Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En Array-baserad jämförande genomisk hybridisering plattform för effektiv upptäckt av kopia antalet variationer i snabbt Neutron-inducerad Medicago truncatula mutanter

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56470
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

Summary

Det här protokollet ger experimentella anvisningar och information om reagenser, utrustning och analysverktyg för forskare som är intresserade av att genomföra hela genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) analys av kopia antalet variationer i växter.

Abstract

Mutanter är ovärderlig genetiska resurser för gen funktion studier. För att generera mutant samlingar, kan tre typer av mutagena ämnen utnyttjas, inklusive biologiska såsom T-DNA eller transposon, kemiska såsom etyl methanesulfonate (EMS) eller fysiska såsom jonisering strålning. Vilken typ av mutation observerade varierar beroende på den mutagen som används. För jonisering strålning inducerade mutanter inkluderar mutationer borttagning, dubbelarbete eller omflyttning. Även T-DNA eller transposon-baserat mutagenes är begränsad till arter som är mottagliga för omvandling, kan kemiska eller fysiska mutagenes tillämpas på ett brett spektrum av arter. Karakterisering av mutationer som härrör från kemisk eller fysikalisk mutagenes traditionellt är dock beroende av ett kartbaserat kloning tillvägagångssätt, som är labor intensiv och tidskrävande. Här, visar vi att en hög densitet genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (aCGH) plattform kan tillämpas för att effektivt upptäcka och karaktärisera kopia antalet variationer (CNVs) i mutanter som härrör från snabb neutron beskjutning (FNB) mutagenes i Medicago truncatula, släktet baljväxter. Hela genomet sekvens analysen visar att det finns fler än 50 000 gener eller gen modeller i M. truncatula. På nuvarande, FNB-inducerade mutanter i M. truncatula härrör från mer än 150 000 M1 linjer, som representerar ovärderliga genetiska resurser för funktionella studier av gener i genomet. ACGH plattformen beskrivs här är ett effektivt verktyg för att karaktärisera FNB-inducerade mutanter i M. truncatula.

Introduction

Ärtväxter (Fabaceae) är den tredje största familjen av blommande växter, med många ekonomiskt viktiga arter såsom sojabönor (Glycine max) och alfalfa (Medicago sativa). Baljväxt växter kan interagera med kvävefixerande jordbakterier, allmänt kallad Rhizobia att utveckla roten knölar där den atmosfäriska Kvävetetroxid minskas till ammoniak för användning av värdväxt. Som sådan, odling av baljväxter kräver liten insats av kväve gödselmedel och således bidrar till hållbart jordbruk. Baljväxter ger bladen och fröna med hög proteinhalt, som serverar utmärkt foder och spannmålsskörden. Odlade baljväxter arter har dock generellt komplexa genomet strukturer, att göra funktionella studier av gener som spelar viktiga roller i baljväxter-specifika processer omständligt. Medicago truncatula har allmänt antagits som en modell art för baljväxter studier främst eftersom (1) den har en diploida genomet med en relativt liten haploida genomet storlek (~ 550 Mbp); (2) växter omvandlas stabilt för genen funktionella studier; och (3) det är närbesläktat med alfalfa (M. sativa), drottningen av Vallfoder och många andra ekonomiskt viktiga grödor för translationella studier. Nyligen, genomsekvens av M. truncatula cv Jemalong A17 har släppt1,2. Annotering av genomet visar att det finns mer än 50.000 förutspådda gener eller gen modeller i genomet. För att avgöra funktionen av de flesta av generna i den M. truncatula är genomet en utmanande uppgift. För att underlätta funktionella studier av gener, en omfattande samling av mutanter i spänna av över 150 000 M1 rader har genererats med hjälp av snabb neutron beskjutning (FNB) mutagenes i M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Snabb neutron, hög energi jonisering mutagen, har använts i generera mutanter i många växtarter inklusive Arabidopsis5,6, ris (Oryza sativa)7, tomat (Solanum lycopersicum), sojabönor (Glycine soja; G. max)8,9, korn (Hordeum vulgare) och Lotus japonicus10. En stor del av mutationer som härrör från FNB mutagenes beror på DNA borttagningar som varierar i storlek från några baspar till mega baspar9,11. Många fenotyp-associerade gener har varit framgångsrikt identifieras och karakteriseras4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. tidigare, molekylär kloning av underliggande generna från FNB mutanter åberopade ett kartbaserat tillvägagångssätt som är tidskrävande och begränsar antalet mutanter att präglas på molekylär nivå. Nyligen, flera gratis metoder inklusive avskrift-baserade metoder, genomet plattsättning arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) för DNA kopia nummer variant upptäckt, och hela Genomsekvensering, har anställts för att underlätta den karakterisering av radering mutanter i olika organismer inklusive djur och växter20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

För att underlätta karakterisering av FNB mutanter i M. truncatula, en helgenom-arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) har plattformen utvecklats och validerats. Som rapporterats i djurens system, kan arraybaserade CGH plattformen kopiera antal variationer (CNVs) på hela genomet nivå i M. truncatula FNB mutanter. Dessutom lesioner kan bekräftas genom PCR och radering gränser kan identifieras genom sekvensering. Övergripande, den array-CGH plattformen är ett effektivt verktyg att identifiera lesioner i M. truncatula FNB mutanter. Här, illustreras i förfarandet för array-CGH och PCR-karakterisering av radering gränser i en M. truncatula FNB mutant.

Följande protokoll ger experimentella anvisningar och information om reagenser, utrustning och analysverktyg för forskare som är intresserade av att genomföra hela genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) analys av kopia antal variationer i växter. Som ett exempel, var Medicago truncatula FN6191 mutant används för att identifiera radering regioner och kandidatgener associerade med muterade fenotyper. M. truncatula FN6191 mutant, ursprungligen isolerats från en snabb neutron beskjutning-inducerad radering mutant samling32 (se Tabell för material), uppvisade en hyper-nodulationen fenotyp efter inokulering med marken bakterie, Sihorhizobium meliloti Sm1021, i motsats till vildtyp växter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: figur 1 visar de fem stegen för matrisen CGH protokoll. De är: 1) beredning av växtmaterial; (2) isolering av hög kvalitet DNA-prover; (3) märkning och rening av DNA-prover; (4) hybridisering, tvätt och scanning av hela genomet arrayer; och 5) CGH dataanalys. M. truncatula hela genomet plattsättning arrayer innehåller sammanlagt 971,041 unika oligo-prober som riktar sig till mer än 50 000 gener eller gen modeller i genomet (se tabell material). De unika sonderna är fördelade ungefär varje 150 baspar (bp) i exonic regioner och 261 bp i intronic regioner i genomet M. truncatula.

1. beredning av växtmaterial

  1. Scarify vildtyp (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) och FN6191 mutant frön med koncentrerad svavelsyra i 8 min (se Tabell för material). Avlägsna och kassera sulfuric syra till en flytande avfall behållare.
  2. Skölj fröna med Ånghärdad avjoniserat vatten tre gånger.
  3. Yta sterilisera frön med 20% blekmedel lösning för 10 min.
  4. Skölj fröna med Ånghärdad avjoniserat vatten tre gånger.
  5. Store frön vid 4 ° C i 3 dagar. Efter vernalization, överföra och gror frön i marken för en vecka i en tillväxt kammare med 16 h/8 h ljus/mörk cykel och 150 µE/m 2 /s ljusintensitet.
  6. Fröplantorna till 1 gallon krukor och odla dem i ett växthus med 16 h/8 h ljus/mörk cykel, 150 µE/m 2 /s ljusintensiteten för tre till fyra veckor. Samla in unga blad prover från växterna för DNA isolering.

2. Isolering av hög kvalitet DNA-prov

  1. ta 1 g unga bladvävnad från en enda planta och frysa den i flytande kväve omedelbart.
  2. Mala frusna bladvävnad i flytande kväve med en mortel och stöt till fina pulver.
  3. Isolera genomiskt DNA med en DNA-isolering kit (se Tabell för material).
  4. Omsuspendera renade DNA-prover i 50 µL av Ånghärdad dubbel avjoniserat H 2 O (ddH 2 O) eller 1 x TE buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).
  5. Åtgärd DNA koncentrationer med en spektrofotometer (se Tabell för material).
  6. Utvärdera 260 nm/280 nm och 260 nm/230 nm utväxlingar av DNA-prover.
    Obs: Hög kvalitet DNA-prover bör ha förhållandet 260 nm/280 nm ≥ 1.8 och förhållandet 260 nm/230 nm ≥ 2.0.
  7. Ytterligare utvärdera DNA-prover genom att köra dem i 1% agaros geler.
    Obs: Hög kvalitet DNA-prov bör ha hög molekylvikt och bör inte vara förorenat av RNA. Helst, DNA-prover slutliga koncentration bör vara ~ 150 ng/µL.

3. DNA märkning och rening

  1. Späd 1 µg genomiskt DNA prover med ddH 2 O till en slutlig volym av 20 µL i ett 500 µL centrifugrör.
  2. Tillsätt 5 µL av en slumpmässig primer (se Tabell för material) till röret.
  3. Vortex röret kort och Lägg den i en termocykler Inkubera och denaturera DNA vid 98 ° C i 10 min.
  4. Ta röret ur termocyklern och placera den omedelbart på isvatten till chill för 5 min.
  5. Förbered två märkning blandar som visas i tabell 1.
  6. Lägg till 25 µL märkning mixar 1 och 2 till referens DNA och prov DNA-rör respektive.
  7. Blanda märkning mix och DNA genom pipettering tre gånger och snurra rören kort.
  8. Lägg rören i en termocykler Inkubera vid 37 ° C i 2 h och sedan vid 65 ° C i 20 min till inaktivera enzymet exo-Klenow (se Tabell för material).
  9. Lägg till 430 µL av 1 x TE buffert till varje rör.
  10. Blanda innehållet och snurra rören kort.
  11. Överföring lösningen i röret till en rening kolumn med en 2 mL samling röret (se Tabell för material).
  12. Centrifugera kolumnen rening vid 14 000 x g i 10 min.
  13. Kasta passet genom lösning.
  14. Lägg till 480 µL 1 x TE buffert till varje kolumn.
  15. Centrifugera kolumnen igen vid 14 000 x g i 10 min.
  16. Kasta pass-through lösningen.
  17. Överföra märkt DNA-provet som ligger kvar på den nedre delen av kolumnen till ett nytt centrifugrör.
  18. Mäta volymen av märkt DNA-provet med pipett och föra den slutliga volymen till 80 µL med 1 x TE buffert.
  19. Mätning av koncentrationen av de märkta DNA-prov med en spektrofotometer (se Tabell för material).
  20. Blanda en lika stor mängd märkt provet DNA och referera DNA och föra den slutliga volymen till 160 µL med 1 x TE buffert.
  21. Lägg till 256 µL av 2 x hybridisering buffert, 50 µL humant Cot-1 DNA och 50 µL 10 × aCGH blockerande medel (se Tabell av material) och blanda dem väl genom pipettering för tre gånger.
  22. Snurra rören kort och sätta dem i en termocykler ruva på 98 ° C i 10 min.
  23. Inkubera rören vid 37 ° C i 20 min.

4. Hybridisering, tvättmaskin, och Scanning av de genomet arrayer

  1. pre värma hybridisering ugnen till 67 ° C minst 4 h innan hybridisering startar.
  2. Placera en packning bild på basen av en hybridisering kammare.
  3. Last 490 µL hybridisering lösning från steg 3,23 in i packning bilden.
  4. Täcka packning bilden med en Medicago truncatula genomet microarray chip att bilda en hybridisering kammare.
  5. Sätta på hybridisering kammare omslag och dra åt kammaren ordentligt med klämmor.
  6. Sätta den monterade hybridisering kammaren in i hybridisering ugnen och inkubera vid 67 ° C för 40-48 h.
  7. Förbereda tre bild diska: två med 250 mL tvätt buffert jag höll till vid rumstemperatur och en med tvätt buffert II höll vid 37 ° C.
  8. Förbered två bild tvätt burkar: en med 70 mL acetonitril och en med 70 mL stabilisering och snabbtorkande lösning; Behåll båda i ett dragskåp vid rumstemperatur (se Tabell för material).
  9. Ta bort hybridisering kammaren från ugnen och kammare klämmorna och omslaget.
  10. Flytta den microarray chip och packning Skjut till en bild tvagningen maträtt med tvättbuffert jag och separata chip från täcka bilden.
  11. Flytta microarray chip till den andra bild tvagningen rätt med tvättbuffert jag och försiktigt cirkulera lösningen med en uppståndelse bar på en magnetisk uppståndelse tallrik i rumstemperatur i 5 min.
  12. Överföring av microarray chip till tredje bild tvätta skålen med pre värmde tvätt buffert II och tvätta försiktigt med en uppståndelse bar på en magnetisk uppståndelse tallrik vid 37 ° C i 1 min.
  13. Överföra microarray chip till en bild som tvätt burk med acetonitril i ett dragskåp och tvätta den för 30 s.
  14. Överföra microarray chip till en bild tvätt burk med stabilisering och torkning lösningen och tvätta den för 30 s.
  15. Ta ut chipet långsamt och torka den för 1 min.
  16. Skanna microarray chip med en skanner (se Tabell för material) under 2 µm upplösning. Ställ in parametrar för att spara flera bilder och hela bilden skanningar. Ställa in kanaler 1 och 2 vinster till 100% och avbryta auto vinst.

5. CGH dataanalys

  1. extrakt Cy3 och Cy5 fluorescensen stödnivåer för varje sond på matrisen använder skanningsprogrammet (se Tabell för material).
  2. Använd segmentering analys av programvaran för att upptäcka kopia antalet variationer (CNVs) mellan prov DNA och referens DNA. Använda ett tröskelvärde på segment betyder log 2 prov/referens baserat ± 2,5 standardavvikelser för att fastställa CNVs.
  3. Inspektera fördelningen av log 2 prov/referens nyckeltal över hela genomet använder en signal kartprogram (se Tabell för material).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 visar fördelningen av normaliserade log2 nyckeltal av muterade kontra WT signaler över hela genomet. Analysen av CGH data visade en ungefärlig 22 kb borttagning på kromosom 4 som omfattar den hela SUNN gen33 och flera andra kommenterade gener i FN6191 mutant (figur 2, figur 3). Regionen kandidat borttagna täcktes av 73 i följd sonder på matrisen med de genomsnittliga normaliserade logg där förhållanden mellan2 är mindre än -2,5 (kompletterande Tabell1). En inspektion av radering gränser föreslog att förmodad borttagningen i denna mutant flankeras av sonder som ligger mellan koordinater 22,313,168 och 22,334,934 på kromosom 4 (figur 3). Bekräfta radering gränser genom PCR primers var utformad för att vara cirka 1 500 bp frånsett de förutspådda strykning gränserna (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) och PCR-amplifiering utfördes med dessa primers och följande parametrar: 94 ° C, 5 min; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 1,5 min; för 35 cykler; 72 ° C, 10 min och sedan 10 ° C på obestämd tid. Som förväntat, förstärktes framgångsrikt en PCR produkt cirka 1,5 KB från FN6191 mutant, men inte WT (figur 4A). Baserat på den M. truncatula genomet release v3.5, uppskattades storleken på borttagningen i FN 6191 vara 26.67 kb (figur 4B). CGH resultaten visade att inga andra onormala segment finns i FN6191 mutant genomet (figur 2).

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för array jämförande genomisk hybridisering (aCGH) analys av M. truncatula mutant. (A) beredning av växtmaterial: M. truncatula vildtyp (Jemalong A17) och FN6191 mutant odlades för tre till fyra veckor i växthus. (B) isolering av hög kvalitet genomiskt DNA: ett gram av unga blad från enstaka växter användes för att isolera genomiskt DNA. DNA kvalitet bestämdes med en spektrofotometer och gel elektrofores. (C), DNA märkning och rening. Genomisk DNAs och experimentprover var märkt med cyanin 3 (Cy3) och Cy5 använder en DNA märkning kit och renas med hjälp av en rening kolumn. (D) hybridisering, tvätt och scanning av 1 x 1 M M. truncatula CGH matris. (E), CGH analys: Logga2 förhållanden av experimentell/referens signaler som är mindre än eller lika med -2,5 eller större än eller lika med 2,5 betraktas som förmodad borttagningar och dubbelarbete, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Array baserat jämförande genomisk hybridisering analys av kopia antalet variationer i M. truncatula hyper nodulationen mutant FN6191. Visas är log2 mutant/vild typ nyckeltal av sonder på alla åtta kromosomer. En sammanhängande 73-probe-området på kromosom 4 identifierades som regionen borttagna i mutant (pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Identifiering av borttagna region i M. truncatula FN6191 mutant. En närbild av regionen på kromosom 4, där 73 microarray sonder uppvisade signifikant minskad log2 mutant/vild typ nyckeltal, och sex mappas gener inklusive SUNN (Medtr4g070970). Pilarna anger plats och riktning av primers för PCR-amplifiering av radering gränser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Bekräftelse av radering gränsar i M. truncatula FN6191 mutant. (A), PCR amplifiering av radering gränser: en 1,5 kb produkt förstärktes från FN6191 mutant med primers som flankerar radering gränser (lane 1; MU). Samma uppsättning primers inte förstärka några produkter från WT (M. truncatula Jemalong A17) på grund av en storleksbegränsning av PCR (lane 2; WT). Lane M, 1 kb stege. (B) sekvenser av radering korsningen i FN6191 mutant. En pil anger borttagning korsningen. (C) sekvensering resultat visade att radering gränser (pilar) ligger på koordinaterna 22309163 och 22335836 på kromosom 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Märkning mix 1 Per reaktion x prova # (μL) Märkning mix 2 Per reaktion x referens # (μL)
ddH2O 6,0 x ddH2O 6,0 x
5 x buffert 10,0 x 5 x buffert 10,0 x
10 x dNTPs 5,0 x 10 x dNTPs 5,0 x
Cyanin 5 3,0 x Cyanin 3 3,0 x
EXO-Klenow 1,0 x EXO-Klenow 1,0 x
Totalt 25 x Totalt 25 x

Tabell 1: Märkning mixar.

Kompletterande tabell 1: Sonden sekvenser bort i M. truncatula FN6191 mutant.
Klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utvecklat en matris-baserad CGH plattform för upptäckt och karakterisering av snabb neutron beskjutning (FNB)-inducerade mutanter i M. truncatula cv. Jemalong A17. För att demonstrera användningen av matrisen CGH metod att upptäcka genmutationer, utfört vi aCGH analys av muterat FN6191, som ställde ut en hyper-nodulationen fenotyp i motsats till vildtyp växter, när inokuleras med S. meliloti Sm1021. För segmentering analys ansågs ett segment betydande om förhållandet log2 menar av sonderna inom segmentet var övre tröskelvärdet eller det lägre tröskelvärdet för att given matris jämförelse. Den övre gränsen för varje jämförelse fastställdes vara log2 baserat på värdet av den 95: e percentilen av alla datapunkter. Det lägre tröskelvärdet för varje jämförelse fastställdes vara log2 baserat på värdet av den 5: e percentilen av alla data punkter24.

Vår analys visade att betydande kopia ändras kan bestämmas genom att hämta segment med en genomsnittlig normaliserad log2 förhållande som är större än genomsnittet av 2,5 SD (dubblering) eller mindre än genomsnittligt av 2,5 SD (radering). Baserat på CGH analys, upptäckt vi en radering region med en uppskattad storlek på 22 kb på kromosom 4, som omfattar de SUNN gen33. Sekvensering resultat bekräftade att radering storlek var 26.67 kb baserat på M. truncatula genomet release v3.5. Det har visats att SUNN kodar en CLV1-liknande leucin-rika upprepa receptor tyrosinkinashämmare som styr antalet knöl i M. truncatula33. Våra CGH resultat tyder på att FN6191 är en ny SUNN -allel. Baserat på dessa resultat resonerade vi att metoden CGH tillsammans med fenotypisk och genetisk analys kan framgångsrikt användas för att snabbt identifiera kandidatgener i FNB radering mutanter. Under de senaste åren, har vi använt denna plattform att identifiera och karakterisera många FNB mutanter för genen funktionella studier i M. truncatula34,35. Vi har skapat en databas med kopia antalet variationer (CNVs) associerade med FNB mutant linjer36. I denna databas bekräftade borttagna sekvenser från CGH analyser av över 100 symbiotiska nodulationen mutanter har mappats till M. truncatula genomet. En blast server har ställts in att underlätta sökandet efter borttagna sekvenser i samlingen mutant. Utveckling och ytterligare expansion av radering databasen skulle vara mycket värdefulla för funktionsgenomik forskning använder M. truncatula FNB mutant resurser.

ACGH protokollet har fem viktiga steg. Även om alla åtgärder är viktiga och bör utföras noggrant som tidigare beskrivits, följande är särskilt kritisk: (1) DNA-prov bör inte degraderas och bör inte vara förorenat av RNA under beredning steg; (2) test- och referensartiklar DNA-prover bör vara lika väl förberedd så att de märkta proverna är av samma höga kvalitet. (3) märkt DNA-prover bör inte utsättas för en hög intensitet ljus och en hög nivå av ozon; och (4) det är viktigt att hålla tvätt buffert II vid 37 ° C under tvätt steg.

Täckningen av nuvarande M. truncatula genomet matrisen är primärt på exonic regioner och mindre de intronic regionerna, och inte alls i intergenic regioner. Täckningen i de sistnämnda regionerna kan förbättras om lesioner i dessa områden är viktiga för mutant fenotyper. Däremot, har den nuvarande probe-designen mindre makt att identifiera små mutationer och enda nukleotid polymorfismer (SNP). Denna begränsning kan övervinnas med hjälp av CGH + SNP microarray design37. Sammantaget är genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (aCGH) plattformen ett kraftfullt verktyg för analys av kopienummer och strukturella variationer i M. truncatula FNB mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete finansieras delvis genom ett bidrag från NSF växtforskning genomet (IOS-1127155).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

Tags

Genetik frågan 129 Medicago truncatula snabb neutron beskjutning mutanter arraybaserade jämförande genomisk hybridisering kopiera nummer variation mutation upptäckt mutation
En Array-baserad jämförande genomisk hybridisering plattform för effektiv upptäckt av kopia antalet variationer i snabbt Neutron-inducerad <em>Medicago truncatula</em> mutanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang,… More

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter