Summary
Denne protokollen gir eksperimentell trinn og informasjon om reagenser, utstyr og verktøy for forskere som er interessert i å utføre hele genomet matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) analyse av kopi nummer variasjoner i planter.
Abstract
Mutanter er uvurderlig genetiske ressurser for gen funksjon studier. Vil generere mutant samlinger, utnyttes tre typer mutagener, inkludert biologisk som T-DNA eller transposon, kjemiske som ethyl methanesulfonate (EMS) eller fysisk som ionisering stråling. Typen mutasjon observert varierer avhengig av mutagen brukes. For ionisering stråling indusert mutanter inkluderer mutasjoner sletting, kopiering eller omorganisering. Mens T-DNA eller transposon-baserte mutagenese er begrenset til arter som er utsatt for transformasjon, kan kjemisk eller fysisk mutagenese brukes til en rekke arter. Imidlertid er karakterisering av mutasjoner avledet fra kjemiske eller fysisk mutagenese tradisjonelt avhengig av en kart-basert kloning tilnærming som er arbeidsintensiv og tidkrevende. Her viser vi at en høy tetthet genomet matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (aCGH) plattform kan brukes for å effektivt oppdage og karakterisere kopi nummer variasjoner (CNVs) i mutanter avledet fra rask neutron bombardement (FNB) mutagenese i Medicago truncatula, Belgfrukt art. Hele genomet sekvens analyse viser at det er mer enn 50 000 gener eller genet modeller i M. truncatula. I dag, Soccer-indusert mutanter i M. truncatula er avledet fra mer enn 150.000 M1 linjer, som representerer uvurderlig genetiske ressurser for funksjonell studier av gener i genomet. Den aCGH plattformen beskrevet her er et effektivt verktøy for å karakterisere FNB-indusert mutanter i M. truncatula.
Introduction
Belgfrukter (Fabaceae) er den tredje største planter, med mange økonomisk viktigste arter som soyabønner (Glycine max) og alfalfa (Medicago sativa). Belgfrukt-planter kan samhandle med nitrogen-innfesting jord bakterier, vanligvis kalt Rhizobia å utvikle rot knuter der den stemningsfulle dinitrogen er redusert til ammoniakk for bruk av næringsplanten. Som sådan, dyrking av Belgfrukt avlinger krever litt input av nitrogen gjødsel og dermed bidrar til bærekraftig jordbruk. Belgfrukt avlinger produsere blader og frø med høye proteininnhold, serverer utmerket grovfôr og korn avlinger. Men har dyrket Belgfrukt arter generelt komplekse genomet strukturer, gjør funksjonelle studier av gener som spiller nøkkelroller i Belgfrukt-spesifikke prosesser tungvint. Medicago truncatula er allment vedtatt som modell Art for Belgfrukt studier hovedsakelig fordi (1) det har et diploide genom relativt liten haploid genomet størrelse (~ 550 Mbp); (2) planter kan forvandles stabilt for genet funksjonelle studier; og (3) det er nært knyttet til alfalfa (M. sativa), dronningen av forages og mange andre økonomisk viktigste avlinger for translational studier. Nylig det Genova orden M. truncatula cv Jemalong A17 har vært utgitt1,2. Merknad i genomet viser at det er mer enn 50.000 spådd gener eller genet modeller i genomet. For å bestemme funksjonen av de fleste av genene i M. truncatula er genom en utfordrende oppgave. For å lette funksjonelle studier av gener, en omfattende samling av mutanter mellom over 150 000 M1 linjene er generert ved hjelp av rask neutron bombardement (FNB) mutagenese i M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Rask neutron, en høy energi ionisering mutagen, har vært brukt i generere mutanter i mange plantearter inkludert Arabidopsis5,6, ris (Oryza sativa)7, tomat (Solanum lycopersicum), soyabønner (Glycine soja; G. max)8,9, bygg (Hordeum vulgare) og Lotus japonicus10. En stor del av mutasjoner avledet fra FNB mutagenese leies DNA slettinger som varierer i størrelse fra noen base parene til mega base parene9,11. Mange fenotypen-assosiert gener har blitt identifisert og preget4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. tidligere molekylær kloning av underliggende gener fra FNB mutanter lettelse opp på en kart-basert tilnærming som er tidkrevende og begrenser antall mutanter å være preget på molekylært nivå. Nylig flere gratis tilnærminger inkludert transkripsjon-baserte metoder, genomet flislegging matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) for DNA kopi nummer variant gjenkjenning og hele genomet sekvensering, har vært ansatt å lette den karakteristikk av sletting mutanter i ulike organismer inkludert dyr og planter20,21,22,23,24,25, 26,,27,,28,,29,,30,,31.
For å lette karakterisering av FNB mutanter i M. truncatula, en hel-genome matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) er plattform utviklet og godkjent. Som rapportert i dyr systemer, tillater matrise-basert CGH plattformen påvisning av kopi nummer variasjoner (CNVs) på hele genomet nivå i M. truncatula FNB mutanter. Videre lesjoner kan bekreftes av PCR og sletting grenser kan identifiseres ved sekvensering. Samlet er matrise CGH plattformen effektive for identifisere lesjoner i M. truncatula FNB mutanter. Her, er matrise CGH framgangsmåten og PCR karakteristikk av sletting grenser i en M. truncatula FNB mutant illustrert.
Følgende protokollen gir eksperimentell trinn og informasjon om reagenser, utstyr og verktøy for forskere som er interessert i å utføre hele genomet matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) analyse av antall kopier variasjoner i planter. Som et eksempel, ble Medicago truncatula FN6191 mutant brukt til å identifisere sletting regioner og kandidat gener tilknyttet mutant fenotyper. M. truncatula FN6191 mutant, opprinnelig isolert fra en rask neutron bombardement-indusert sletting mutant samling32 (se Tabell for materiale), viste en hyper-nodulation fenotypen etter vaksinering med jord bakterie, Sihorhizobium meliloti Sm1021, i motsetning til vill type planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: figur 1 viser de fem trinnene for matrisen CGH-protokollen. De er: 1) forberedelse av plantemateriale; 2) isolering av høy kvalitet DNA-prøver; 3) merking og rensing av DNA-prøver; 4) hybridisering, vask og skanning av hele genomet matriser; og 5) CGH dataanalyse. M. truncatula hele genomet fliser matriser inneholder totalt 971,041 unike oligo sonder målretting mer enn 50 000 gener eller genet modeller i genomet (se tabell over materialer). Unik sonder fordeles ca hver 150 base parene (bp) i exonic regioner og 261 bp i intronic områder av M. truncatula genomet.
1. forberedelse av plantemateriale
- Scarify vill type (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) og FN6191 mutant frø med konsentrert svovelsyre i 8 min (se Tabell for materiale). Kast svovelsyre til en flytende avfallsbeholderen.
- Skyll frø med autoklaveres deionisert vann tre ganger.
- Overflaten sterilisere frø med 20% bleike løsning for 10 min.
- Skyll frø med autoklaveres deionisert vann tre ganger.
- Store frø til 4 ° C i 3 dager. Etter vernalization, overføre og spirer frøene i jord for en uke i en vekst kammer med 16 h/8 h lys/mørke syklus og 150 µE/m 2 /s lysintensitet.
- Transplant planter til 1 gallon Potter og dyrke dem i et drivhus med 16 h/8 h lys/mørke syklus, 150 µE/m 2 /s lysintensiteten tre til fire uker. Samle små blad prøver fra planter DNA isolering.
2. Isolering av høy kvalitet DNA-prøver
- ta 1 g av små blad en og fryse det i flytende nitrogen umiddelbart.
- Grind frosne blad vev i flytende nitrogen med en morter fint pulver.
- Isolere genomisk DNA med en DNA-isolering kit (se Tabell av materialer).
- Resuspend renset DNA-prøver i 50 µL av autoklaveres dobbel deionisert H 2 O (ddH 2 O) eller 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0).
- Mål DNA konsentrasjoner med et spektrofotometer (se Tabell av materialer).
- Vurdere 260 nm/280 nm og 260 nm/230 nm prosenter av DNA-prøver.
Merk: Høy kvalitet DNA-prøver må 260 nm/280 nm forholdet ≥ 1,8 og en 260 nm/230 nm ≥ 2.0. - Videre evaluere DNA-prøver ved å kjøre dem i 1% agarose gels.
Merk: Høy kvalitet DNA-prøver bør ha høy molekylvekt og bør ikke være forurenset av RNA. Ideelt sett siste konsentrasjonen av DNA-prøver skal ~ 150 ng/µL.
3. DNA merking og rensing
- fortynne 1 µg genomisk DNA prøver med ddH 2 O til en endelig mengde 20 µL i et 500 µL sentrifuge rør.
- Legge til 5 µL av en tilfeldig primer (se Tabell of Materials) til røret.
- Vortex tube kort og legg den i en thermocycler til å ruge og denature DNA ved 98 ° C i 10 min.
- Ta røret ut av thermocycler og sette den umiddelbart på isen vann til chill 5 min.
- Forberede to merking blander som vist i tabell 1.
- Legge til 25 µL av merking mikser 1 og 2 referanse DNA og prøve DNA rør henholdsvis.
- Bland merking blanding og DNA av pipettering tre ganger og spinne rør kort.
- Satte rørene i en thermocycler å ruge på 37 ° C for 2t og deretter på 65 ° C for 20 min å deaktivere exo-Klenow enzymet (se Tabell av materialer).
- Legge til 430 µL av 1 x TE buffer til hver tube.
- Blande innholdet og spinne rør kort.
- Overføring løsningen i røret til en rensing kolonne med en 2 mL samling rør (se Tabell av materialer).
- Sentrifuger kolonnen rensing 14.000 x g for 10 min.
- Forkaste går gjennom løsning.
- Legge til 480 µL 1 x TE buffer til hver kolonne.
- Sentrifuger kolonnen igjen på 14 000 x g for 10 min.
- Forkaste pass-through løsningen.
- Overføre merket DNA prøven som forblir i den nederste delen av kolonnen slik nye sentrifuger.
- Måle mengden av merket DNA-prøve benytter en pipette og bringe det siste bindet til 80 µL med 1 x TE buffer.
- Måle konsentrasjonen av merket DNA prøven med et spektrofotometer (se Tabell av materialer).
- Miks en lik mengde merket eksempel DNA og referanse DNA og bringe det siste bindet til 160 µL med 1 x TE buffer.
- Legge til 256 µL av 2 x hybridisering buffer, 50 µL av menneskelig Cot-1 DNA og 50 µL av 10 × aCGH blokkerer agent (se Tabell for materiale) og bland dem godt av pipettering for tre ganger.
- Spinn rør kort og sette dem i en thermocycler å ruge på 98 ° C i 10 minutter
- Inkuber rørene på 37 ° C i 20 min.
4. Hybridisering, vaskemaskin, og skanning av genomet arrayene
- Forvarm ovnen hybridisering til 67 ° C minst 4 h før hybridisering starter.
- Plasserer en pakning lysbildet på bunnen av en hybridisering kammer.
- Last 490 µL av hybridisering løsning fra trinn 3.23 på pakningen lysbildet.
- Dekker pakning lysbildet med Medicago truncatula genomet microarray chip å danne en hybridisering kammer.
- Sett på hybridisering kammer dekker og stram kammeret fast festing.
- Sett samlet hybridisering kammeret i hybridisering ovnen og ruge ved 67 ° C i 40 – 48 h.
- Forberede tre lysbildet vaske: to med 250 mL vaske bufferen jeg holdt ved romtemperatur, og med å vaske bufferen II holdt på 37 ° C.
- Forberede to lysbildet vaske glassene: med 70 mL acetonitrile og med 70 mL stabilisering og tørking løsning, må begge avtrekksvifte ved romtemperatur (se Tabell av materialer).
- Fjern hybridisering kammeret fra ovnen og fjerne kammer klemmer og dekke.
- Flytte microarray chip og pakning skyve til et lysbilde vask parabolen med vaskebuffer jeg og skille chip fra forsiden lysbildet.
- Flytte microarray chip til andre lysbildet vask rett med vaskebuffer jeg og forsiktig sirkulere løsningen med rør bar på en magnetic røre plate ved romtemperatur for 5 min.
- Overføring til microarray chip til tredje lysbilde vaske parabolen med forvarmes vaske bufferen II og vaske det forsiktig med rør bar på en magnetic røre plate på 37 ° C i 1
- Overføre microarray chip til et lysbilde vaske krukke med acetonitrile i avtrekksvifte og vaske det for 30 s.
- Overføre microarray chip til et lysbilde vasking krukke med stabilisering og tørking løsning og vaske det for 30 s.
- Ta ut chip sakte og tørk den i 1
- Scan microarray chip bruker en skanner (se Tabell for materiale) under 2 µm oppløsning. Angi parametere for å lagre flere bilder og skyv hele skanninger. Angi kanaler 1 og 2 gevinst til 100% og avbryte automatisk forsterkningen.
5. CGH dataanalyse
- ekstrakt fluorescens Cy3 og Cy5 intensiteter for hver probe på tabellen ved hjelp av skanneprogramvaren (se Tabell av materialer).
- Bruk segmentering analyse av programvaren til å oppdage Kopier antall variasjoner (CNVs) mellom eksempel DNA og referanse DNA. Bruke en terskel for standardavvik for segmentet mener Logg 2 utvalg/referanse forholdet ± 2,5 for å bestemme CNVs.
- Inspiser distribusjon av Logg 2 utvalg/referanse prosenter over hele genomet benytter en signal kartlegging programvare (se Tabell av materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser fordelingen av normalisert Logg2 prosenter av mutant versus WT signaler over hele genomet. Analyse av CGH data viste en omtrentlig 22 kb sletting på Kromosom 4 som omfatter hele SUNN genet33 og flere andre kommenterte gener i FN6191 mutant (figur 2, Figur 3). Kandidaten slettede regionen var dekket av 73 påfølgende sonder på matrisen med mener normalisert Logg2 forholdstallene mindre enn-2.5 (ekstra tabell 1). Inspeksjon av sletting grenser foreslo at antatte sletting i denne mutant er flankert av sonder ligger mellom koordinater 22,313,168 og 22,334,934 på Kromosom 4 (Figur 3). For å bekrefte sletting grenser, PCR primere var ment å være ca 1500 bp fra spådd sletting grenser (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) og PCR forsterkning ble utført med disse veiledningene og følgende parametere: 94 ° C, 5 min; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 1,5 min; for 35 sykluser; 72 ° C, 10 min og deretter 10 ° C på ubestemt tid. Som forventet, var vellykket PCR enkeltprodukt ca 1,5 kb forsterket fra FN6191 mutant, men ikke WT (figur 4A). Basert på M. truncatula genomet utgivelsen v3.5, ble størrelsen på sletting i FN 6191 anslått til 26.67 kb (figur 4B). CGH resultatene viste at det finnes ingen andre unormale segmenter i FN6191 mutant genomet (figur 2).
Figur 1: Arbeidsflyt matrise sammenlignende genomisk hybridisering (aCGH) analyse av M. truncatula mutant. (A) forberedelse av plantemateriale: M. truncatula wild type (Jemalong A17) og FN6191 mutant ble dyrket i tre til fire uker i drivhuset. (B) isolering av høy kvalitet genomisk DNA: ett gram unge blader fra enkelt planter ble brukt til å isolere genomisk DNA. DNA kvalitet identifiserte bruker et spektrofotometer og gel geleelektroforese. (C) DNA merking og rensing. Genomic DNAs og eksperimentelle prøver ble merket med Cyanine 3 (Cy3) og Cy5 bruker en DNA merking kit og renset med en rensing kolonne. (D) hybridisering, vask og skanning av 1 x 1 M M. truncatula CGH matrise. (E) CGH analyse: logge2 prosenter av eksperimentell/referanse signaler som er mindre enn eller lik-2.5 eller større enn eller lik for 2.5 regnes som mulige slettinger og duplikasjoner, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Matrise basert sammenlignende genomisk hybridisering analyse av kopi nummer variasjoner i M. truncatula hyper nodulation mutant FN6191. Vises Logg2 mutant/wild type prosenter av sonder på alle åtte kromosomer. En sammenhengende 73-sonden regionen Kromosom 4 ble identifisert som den slettede regionen i mutant (pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Identifikasjon av slettet område i M. truncatula FN6191 mutant. Et nærbilde av regionen på Kromosom 4, der 73 microarray sonder utstilt betydelig redusert Logg2 mutant/wild type prosenter, og seks tilordnet gener inkludert SUNN (Medtr4g070970). Pilene angir plassering og retning av primere for PCR forsterkning av sletting grenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bekreftelse på sletting grenser i M. truncatula FN6191 mutant. (A) PCR forsterkning av sletting grenser: en 1,5 kb produktet ble forsterket fra FN6191 mutant bruker primere flankert sletting grenser (lane 1; MU). Samme sett med primere ikke forsterke produkter fra WT (M. truncatula Jemalong A17) på grunn av en størrelsesbegrensningen av PCR (lane 2; Wt). Lane M, 1 kb stigen. (B) sekvenser av sletting krysset i FN6191 mutant. En pil angir sletting krysset. (C) sekvensering resultatene viste at sletting grenser (piler) er plassert på koordinatene 22309163 og 22335836 på Kromosom 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Merking mix 1 | Per reaksjon x eksempel # (μL) | Merking mix 2 | Per reaksjon x refererer # (μL) |
| ddH2O | 6.0 x | ddH2O | 6.0 x |
| 5 x Buffer | 10,0 x | 5 x Buffer | 10,0 x |
| 10 x dNTPs | 5.0 x | 10 x dNTPs | 5.0 x |
| Cyanine 5 | 3.0 x | Cyanine 3 | 3.0 x |
| EXO-Klenow | 1.0 x | EXO-Klenow | 1.0 x |
| Totalt | 25 x | Totalt | 25 x |
Tabell 1: Merking mikser.
Supplerende tabell 1: Sonde sekvenser slettet i M. truncatula FN6191 mutant.
Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utviklet en matrise-basert CGH plattform av karakteristikk av rask Nøytron-bombardement (FNB)-indusert mutanter i M. truncatula cv. Jemalong A17. For å demonstrere bruk av matrisen CGH metoden oppdage genet mutasjoner, utført vi aCGH analyse av muterte FN6191, som viste en hyper-nodulation fenotypen i motsetning til vill type planter, når inokulert med S. meliloti Sm1021. For segmentering analyse, ble et segment ansett betydelig hvis loggen2 forholdet mener av sonder i segmentet var over øvre terskelen eller under nedre terskelen for sammenlikningen gitt matrise. Den øvre grensen for hver sammenligning var bestemt logg2 forholdet verdien av den 95te persentilen av alle datapunktene. Den lavere terskelen for hver sammenligning var bestemt logg2 forholdet mellom verdien av de 5 persentilen av alle dataene poeng24.
Vår analyse viste at betydelige kopi endres kan bestemmes ved å hente segmenter med en gjennomsnittlig normalisert Logg2 ratio større enn gjennomsnittet av 2,5 SD (duplisering) eller mindre enn gjennomsnittet av 2,5 SD (sletting). Basert på CGH analyse, oppdaget vi en sletting region med en anslått størrelse på 22 kb på Kromosom 4, omfatter SUNN genet33. Sekvensering resultater bekreftet at sletting størrelsen var 26.67 kb basert på M. truncatula genomet utgivelsen v3.5. Det har vist at SUNN koder en CLV1-lignende leucine-rik gjenta reseptor kinase som styrer hvor nodule M. truncatula33. CGH resultatene tyder på at FN6191 er en ny SUNN allelet. Basert på disse resultatene, tenkte vi at metoden CGH kombinert med fenotypiske og genetisk analyse kan brukes med hell til å raskt identifisere kandidat gener i FNB sletting mutanter. Over de siste årene, har vi brukt denne plattformen med å identifisere og karakterisere mange FNB mutanter for genet funksjonelle studier i M. truncatula34,35. Vi har generert en database med kopi nummer variasjoner (CNVs) tilknyttet FNB mutant linjer36. I denne databasen bekreftet slettet sekvenser fra CGH analyser av over 100 symbiotiske nodulation mutanter er tilordnet M. truncatula genomet. En eksplosjon server er angitt å lette søket etter slettede sekvenser i samlingen mutant. Utvikling og videre ekspansjon av sletting databasen vil være svært verdifull for funksjonell genomforskning forskning ved hjelp av M. truncatula FNB mutant ressurser.
ACGH-protokollen har fem hovedtrinn. Selv om alle trinnene er viktige og skal utføres nøye som beskrevet tidligere, followings er spesielt kritisk: (1) DNA-prøver bør ikke reduseres og bør ikke være forurenset av RNA under forberedelse trinn; (2) test og referanse DNA-prøver bør være like godt forberedt slik at merket prøvene er av samme høye kvalitet; (3) merket DNA-prøver må ikke utsettes for en høy intensitet av lys og et høyt nivå av ozon; og (4) det er viktig å vaske bufferen II på 37 ° C i vask trinn.
Dekningen av gjeldende M. truncatula genomet matrisen er primært på regionene exonic og mindre på regionene intronic og ikke i intergenisk områder. Dekning i sistnevnte områder kan forbedres hvis lesjoner i disse regionene er viktig for mutant fenotyper. På den annen side, har gjeldende sonden utforming mindre strøm identifisere liten mutasjoner og single nukleotid (SNPer). Denne begrensningen kan overvinnes ved hjelp av CGH + SNP microarray design37. Samlet er genomet matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (aCGH) plattformen et kraftig verktøy for analyse av antall kopier og strukturelle varianter i M. truncatula FNB mutanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Finansiering av dette arbeidet tilbys i en del av en bevilgning fra NSF anlegget Genome Research (IOS-1127155).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
