Summary
Abbiamo generato con successo due saggi di substrato specifico γ-secretasi. Entrambi analisi cell-based qui presentate sono progettate per quantificare le attività enzimatiche γ-secretasi tramite l'uscita dei reporter luciferasi firefly.
Abstract
Abbiamo sviluppato un paio di saggi gene reporter basati su celle a misurare quantitativamente γ-secretasico di distinti substrati. Questo manoscritto descrive le procedure che possono essere utilizzate per monitorare γ-secretasi-mediata di clivaggio di APP-C99 o tacca, utilizzando un sistema di Gal4 promotore-driven firefly luciferase reporter. Queste analisi sono state stabilite da stabile co-trasfezione cellule HEK293 con il gene del reporter di luciferase Gal4-driven e frammento C-terminale Gal4/VP16-etichetta dell'APP (APP-C99; Cellule CG), o il Gal4/VP16-etichetta tacca-ΔE (NΔE; Cellule di NG). Usando questi saggi reporter in parallelo, abbiamo dimostrato che un inibitore di ErbB2, CL-387.785, preferenzialmente può sopprimere γ-secretasico di APP-C99 in cellule di CG, ma non NΔE in cellule di NG. Le risposte differenziali hanno esibite dalle cellule del CG e NG, quando trattati con CL-387.785, rappresentano una caratteristica preferita per modulatori di γ-secretasi, e queste risposte sono in netto contrasto con la pan-inibizione di γ-secretasi indotta da DAPT. I nostri studi forniscono la prova diretta che attività di γ-secretasi verso substrati differenti possono essere differenziati in un contesto cellulare. Questi nuovi test può quindi essere strumenti utili nella scoperta della droga per terapie AD migliori.
Introduction
Forme oligomeriche di amiloide-β (Aβ) sono credute per essere la causa primaria della neurodegenerazione nel cervello dei pazienti affetti da morbo di Alzheimer (annuncio)1. Peptidi Aβ sono prodotte tramite la fenditura graduale della proteina precursore dell'amiloide (APP), in primo luogo da β-secretasi e poi da γ-secretasi2. Nell'ultimo decennio, si sono concentrati sulla prevenzione della produzione di Aβ3approcci terapeutici verso trattamento dell'annuncio. La maggior parte degli studi si è concentrati su entrambi l'aumento dell'attività α-secretasi, che può precludere γ-secretasico dell'APP e quindi diminuire la produzione di Aβ, o l'inibizione di β-e/o γ-secretasi attività4. Purtroppo, l'inibizione non selettiva di β - o γ-secretasi provoca inevitabili effetti collaterali che sono a causa di interferenze con il funzionamento di altri substrati fisiologici di β - e γ-secretasi5,6. Per quanto riguarda gli inibitori di γ-secretasi, studi recenti hanno riferito la scoperta di un numero di modulatori chimici e genetici che possono regolare la produzione di Aβ pur esercitando effetti trascurabili sul trattamento essenziale di γ-secretasi-mediata della tacca7 ,8,9,10,11,12, tuttavia, terapeutica di successo non sono state ancora sviluppate. Così, ulteriori schermi sistematici sono autorizzati a scoprire romanzo modificatori genetici e chimici che possono modulare selettivamente γ-secretasi-mediata del processamento di APP.
Γ-secretasi sono conosciuto per più di 90 diverse proteine ancorata alla membrana. Tra questi substrati è tacca, la cui attività è fondamentale per la determinazione di destino delle cellule e differenziazione durante lo sviluppo13. Selettivamente modulando APP γ-secretasi-catalizzata di elaborazione in assenza di pregiudicare la tacca elaborazione sarà essenziale per minimizzare effetti collaterali correlati al tacca di γ-secretasi inibitori, e questa selettività è pensata per essere un fattore primario che verrà dettare l'efficacia biologica di potenziali modulatori di γ-secretasi per il trattamento cronico dell'annuncio. Ci sono stati un certo numero di derivati arylsulfonamide, come GSI-953 (begacestat) e BMS-708163 (avagacestat), che sono stati trovati per esibire l'inibizione potente e selettivo di γ-secretasi14,15. Uno studio precedente ha dimostrato che l'inibizione differenziale di γ-secretasico di APP e tacca può essere osservato utilizzando un test ELISA quantitativo in combinazione con la convalida in vivo utilizzando zebrafish16. Inoltre, paradigmi di analisi basati su cellule sono state stabilite per affrontare il potenziale selettività di substrato di γ-secretasi verso APP e tacca17,18. Utilizzando protocolli simili a quelle descritte nel presente documento, abbiamo recentemente scoperto una nuova classe di (D)-leucinamides che modulano potentemente γ-secretasico di APP con tacca-con parsimonia selettività19. Insieme, questa raccolta di studi fornisce un proof-of-concept sostiene la nozione che la selettività/disponibilità del substrato di γ-secretasi possono essere soggetti a verifiche sperimentali e modulazione chimica. Tuttavia, queste piattaforme di analisi spesso si basano su letture relativamente bassa produttività e laboriosi approcci che potrebbero non soddisfare gli standard industriali per programmi di scoperta della droga.
Recentemente abbiamo generato le analisi di gene reporter luciferasi basati su cellule che possono determinare quantitativamente l'attività catalitica di γ-secretasi verso due distinti substrati, il frammento C-terminale acido 99-amminico dell'APP (APP-C99) ed extracellulare dominio-eliminato peptide tacca (NΔE). Sia APP-C99 e NΔE sono stati ampiamente utilizzati come substrati diretti di γ-secretasi in vari saggi. Per generare analisi di gene reporter luciferasi omogenea e coerente per il γ-secretasico di APP-C99 o NΔE, abbiamo generato una linea cellulare stabile HEK-derivata (CG) che esprime costitutivamente un Gal4 promotore-driven firefly luciferase reporter ( Gal4-Luc) e proteina di fusione Gal4/VP16-taggati APP-C99 (C99-GV). Inoltre, abbiamo generato un'altra linea cellulare stabile HEK-derivata (NG) che esprime costitutivamente Gal4-Luc e Gal4/VP16-etichetta NΔE (NΔE-GV). Utilizzando queste analisi romanzo substrato specifico γ-secretasi, ora forniamo un metodo per quantificare e distinguere l'attività catalitica di γ-secretasi verso distinti substrati (APP-C99 in cellule di CG), o NΔE in cellule di NG. Inoltre, i saggi di substrato specifico γ-secretasi sono stati progettati per essere favorevole alla piattaforme di screening ad alto contenuto. Queste analisi appena generato γ-secretasi potrebbero spianare la strada per la scoperta dei modulatori di romanzo γ-secretasi che potrebbe migliorare la funzione conoscitiva sopprimendo la produzione di Aβ senza provocare indesiderato inibizione di tacca per il trattamento di nuova generazione dell'annuncio.
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Protocol
1. misura di segnali di Reporter luciferasi, che corrispondono a γ-secretasico di APP-C99 o NΔE
Nota: Consultare le pubblicazioni precedenti per le descrizioni dettagliate della generazione di CG e NG cellule20,21.
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NG o CG celle di semi (20, 000 cellule per pozzetto) a 96 pozzetti in un volume finale di 200 μL/pozzetto in mezzo di crescita che è composto per volta Eagle Medium (DMEM) maggiorato del 10% siero bovino fetale di Dulbecco (FBS), 5 μg/mL Consciousness, 250 antibiotico μg/mL (ad es. zeocina) e 200 μg/mL igromicina B.
- Contare le celle con un emocitometro.
- Trasferire un incubatore di CO2 micropiastre e incubare a 37 ° C durante la notte.
- Rimuovere 100 μL di coltura da ogni pozzetto.
- Aggiungere 100 μL/pozzetto di crescita media contenente 2 tetraciclina μg/mL con entrambi 0,2% dimetilsolfossido (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) o altri correlati ErbB1/ErbB2 inibitori.
- Incubare le cellule trattate di CG o NG in micropiastre a 37 ° C per 24 h.
- Rimuovere 150 μL/pozzetto crescita medio da micropiastre.
- Aggiungere 50 μL/pozzetto luciferase assay reagente (Vedi Tabella materiali).
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Trasferire le micropiastre a un lettore di micropiastre di luminescenza.
- Mantenere le micropiastre a temperatura ambiente per 5 minuti con agitazione delicata.
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Determinare il Firefly luciferase (FL)-emessa luminescenza utilizzando un programma pre-definito memorizzati nel lettore di micropiastre di luminescenza.
- Aprire il software di controllo dello strumento (Vedi Tabella materiali per dettagli sullo strumento).
- Dal menu 'Strumenti', selezionare 'Parametri'.
- Sotto le impostazioni 'Parametri', non scegli 'Nessun filtro' per filtro di emissione, tick 'normale' per apertura di emissione, invio '1' per tempo di conteggio e fare clic su 'OK' per impostare la lettura di luminescenza.
- Sotto la scheda 'Strumento controllo', scorrere l'elenco dei protocolli attivi e selezionare il protocollo pre-memorizzato per la lettura di luminescenza.
- Sotto la scheda 'Visualizzazione Live', definire la scala dall'elenco a discesa e selezionare 'Logaritmo' o 'Lineare' per il tipo.
- Sotto la scheda 'Temperatura', selezionare 'Off' per riscaldamento della piastra.
- Fare clic sul pulsante 'Start' per eseguire la lettura di luminescenza.
- Se necessario, è possibile esportare i risultati in un formato di foglio di calcolo usando il 'Explorer' incorporato all'interno del software di controllo.
2. quantificazione delle attività γ-secretasi
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Definire un segnale di luminescenza emessa da CG o NG cellule trattate con 0,1% DMSO in terreno di coltura contenente 1 tetraciclina μg/mL da solo come attività relativa γ-secretasi di 100%.
- Stima sfondo luminescenza da CG o NG celle trattando le cellule con il mezzo di crescita che non include tetraciclina.
- Normalizzare la luciferasi segnali dalle cellule CG o NG che sono coltivate con terreno di coltura contenente 1 tetraciclina μg/mL ed entrambi 1 μM CL-387.785 o 1 μM di DAPT con il segnale di luciferasi emessa dal CG DMSO-trattati o NG cellule (attività relativa γ-secretasi di 100%, come definito al punto 2.1).
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Representative Results
Inibizione di ErbB2 da CL-387.785 differenzialmente può promuovere l'elaborazione di APP-C99 di Γ -secretasi senza intaccare il clivaggio di Notch
Per stabilire un'analisi basata sulle celle che possono misurare quantitativamente il clivaggio proteolitico di un substrato particolare γ-secretasi, abbiamo generato la linea cellulare derivata da HEK293 CG di co-trasfezione stabile di una tetraciclina-inducible C-terminale Gal4/VP16-etichetta APP-C99 e un gene del reporter Gal4 promotore-driven firefly luciferase. Una parallela linea cellulare NG nasce anche analizzare per il γ-secretasico di NΔE. In cellule di NG, una tetraciclina-inducible C-terminale Gal4/VP16-etichetta NΔE e un gene del reporter luciferasi promotore-driven Gal4 erano stabilmente co-trasfettate in cellule HEK293. Il γ-secretasico di APP-C99 in cellule di CG e il γ-secretasico di NΔE in cellule di NG sono stati confermati in primo luogo trattando le cellule CG e NG con varie concentrazioni di DAPT, un inibitore della γ-secretasi pan che blocca il clivaggio del tutto γ-secretasi substrati ( Figura 1). I dati hanno dimostrato anche che γ-secretasi in CG andNG cellule hanno esibite i livelli comparabili di catalisi.
Per convalidare l'efficienza dei saggi basati su cellule substrato specifico per fenditure di γ-secretasi, abbiamo esaminato i segnali di luminescenza in CG e NG cellstreated con un inibitore doppio di ErbB1/2 CL-387.785, che ha dimostrato di differenziale modulano Γ-secretasico di APP-C99 e NΔE21. Precedentemente abbiamo identificato CL-387.785 come modulatore selettivo γ-secretasi a causa della sua interferenza con l'interazione proteina-proteina tra presenilina-1 (PS1) e C99 e mancanza di interferenza con l'interazione tra PS1 e NΔE21. Qui, i dati mostrano che il trattamento con CL-387.785 bloccato efficacemente l'elaborazione di APP-C99 in cellule di CG, mentre la proteolisi di NΔE in cellule di NG non era interessato (Figura 2). Questi risultati dimostrano l'efficacia delle cellule CG e NG nella distinzione tra clivaggio C99 e NΔE, in un formato che è favorevole a piattaforme di screening ad alta resa.
Figura 1: il dosaggio di γ-secretasi cellulari APP-C99-specifici (cellule di CG). CG cellule sono state seminate su 96 pozzetti (20.000 cellule/pozzetto) durante la notte e trattata con 1 μM di CL-387.785 o DAPT in presenza di tetraciclina di 1 μg/mL a 37 ° C per 24 h. La luminescenza derivata da proteolisi γ-secretasi-mediata di C99-GV è stata quantificata dopo l'aggiunta di 100 μL/pozzetto luciferase assay reagente. Il segnale di luciferasi emesso dalle cellule trattate con veicolo da solo (0,1% DMSO) è stato impostato come 100% relativa luminescenza. I dati vengono visualizzati come la media ± SD da tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: l'analisi di γ-secretasi cellulari tacca-specific (cellule NG). NG cellule sono state seminate su 96 pozzetti (20.000 cellule/pozzetto) durante la notte e trattata con 1 μM di CL-387.785 o DAPT in presenza di tetraciclina di 1 μg/mL a 37 ° C per 24 h. La luminescenza derivata da proteolisi γ-secretasi-mediata di NΔE-GV è stata quantificata dopo l'aggiunta di 100 μL/pozzetto luciferase assay reagente. Il segnale di luciferasi emesso dalle cellule trattate con veicolo da solo (0,1% DMSO) è stato impostato come 100% relativa luminescenza. I dati vengono visualizzati come la media ± SD da tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I promettenti risultati da uno studio di fase 1b di immunoterapia aducanumab per annuncio hanno stabilito saldamente il ruolo critico di Aβ nella patogenesi dell'AD22 e suggeriscono che gli approcci anti-Aβ sono ancora una valida strategia per lo sviluppo di farmaci anti-annuncio. Qui, descriviamo analisi cell-based per quantificare γ-secretasi-catalizzata di proteolisi di APP-C99 e NΔE utilizzando sistemi di firefly luciferase reporter. APP-C99 e NΔE sono i due substrati di γ-secretasi più ben studiati e insieme rappresentano entrambe le attività patogene e fisiologiche di γ-secretasi13. Nostri risultati che downregulation di ErbB2 da CL-387.785 preferenzialmente può ridurre i livelli allo stato stazionario di APP-C99 e secernuto Aβ sono ulteriormente suffragata dal substrato specifico test cellulari di γ-secretasi descritto nello studio presente. L'attuale protocollo fornisce pertanto un approccio efficace per la scoperta del romanzo γ-secretasi modulatori.
I meriti di questo paradigma di substrato specifico dosaggio γ-secretasi sono molteplici. Ad esempio, questi saggi di substrato specifico γ-secretasi potrebbero essere utilizzati in una schermata preliminare per escludere potenziali inibitori non selettivi γ-secretasi da ulteriore sviluppo e fornire una valutazione quantitativa che è rilevante per ridurre al minimo potenziali effetti collaterali. L'efficacia biologica di composti attivi identificati da questo metodo quindi può essere ulteriormente convalidato in cellule neuronali e modelli animali di AD, come dimostrato recentemente,21. Inoltre, l'omogeneità delle linee cellulari stabili CG e NG è fondamentale per la riproducibilità dei risultati sperimentali. D'importanza, l'espressione della tetraciclina-inducibile di C99-GV o NΔE-GV previene efficacemente la saturazione dell'espressione di reporter di luciferase che è visto in altri sistemi dove è espresso costitutivamente C99 o NΔE. Questa espressione tetraciclina-inducible risultati in un segnale di luciferasi altamente affidabili e coerenti che direttamente correla con attività della γ-secretasi, che consente il confronto della γ-secretasi attività di clivaggio tra due diversi substrati (APP-C99 contro NΔE), o da esperimento a esperimento in modo altamente efficiente. Al fine di ottenere i migliori risultati, l'attività di soluzione di tetraciclina dovrebbe essere controllato periodicamente (preferibilmente una volta al mese) per garantire l'efficienza ottimale di induzione. Come un ulteriore vantaggio, l'omogeneità di queste piattaforme Elimina la necessità per la normalizzazione della luciferasi di lucciola con espressione costitutiva di luciferasi Renilla . Infine, trattando le cellule CG e NG con 1 µM avagacestat, un noto inibitore di γ-secretasi per tacca-con parsimonia, può servire come controllo positivo per il dosaggio.
Un avvertimento possibile di utilizzare la piattaforma di test presente è che la sovraespressione di γ-secretasi substrati e conseguente saturazione del reporter trascrizionale nelle nostre analisi ha un certo potenziale per mascherare attività inibitoria e contribuire alla discrepanti potenza inibitoria tra le differenti saggi23. Questa complicazione potenziale sottolinea la necessità di piattaforme di analisi secondaria per convalidare l'efficacia degli inibitori di γ-secretasi tacca-con parsimonia, come recentemente dimostrato21. Un'altra potenziale limitazione di questo approccio è che data più di 90 membrana diverse proteine sono state identificate come γ-secretasi substrati, le piattaforme di analisi presenti non forniscono un profilo completo della selettività di substrato di γ-secretasi. Lungo queste linee, risparmiando l'inibizione di fenditura tacca potrebbe non essere la migliore lettura con cui valutare gli inibitori γ-secretasi. Attenzione dovrebbe essere presa a causa del fatto che avagacestat, un inibitore della γ-secretasi tacca-con parsimonia, non riesce a migliorare la cognizione24ed è probabile che l'inibizione di tacca potrebbe non essere l'unica base per la tossicità associata con pan γ-secretasi inibitori 25. l'utilità vera di colpi identificati da questo nuovo approccio potrebbe cerniera su di se gli inibitori di γ-secretasi tacca-con parsimonia recentemente identificati in possesso di nuove entità chimiche che non sono presenti in avagacestat, e se l'efficacia di questi inibitori possa essere convalidati utilizzando modelli in vivo di annuncio.
In conclusione, riteniamo che l'approccio presentato può notevolmente accelerare lo sviluppo di APP-C99-specifico γ-secretasi inibitori/modulatori per uso clinico. Non c'è nessuna smentita che inibitori di γ-secretasi, siano essi tacca-con parsimonia o non, potenzialmente potrebbe avviare tossicità nei pazienti dell'annuncio, che condurrebbe alla tollerabilità indesiderabili ed esiti come precedentemente suggerito26. Tuttavia, con l'introduzione di nuovi strumenti chimici e una migliore convalida schemi21, γ-secretasi dovrebbero continuare ad essere un interessante bersaglio di farmaci a causa della sua complessità biochimico, che richiedono ulteriori studi preclinici e clinici per esplorare la rilevanza terapeutica in annuncio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la struttura di nucleo del Istituto del cellulare e biologia organismica, Academia Sinica, per il supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan (più 103-2320-B-001-016-MY3 Y.-f. L.), il programma per l'innovazione traslazionale di sviluppo biofarmaceutico – tecnologia che supporta la piattaforma asse regime (NP7 a Y.-F.L.) e Academia Sinica (a Y.-F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
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