistance < img alt = » Équation 5 » src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg » / > est la résistance de la barrière cellulaire et la membrane, 
, 
, 
et 
sont la résistance les valeurs mesurées à travers la barrière cellulaire et 
et 
sont les valeurs de résistance mesurées dans le chaînes droites. 16 l’équation est dérivée le circuit équivalent illustré à la Figure 2.Representative Results
Les résultats schématiques de la spectroscopie d’impédance électrique grâce à une puce sans cellules (trait plein) et à travers une barrière cellulaire (ligne pointillée) sont indiquées dans la Figure 2 a. On peuvent distinguer quatre grandes régions, chacune dominée par un composant électrique spécifique. Inférieures à 1 kHz environ, la capacité de la double couche à l’interface moyenne électrode-culture domine, caractérisé par une pente négative pour la grandeur de l’impédance et un déphasage s’approchant de-90 °. La fréquence à laquelle la capacité de la double couche domine, dépend de la surface de l’électrode exposée au milieu de culture. Le plateau résistif au-dessus de 1 (sans cellules) ou 100 kHz (avec cellules) avec un décalage de phase proche de 0 °, correspond à la résistance du milieu de culture à l’intérieur des canaux microfluidiques, selon la longueur de la chaîne et transversale et à l’intérieur du membrane, en fonction de la porosité et l’épaisseur. Lorsque vous mesurez à travers une barrière cellulaire, un plateau extra résistant entre 1 et 10 kHz est vu ainsi que de la concurrence locale dans le diagramme de phase. Cette région est d’une importance cruciale pour la détermination de la TEER comme une nette augmentation dans les résultats de l’impédance lorsque les cellules sont présents dans le chemin d’accès mesuré et sont donc appelés la « région d’intérêt ». La pente supplémentaire entre 10 et 100 kHz correspond à la capacité de la barrière cellulaire, qui découle de la membrane de bicouche lipidique électriquement isolante et dépend de la superficie totale de la couche de cellules. 27 les limites de ces régions ainsi que la magnitude de l’impédance dépendent du système étudié et changent avec, entre autres choses, dimensions du canal, conductivité de milieu de culture, électrodes et type de cellule. Pour en savoir plus sur la théorie et la pratique de la spectroscopie d’impédance électrique sur formant barrière tissus l’article de la revue par Benson et coll. est recommandé. 28
Des données représentatives des mesures TEER sont montrées pour une puce vierge et une puce avec une couche de cellules endothéliales de cerveau hCMEC/D3 en Figure 2E et 2F, respectivement. En bref, spectroscopie d’impédance a été réalisée à l’aide de six mesures avec quatre électrodes : deux mesures par le biais de canaux remplis de milieu de culture de cellules (lignes pleines) et quatre mesures à travers les canaux ainsi que la membrane et - le cas échéant - la barrière cellulaire (lignes pointillées). Ces chemins de six mesure peuvent être identifiés dans le circuit résistif équivalent de la Figure 2 b, qui est dérivé de la coupe transversale schématique (Figure 2) et la vue de dessus (Figure 2D). Les mesures de puce vide (Figure 2E) montrent la forme typique de spectres d’impédance sans cellules, comme illustré dans la Figure 2 a. Les mesures à travers la barrière cellulaire (lignes pointillées dans Figure 2F) ressemblent à des spectres d’impédance typique avec des cellules dans la Figure 2 a. Remarque que tant l’ampleur de l’impédance et la phase shift augmentation à 1 MHz. C’est la réponse typique de l’installation de mesure à des fréquences élevées et n’est pas d’origine expérimentale.
Pour déterminer la TEER en utilisant ces spectres expérimentaux d’impédance, tout d’abord la résistance mesurée est déterminée, qui est la résistance totale de la couche de cellules, les canaux et les membranes. À cette fin, une fréquence d’affichage approprié dans la zone concernée a été choisie, qui est au maximum dans les diagrammes de phases avec des cellules et à proximité de déphasage 0 ° sans cellules local : 10kHz. Avec les six résistances mesurées à 10 kHz, mesurée entre les quatre électrodes, la TEER est directement calculé avec l’équation du Figure 2F.
Pour montrer que le dispositif présenté est approprié pour la détermination de TEER en organes-on-Chip, le BBB a été reproduit à l’intérieur de la puce et sa TEER a été suivie pendant 3 jours de culture. Dans la Figure 3 a que la moyenne TEER ± erreur-type de la moyenne (SEM) est indiqué pour GFGS-on-quatre Chip, résultant en un plateau de 22 ± 1,3 Ω cm2, qui est comparable à la TEER de cette lignée de cellules tel que rapporté dans la littérature. 29 en outre, après la fin de l’expérience et la fluorescence coloration des noyaux, on voit que l’endothélium cérébral formée une monocouche continue à l’intérieur de l’appareil (Figure 3 b). Immunofluorescence souillant des protéines de jonction serrée 1 Zonula Occludens (ZO-1) a montré que les cellules endothéliales du cerveau maintient leur phénotype BBB spécifiques et forment des complexes de jonction serrées.
Figure 1 : Conception et l’assemblage de l’appareil de l’orgue-on-chip avec électrodes intégrées.
(A) vue éclatée de la puce microfluidique, consistant en une partie supérieure de PDMS avec le canal du haut (TC), une membrane (M) et un fond partie PDMS avec le canal du bas (BC). Quatre électrodes de fil de platine (E1-4) sont insérés et fixés dans les chenaux secondaires. Dans le canal du haut et sur le dessus de la membrane, les cellules endothéliales du cerveau hCMEC/D3 ont été cultivées pour répliquer la BHE. (B) assemblé puce, fixé sur un plat en plastique. Réimprimé et adaptée avec autorisation d’Elsevier. 16 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Données d’impédance représentatif et détermination de TEER.
(A) impédance schématique du spectre montrant impédance magnitude (Ω) et déphasage (°) fonction de la fréquence (Hz), typique pour la spectroscopie d’impédance électrique sur les puces sans cellules (trait plein) et avec des cellules (ligne pointillée). Il y a quatre régions principales, chacune dominée par : la capacité de la couche double sur les électrodes, la milieu de culture de la résistance, la résistance de barrière cellulaire et la capacité de la membrane cellulaire. La « région d’intérêt » indique où la contribution de la couche de cellules peut être quantifiée (flèche rouge). (B) circuit résistif équivalent de la puce, mentionnant le canal du haut résistances R1 et R3, le bas canal résistances R2 R4 et la membrane et EC barrière résistance Rm. (C) coupe transversale schématique montrant les cellules endothéliales (EC) cultivées dans le canal du haut. (D) schéma vue de dessus du BBB puce montrant la configuration des électrodes et la zone de culture de 0,25 mm2 à travers lequel l’impédance est mesurée. (E) spectres d’impédance représentatif d’une puce vide rempli de milieu de culture cellulaire. Spectres représentatifs d’impédance (F) d’une puce dans laquelle hCMEC/D3 du cerveau des cellules endothéliales étaient la culture pendant 3 jours. (G) formule à calculer à partir des résistances mesurées entre tous les six combinaisons de quatre électrodes de TEER. Réimprimé et adaptée avec autorisation d’Elsevier. 16 s’il vous plaît cliquez ici pour voir un agrandissement version de cette figure.
Figure 3 : Développement de TEER représentatif de BBB-on-chip.
(A) TEER moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM) des quatre GFGS-on-Chip durant une période de culture de trois jours, pour atteindre un plateau à 22 ± 1,3 Ω cm2 (moyenne ± SEM). Pour comparaison, données de puces vierges sont incluses, montrant la variation marginale et la déviation par rapport à 0 Ω cm2 dans la même période par rapport à la variation et la valeur TEER des jetons avec des cellules. (B) microscopie de Fluorescence des noyaux teintés a révélé une monocouche continue de l’endothélium, tant sur le PDMS et la membrane à l’emplacement indiqué dans le médaillon. (C) , Immunofluorescence a révélé la présence de protéines Zonula Occludens-1, indiquant que des jonctions serrées entre les cellules spécifiques BBB donnent lieu à la TEER mesurée de la jonction serrée. Réimprimé et adaptée avec autorisation d’Elsevier. 16 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Dans ce manuscrit, le génie d’un dispositif d’orgue-on-chip et la détermination directe de la résistance électrique transendothéliale (TEER) d’une barrière cellulaire cultivée dans l’appareil ont été présentées. La méthode présentée d’intégrer les électrodes sans équipement de salle blanche et la détermination de TEER directe à l’aide de quatre électrodes s’applique à tout appareil d’orgue-on-chip avec deux compartiments de la microfluidique. L’agencement de la puce et la géométrie peuvent être adaptés pour répondre aux exigences des expériences envisagés, tant que les quatre électrodes sont séparées en deux compartiments. Les quatre électrodes peuvent même être idéalement insérés dans les criques de puces existantes, autant qu’ils sont fixés en place pendant la durée des six mesures. La méthode de collage sans fuite peut être optimisée pour différentes membranes et géométries de canal en changeant le ratio PDMS/toluène. Une teneur plus élevée en toluène entraîne un amincissement de la couche spin-enduit de mortier26 et peut être plus appropriée pour les canaux moins profondes et plus étroite dans les régions PDMS. Une basse toluène contenu se traduisent par un mortier plus épaisse couche26 et peut être plus approprié encadrer des membranes plus épais entre les pièces PDMS.
Comme peut être vu dans les spectres d’impédance schématique en Figure 2 a et des spectres expérimentaux dans Figure 2E et 2F, les mesures d’impédance sont influencés par la capacité de la double couche à l’interface électrode-moyen. En raison de l’exiguïté des électrodes à l’intérieur les microcanaux, la capacité de la double couche peut dominer le plateau résistif de la barrière cellulaire dans les spectres d’impédance, ce qui complique la quantification de la TEER. Pour y remédier, les électrodes peuvent être insérés dans les chaînes de culture avant la fixation. Cela augmentera la surface de l’électrode exposé au milieu de culture et que la capacité de la couche double augmentera aussi bien. Cela se traduit par un changement de la pente capacitif à des fréquences plus basses, alors que le plateau résistif de la barrière cellulaire peut être plus facilement reconnue et quantifiée. Bien que la résistance de la voie mesurée entre deux électrodes deviendra plus petite, cela n’influencera pas la quantification TEER suivant la méthode présentée.
Lorsque vous mesurez à travers la barrière cellulaire, il est possible que le plateau supplémentaire résistif ne saurait être admise. Cela peut être le résultat d’un lien fluidique entre ces deux canaux, par exemple, si la membrane est mal délimitée par le mortier, menant à un chemin d’accès mesurée autour de la barrière cellulaire. En outre, il peut y avoir de raccordement électrique à l’extérieur de la puce si les électrodes sont reliées par une goutte de milieu de culture. Ceci est généralement associé à une impédance mesurée inférieure et peut être résolu en supprimant ce pont du milieu de culture. Enfin, si il n’y a aucun plateau résistif et l’impédance mesurée est des ordres de grandeur plus élevés que prévu, il peut y avoir une mauvaise connexion du câblage électrique ou à la source d’alimentation.
À l’avenir, la pertinence physiologique de la BBB-on-chip actuel peut être augmentée en exposant les cellules endothéliales pour shear stress à des niveaux physiologiques, ce qui est signalé à promouvoir BBB différenciation et augmentation barrière étanchéité et est difficile à réaliser dans les modèles classiques en vitro . 29 en outre, le canal du bas de l’appareil présenté dispose d’un logement adapté pour encéphales de cellules pour être cultivées conjointement avec l’endothélium. Cela devrait aussi accroître la fonction barrière et permet également l’étude des interactions complexes entre les types de cellules concernées dans des conditions pathologiques. 29
En conclusion, le dispositif d’orgue-on-chip décrit dans cette publication peut être fabriqué à l’aide de matériel de laboratoire standard et est conçue pour permettre des mesures directes de TEER, à l’aide de quatre électrodes intégrées qui ne font pas obstacle à une inspection visuelle de la cellule étudiée couche. L’applicabilité de ce dispositif dans le domaine des organes-on-Chip a été démontrée en imitant la BHE dans cette puce et en surveillant la TEER durant la période de culture. Une foule d’autres organes (barrière) peut être imitée en incluant d’autres types de cellules pertinentes dans cette puce. En outre, la méthode de mesure TEER peut être facilement appliquée dans d’autres deux dispositifs d’orgue-on-chip axée sur le compartiment pour en arriver à des valeurs TEER reproductibles et significatifs qui peuvent être comparées sur les dispositifs et systèmes.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions sincèrement Johan Bomer pour la fabrication du moule et Mathijs Bronkhorst pour des discussions fructueuses et aide à la représentation des données.
Cette recherche a été financée par : SRO Biomedical Microdevices de L.I. Segerink, MIRA Institut de génie biomédical et des techniques de médecine, Université de Twente ; SRO organes-on-Chip de A.D. van der Meer, MIRA Institut de génie biomédical et des techniques de médecine, Université de Twente ; et VESCEL, ERC Advanced Grant à A. van den Berg (subvention no 669768).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Scotch Magic tape | 3M | ||
| Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
| UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
| hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
| Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Oven | Binder | 9010-0190 | |
| Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
| UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
| Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Incubator | Binder | CB E2 150 | |
| Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |
References
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