Summary
我々 は正常に 2 つの基質特異的 γ-セクレターゼ アッセイを生成されます。ここに提示両方のセルベースのアッセイは、ホタル ルシフェラーゼ レポーターのアウトプットを介して γ セクレターゼ酵素を定量化する設計されています。
Abstract
異なる基板の γ セクレターゼ胸の谷間を定量化するセルベースのレポーター遺伝子アッセイのペアを開発しました。本稿では、アプリ C99 のノッチ、Gal4 プロモーターに駆動されるホタル ルシフェラーゼ レポーター システムを使用して γ セクレターゼによる胸の谷間を監視するために使用可能性があります手順について説明します。これらの試金は安定株 Gal4 駆動ルシフェラーゼ レポーター遺伝子とアプリ (アプリ C99; のいずれか Gal4/VP16 タグ C 末端フラグメント HEK293 細胞が共同で設立されました。Cg 基本セルの場合)、または、Gal4 VP16 タグ付けのノッチ-ΔE (NΔE;NG のセル)。並列でこれらのレポーターの試金を使用して、我々 はことを示している ErbB2 阻害剤、CL 387,785、優先的に cg 基本セルでアプリ C99 が NG の細胞でない NΔE γ-セクレターゼ胸の谷間を抑制できます。CL-387,785 で処理する CG と NG の細胞によって展示差動応答 γ セクレターゼ変調器の最寄りの特性を表し、これらの応答は、γ-セクレターゼ部による抑制パンとは対照的。私たちの研究は、携帯電話のコンテキストで異なる基板上に向けた γ セクレターゼ活動を鑑別できることの直接の証拠を提供します。これらの新しいアッセイしたがって改善の AD 治療の薬剤開発に便利なツールがあります。
Introduction
アミロイド β (a β) のオリゴマー フォーム1アルツハイマー病 (AD) 患者の脳の神経変性の主な原因と考えられています。Β-セクレターゼによって最初放置、γ-セクレターゼ2a β ペプチドがアミロイド前駆体タンパク質 (APP) の段階的な胸の谷間によって生成されます。過去 10 年間で AD の治療に対する治療のアプローチが a β の生産3の防止に焦点を当てた。研究の大半は、どちらかアプリの γ セクレターゼ胸の谷間を排除でき、a β の生産または β-及び/又は γ-セクレターゼ活動4の抑制により減少する α セクレターゼ活性の増強に焦点を当てています。残念ながら、β と γ セクレターゼ5,6の他の生理学的な基板の機能の干渉のため、やむを得ない副作用で β または γ セクレターゼ結果の非選択的阻害。Γ セクレターゼ阻害剤に関する最近の研究はノッチ7 の重要な γ セクレターゼによる処理にはほとんど影響を発揮しながら a β の生産を調節することができます化学および遺伝の変調器の数の発見を報告しています。 ,8,9,10、11,12, しかし、成功した治療法はまだ開発されていません。したがって、さらに体系的な画面が選択的に γ セクレターゼ仲介アプリ処理を調節する新規の遺伝物質と化学修飾子を発見する保証されます。
Γ-セクレターゼは、90 以上の異なる膜アンカー型蛋白質を裂くこと知られています。これらの基板間で切り込み、その活動は細胞の運命決定や分化開発13にとって重要です。ノッチに影響を及ぼす処理が γ セクレターゼ阻害剤の最小限に抑えるノッチ関連副作用のため不可欠になります γ セクレターゼ触媒のアプリがない場合は処理を選択的に調節することと、この選択性が主な要因と考えられています。広告の慢性の処置のための潜在的な γ セクレターゼ変調器の生物学的有効性を定めます。Arylsulfonamide 誘導体、GSI 953 (begacestat) や BMS-708163 (avagacestat)、γ-セクレターゼ14,15の強力かつ選択的な阻害が確認されたことなどの数がありました。以前の研究は、ゼブラフィッシュ16を使用して体内の検証との組み合わせで定量的な ELISA アッセイを使用してアプリやノッチの γ セクレターゼ胸の谷間の差分の抑制を観察できることを示しています。さらに、γ-セクレターゼ アプリとノッチの17,18への潜在的な基質選択性に対処するため細胞ベースのアッセイのパラダイムが確立されています。ここ、これらに類似のプロトコルを使用して、我々 は最近 (D) の新規クラスを発見した-leucinamides 強力ノッチ温存選択性19アプリの γ セクレターゼ胸の谷間を調節します。一緒に、研究のこのコレクションは、検証のための γ セクレターゼの基質選択性/可用性が化学変調と実験的検証の対象とすることができます概念をサポートを提供します。ただし、これらのアッセイのプラットフォームは、しばしば比較的低スループット リードアウトと創薬プログラムの産業基準を満たしていない可能性が労働集約的なアプローチに依存します。
最近、2 つの異なる基板、アプリ (アプリ C99) の 99 アミノ酸 C 末端フラグメントと、細胞外へ γ セクレターゼの活性を決定する定量的ルシフェラーゼの細胞を用いたレポータージーンアッセイを生成しました。ドメイン削除ノッチ ペプチド (NΔE)。アプリ C99 と NΔE の両方は、さまざまな試金で γ セクレターゼの直接基板として広く使用されています。アプリ C99 または NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間に均一で一貫性のあるルシフェラーゼ レポータージーンアッセイを生成するには、恒常 Gal4 プロモーターに駆動されるホタルのルシフェラーゼ レポーター (を表す 1 つの安定 HEK 細胞ライン (CG) を生成しました。Gal4-Luc)、Gal4 VP16 タグ付きアプリ C99 融合蛋白質 (C99 GV)。さらに、我々 は恒常 Gal4 リュックと Gal4 VP16 タグ付き NΔE (NΔE-GV) を表現する別の安定した HEK 細胞ライン (NG) が生成されます。これらの新規基質特異的 γ-セクレターゼの試金を使用して、我々 は今を定量化し、異なる基板 (cg 基本セルでアプリ-C99) または NG 細胞における NΔE に向かって γ セクレターゼの活性を区別する方法を提供します。さらに、基質特異的 γ-セクレターゼの試金は高コンテンツ スクリーニング プラットフォームを助長すること設計されました。これらの新しく生成された γ-セクレターゼ試新規 γ-セクレターゼ変調器次世代治療のため望ましくないノッチ阻害を引き起こす事なく a β の生産を抑制することで認知機能を向上させることの発見の道を開くこと広告。
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Protocol
1. アプリ C99 または NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間に対応するルシフェラーゼ レポーター信号の測定
注: は、CG と NG のセル20,21の世代の詳細な説明の前の出版物を参照してください。
-
NG または CG のセルのシード (20, 000 細胞/ウェル) ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) プラス 10% ウシ胎児血清 (FBS)、5 μ g/mL ブラストサイジン 250 μ g/mL 抗生物質 (例えばで構成されている培地に 200 μ L/ウェルの最終巻で 96 ウェル マイクロ プレートに、zeocin)、および 200 μ g/mL hygromycin b.
- 診断とセルをカウントします。
- 加湿 CO2インキュベーターにプレートを転送し、37 ° C で一晩インキュベートします。
- 成長媒体の 100 μ L を各ウェルから削除します。
- 成長の 100 μ L/ウェルを追加いずれか 0.2% ジメチルスルホキシド (DMSO)、2 μ M と 2 μ g/mL テトラサイクリンを含む中 CL 387,785、2 μ M N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t butylester (部)、またはその他関連 ErbB1/ErbB2 阻害剤。
- 24 h の 37 ° C でマイクロ プレートに扱われた CG や NG セルを孵化させなさい。
- マイクロ プレートから 150 μ L/ウェル成長培地を削除します。
- 50 μ L/ウェル ルシフェラーゼ アッセイ試薬を追加 (材料の表を参照してください)。
-
発光マイクロ プレート リーダーにプレートを転送します。
- 穏やかな攪拌を 5 分間室温でマイクロ プレートを維持します。
-
ホタルのルシフェラーゼ (フロリダ州) を決定する-発光ルミネセンス マイクロ プレート リーダーに格納されている定義済みのプログラムを使用して出力されます。
- 計測器制御ソフトウェアを開く (器械の細部の材料表を参照してください)。
- 「ツール」メニューから 'Luminometry' を選択します。
- 'パラメーター' 設定カウント時間の排出フィルター、排出絞りの目盛り '通常' を入力 '1' 'フィルターなし' を選択、ルミネセンス読み取りを設定するには、[ok] クリックします。
- '計測器制御」タブの下アクティブなプロトコルのリストをスクロールし、発光を読み取るためあらかじめストアドのプロトコルを選択します。
- 'ライブ表示' タブの下プルダウン ・ リストから尺度を定義し、型の '対数' または '線形' を選択します。
- '温度' タブの下には、プレート ヒーターの 'Off' を選択します。
- 読んで発光を実行する「スタート」ボタンをクリックします。
- 必要に応じて、制御ソフトウェアに埋め込まれた 'エクスプ ローラー' を使用してスプレッドシート形式に結果をエクスポートします。
2 γ-セクレターゼ活性の定量化
-
CG によって放出される発光信号または 100% の相対的な γ-セクレターゼ活性として単独で 1 μ g/mL テトラサイクリンを含む培地に 0.1 %dmso 処理 NG のセルを定義します。
- テトラサイクリンを含まない培地で細胞を処理することによってバック グラウンド CG や NG 細胞から発光を推定します。
- ルシフェラーゼ 1 G/ml テトラサイクリンを含む培地で培養している CG や NG の細胞から信号を正常化し、細胞の DMSO 処理 CG や NG によって放出されるルシフェラーゼ信号部のいずれかの 1 μ M CL 387,785 または 1 μ (100% の相対的な γ-セクレターゼ活性として2.1 で定義)。
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Representative Results
ErbB2 抑制 CL 387,785 によって差動によってアプリ C99 の処理を促進することがΓノッチ胸の谷間を与えずセクレターゼ
特定の γ-セクレターゼ基板の蛋白質分解開裂を定量化することができます細胞ベースのアッセイを確立するには、テトラサイクリン誘導 C 末期 Gal4/VP16 タグ付きの安定の共トランスフェクションによる HEK293 派生 CG セルラインを生成アプリ C99 と Gal4 プロモーターに駆動されるホタルのルシフェラーゼ レポーター遺伝子。NG 細胞平行線は、NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間の分析にも設立されました。NG 細胞におけるテトラサイクリン誘導 C ターミナル Gal4 VP16 タグ付き NΔE と Gal4 のプロモーターに駆動されるルシフェラーゼ レポーター遺伝子だった HEK293 細胞に安定 cotransfected。Cg 基本セルでアプリ C99 の γ セクレターゼ胸の谷間と NG 細胞における NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間部、すべての γ セクレターゼ基板 (胸の谷間をブロック パン γ セクレターゼ阻害剤の濃度と CG と NG のセルを扱うによって確認されて図 1)。データはまた触媒の CG andNG 展示セル同等レベルで、γ セクレターゼを示した。
ErbB1/2 デュアル阻害剤 CL 387,785、差動を調節するために示されていると CG と NG の cellstreated で発光信号を調べた γ セクレターゼ劈開の基質特異的細胞に基づく試金の効率を検証するため、Γ-セクレターゼ アプリ C99 と NΔE21の胸の谷間。我々 は以前、プレセニリン 1 (PS1) と C99 PS1 と NΔE21間の相互作用と干渉の欠如とタンパク質間相互作用と、干渉により選択的な γ-セクレターゼ変調器として CL 387,785 を識別されます。ここでは、CL 387,785 による治療は効果的に NG 細胞における NΔE の蛋白ではなかったに対し cg 基本セルでアプリ C99 の処理をブロックされているデータの表示には、(図 2) が影響を受けます。これらの結果は、高スループット スクリーニング プラットフォームを助長している形式で、C99 と NΔE 胸の谷間の違いで CG と NG のセルの有効性を示しています。
図 1: アプリ C99 固有細胞 γ-セクレターゼ アッセイ (CG セル).Cg 基本セル播種 96 ウェル マイクロ プレート (20,000 細胞/ウェル) 一晩と 24 h の 37 ° C で 1 μ g/mL テトラサイクリン存在下で CL 387,785 または部の 1 μ m 処理に。C99 GV の γ セクレターゼを介したタンパク質分解から派生した発光 100 μ L/ウェル ルシフェラーゼの試金の試薬の付加の後の定量化を行った。車両だけで (0.1 %dmso) 細胞によって放出されるルシフェラーゼ信号は 100% 相対発光として設定されました。データは、3 つの独立した実験から平均 ± SD として表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ノッチ特定細胞の γ-セクレターゼ アッセイ (NG 細胞).NG 細胞播種 96 ウェル マイクロ プレート (20,000 細胞/ウェル) 一晩と 24 h の 37 ° C で 1 μ g/mL テトラサイクリン存在下で CL 387,785 または部の 1 μ m 処理に。NΔE GV の γ セクレターゼを介したタンパク質分解から派生した発光 100 μ L/ウェル ルシフェラーゼの試金の試薬の付加の後の定量化を行った。車両だけで (0.1 %dmso) 細胞によって放出されるルシフェラーゼ信号は 100% 相対発光として設定されました。データは、3 つの独立した実験から平均 ± SD として表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
広告 aducanumab 免疫療法のフェーズ 1 b 試験の有望な結果は広告22の病因における a β の重要な役割を定着させたし、抗 a β のアプローチがまだアンチ広告薬の開発のための実行可能な戦略であることを示唆しています。ここでは、アプリ C99 とホタル ルシフェラーゼ レポーター システムを使用して NΔE の γ セクレターゼ触媒分解を定量化するため細胞に基づく試金について述べる。アプリ C99 と NΔE 2 つの最もよく研究 γ セクレターゼ基板は、γ-セクレターゼ13の病原性および生理学的な活動を一緒に表します。我々 の調査結果分泌 β、γ-セクレターゼ本研究で説明の基質特異的細胞アッセイによって実証されてさらに、CL 387,785 によって ErbB2 のダウンレギュレーションは優先的にアプリ C99 の定常状態レベルを減らすことができます。現在のプロトコルは、したがって新規 γ-セクレターゼ変調器の発見のための効率化手法を提供します。
この γ-セクレターゼ特異性アッセイ パラダイムのメリットは、多面的。たとえば、これらの基質特異的 γ-セクレターゼ試はさらに開発からの潜在的な非選択的 γ セクレターゼ阻害を排除し最小化に関連した定量的評価を提供する予備的な画面で利用できます。潜在的な副作用。このメソッドから同定されたアクティブな化合物の生物学的効果は、最近21に示すように神経細胞と AD の動物モデルでさらに検証し、できます。さらに、CG と NG 安定したセルラインの均一性は、実験結果の再現性に不可欠です。重要なは、C99 GV または NΔE GV のテトラサイクリン誘導式は効果的に C99 または NΔE を表明恒常他システムに見られるルシフェラーゼ レポーター式の飽和を防止します。このテトラサイクリン誘導式の結果 γ セクレターゼ活性 γ-セクレターゼの比較 2 つ異なる基板 (アプリ C99 間胸の谷間活動に直接関連している高い信頼性と一貫性のあるルシフェラーゼ信号にNΔE)、対または実験の実験に非常に効率的な方法で。最良の結果を得るためにテトラサイクリン ソリューションのアクティビティを定期的に監視する必要があります (できれば月 1 回) 最適な誘導の効率性を確保します。追加の利点としてこれらのプラットフォームの均一性はRenillaルシフェラーゼ発現とホタルのルシフェラーゼの正規化の必要性を排除します。最後に、1 μ M avagacestat と CG と NG のセルを扱う、ノッチ温存の知られている γ セクレターゼ阻害は試金のための肯定的な制御として使用できます。
存在の分析プラットフォームを使用しての 1 つの可能な警告、γ セクレターゼ基板の過剰発現と私たちのアッセイで転写の記者の後続の彩度は、いくつか潜在的な阻害活性をマスクし、矛盾に貢献別の試金23間抑制効力。この潜在的な合併症は、最近21を示すように、ノッチ スペア γ セクレターゼ阻害薬の有効性を検証するため二次分析プラットフォームの必要性を強調します。このアプローチのもう一つの潜在的な制限は 90 以上異なる膜タンパク質は、γ-セクレターゼ基板として識別されているを考えると、現在の分析プラットフォームを提供しないこと γ セクレターゼ基質選択性の完全なプロフィールです。これらの線に沿って温存ワンランク胸の谷間の抑制によって γ セクレターゼ阻害剤を評価するための最高の読み出しができない場合があります。注意すべきであるという事実のため、avagacestat、ノッチ スペア γ セクレターゼ阻害剤、認知24とそれを改善するために失敗した場合はノッチ阻害がパン γ セクレターゼ阻害剤に関連付けられている毒性の唯一の基礎ではないかもしれないことを可能性が高い25. 新たに同定されたノッチ スペア γ セクレターゼ阻害剤 avagacestat には存在しない新規の化学物質のエンティティを持っている場合、これらの阻害剤の有効性を許可する場合、この新しいアプローチによって識別されるヒットの真のユーティリティ可能性がありますにかかって生体広告のモデルを使用して検証。
結論としては、提示されたアプローチが C99 アプリ固有 γ セクレターゼ阻害剤/変調器臨床使用のための開発を促進して大きく考えています。否定がないその γ-セクレターゼ阻害薬、ノッチを温存しているかどうかどうか、望ましくない忍容性につながる AD 患者における毒性を開始可能性があります、結果として以前提案した26。しかし、化学の新しいツールと改良された検証スキーム21の導入により、γ-セクレターゼが続行を探索するより多くの前臨床および臨床研究を必要とする、その生化学的な複雑さのための魅力的な薬剤ターゲットになるその広告の関連性を治療。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は携帯研究所・生体生物学中央研究院、中核施設のテクニカル サポートをありがちましょう。本研究は、科学技術、台湾 (Y. f. で 103-2320-B-001-016-MY3 が最も省に支えられL.)、バイオ医薬開発-プラットフォームの軸を支える技術の橋渡しの革新のためのプログラム (Y. f. l. に NP7) 方式と中央研究院 (義-f. l.) に。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
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