Summary
Estamos com sucesso geraram dois ensaios de substrato específico γ-secretase. Ambos os ensaios cell-based aqui apresentados destinam-se para quantificar o γ-secretase actividades enzimáticas através da saída de repórteres de luciferase de vaga-lume.
Abstract
Nós desenvolvemos um par de ensaios de gene repórter baseada em célula para medir quantitativamente a clivagem de γ-secretase de substratos distintos. Este manuscrito descreve procedimentos que podem ser usados para monitorar a clivagem γ-secretase-mediada de APP-C99 ou entalhe, utilizando um sistema de repórter Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase. Estes ensaios foram estabelecidos por estàvel co transfecting células HEK293 com o gene do repórter do luciferase orientado a Gal4 e o fragmento de Gal4/VP16-marcados C-terminal da APP (APP-C99; Células CG), ou a Gal4/VP16-tag entalhe-ΔE (NΔE; Células de NG). Usando estes ensaios de repórter em paralelo, temos demonstrado que um inibidor ErbB2, CL-387.785, preferencialmente pode suprimir a clivagem de γ-secretase de APP-C99 em células CG, mas não NΔE em células de NG. As diferenciais respostas exibidas pelas células CG e NG, quando tratados com CL-387.785, representam uma característica preferencial para moduladores de γ-secretase, e essas respostas estão em contraste com a pan-inibição de γ-secretase induzido por DAPT. Nossos estudos fornecem a evidência direta que γ-secretase atividades em direção a diferentes substratos podem ser diferenciadas em um contexto celular. Estes novos ensaios, podem ser ferramentas úteis na descoberta da droga melhorada das terapias AD.
Introduction
Oligoméricas formas de amiloide-β (Aβ) são acreditadas para ser a causa primária de neurodegeneração nos cérebros de pacientes que sofrem de doença de Alzheimer (AD)1. Peptídeos aβ são produzidos pela gradual clivagem da proteína precursora amiloide (APP), primeiro por β-secretase e depois por γ-secretase2. Na década passada, abordagens terapêuticas para o tratamento da AD têm-se centrado na prevenção da produção de Aβ3. A maioria dos estudos focaram-se também o aumento da atividade de α-secretase, que pode impede a clivagem de γ-secretase de APP e, assim, diminuir a produção de Aβ, ou a inibição da β-e/ou γ-secretase atividades4. Infelizmente, não-seletivo da inibição da β ou γ-secretases resultados em inevitáveis efeitos colaterais que são devido à interferência com o funcionamento de outros substratos fisiológicos de β e γ-secretase5,6. No que se refere a inibidores de γ-secretase, estudos recentes relataram a descoberta de um número de moduladores químicos e genéticos que podem regular a produção de Aβ enquanto exercer efeitos insignificantes sobre o tratamento de γ-secretase-mediada essencial de entalhe7 ,8,9,10,11,12, no entanto, terapêutica bem sucedida ainda não foram desenvolvidas. Assim, ainda mais sistemáticas telas são garantidas para descobrir novos modificadores de genéticas e químicas que podem seletivamente modular γ-secretase-mediada processamento de APP.
Γ-Secretase é conhecido para cravar mais de 90 diferentes proteínas de membrana-ancorado. Entre estes substratos é entalhe, cuja actividade é fundamental para a determinação do destino de célula e diferenciação durante desenvolvimento13. Seletivamente a modular γ-secretase-catalisada APP processamento na ausência de afectar o entalhe processamento será essencial para minimizar efeitos colaterais relacionados com entalhe de γ-secretase-inibidores, e esta seletividade é pensada para ser um fator principal que será dite a eficácia biológica de moduladores de γ-secretase potenciais para o tratamento crônico da AD. Tem havido um número de derivados de arylsulfonamide, tais como o GSI-953 (begacestat) e BMS-708163 (avagacestat), que foram encontrados para exibem inibição potente e seletiva de γ-secretase14,15. Um estudo anterior demonstrou que a inibição diferencial de γ-secretase clivagem da APP e entalhe pode ser observada usando um ensaio quantitativo ELISA-baseado em combinação com validação no vivo usando zebrafish16. Além disso, foram estabelecidas paradigmas baseada em célula de ensaio para abordar a potencial seletividade de substrato de γ-secretase em direção a APP e o entalhe de17,18. Usando protocolos semelhantes as descritas neste documento, nós descobrimos recentemente uma nova classe de (D)-leucinamides que potente modular γ-secretase clivagem da APP com entalhe poupadores seletividade19. Juntos, esta coleção de estudos fornece um prova de conceito a noção de que a seletividade/disponibilidade de substrato de γ-secretase podem estar sujeitas a modulação química e verificação experimental de apoio. No entanto, essas plataformas de ensaio muitas vezes dependem de relativamente baixa produtividade leituras e abordagens de trabalho intensivos que não podem cumprir padrões industriais para programas de descoberta de drogas.
Nós recentemente geraram ensaios de gene do repórter do luciferase baseada em célula que quantitativamente podem determinar a atividade catalítica de γ-secretase em direção a dois substratos distintos, 99-amino ácido fragmento C-terminal da APP (APP-C99) e o extracelular domínio-excluído peptídeo Notch (NΔE). Tanto APP-C99 e NΔE foram amplamente utilizados como substratos diretos de γ-secretase em vários ensaios. Para gerar ensaios de gene repórter do luciferase homogênea e consistente para a clivagem de γ-secretase de APP-C99 ou NΔE, geramos uma linha de HEK-derivado de célula estável (CG) que constitutivamente expressa um Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase repórter ( Gal4-Luc) e a proteína de fusão Gal4/VP16-com a tag APP-C99 (C99-GV). Além disso, geramos uma outra linha de HEK-derivado de célula estável (NG) que constitutivamente expressa Gal4-Luc e NΔE Gal4/VP16-marcados (NΔE-GV). Usando estes ensaios romance substrato específico γ-secretase, agora oferecemos um método para quantificar e distinguir a atividade catalítica de γ-secretase em direção a diferentes substratos (APP-C99 em células CG), ou NΔE em células de NG. Além disso, os substrato específico γ-secretase ensaios foram projetados para ser propício para plataformas de triagem de alto teor. Estes ensaios γ-secretase recém-gerado poderiam pavimentar o caminho para a descoberta de moduladores de γ-secretase romance que poderia melhorar a função cognitiva, suprimindo a produção de Aβ sem suscitar indesejável inibição de entalhe para o tratamento de última geração do anúncio.
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Protocol
1. medição de sinais de repórter de Luciferase, que correspondem a clivagem de γ-Secretase de APP-C99 ou NΔE
Nota: Consulte as publicações anteriores para obter descrições detalhadas da geração de CG e NG células20,21.
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Semente de células NG ou CG (20, 000 células/poço) para microplacas de 96 poços em um volume final de 200 μL/poço no meio de crescimento que é composto modificado águia médio (DMEM) acrescido de 10% bovina soro fetal de Dulbecco (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 antibiótico μg/mL (por exemplo, zeocin) e 200 μg/mL hptII B.
- Contar as células com um hemocytometer.
- Transferir as microplacas para uma incubadora de2 CO umidificada e incubar a 37 ° C durante a noite.
- Remova 100 μL de média de crescimento de cada poço.
- Adicionar 100 μL/poço do crescimento médio contendo 2 tetraciclina μg/mL com ou 0,2% dimetilsulfóxido (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-aguarráz (DAPT) ou outros relacionados ErbB1/ErbB2 inibidores.
- Incube células tratadas CG ou NG em microplacas a 37 ° C por 24 h.
- Remova o meio de crescimento μL/poço de 150 de microplacas.
- Adicionar 50 μL/poço do luciferase ensaio reagente (veja Tabela de materiais).
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Transferi as microplacas para um leitor de microplacas de luminescência.
- Manter as microplacas à temperatura ambiente por 5 min com agitação suave.
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Determinar o luciferase de vaga-lume (FL)-emitida usando um programa pré-definido armazenado no leitor de microplacas de luminescência de luminescência.
- Abra o software de controle de instrumento (ver Tabela de materiais para obter detalhes do instrumento).
- No menu 'Ferramentas', selecione 'Luminometry'.
- Sob as configurações de 'Parâmetros', não escolha 'Nenhum filtro' para emissão de filtro, carrapato 'Normal' para abertura de emissão, digite '1' para contagem de tempo e clique em 'Okey' para configurar a leitura de luminescência.
- Na guia 'Instrumento de controle', percorra a lista de protocolos de ativos e selecione o protocolo previamente armazenado para a leitura de luminescência.
- Sob a aba "Exibição de viver", definir a dimensão da lista suspensa e selecione 'Logaritmo' ou 'Linear' para o tipo.
- Na guia 'Temperatura', selecione 'Off' para o aquecimento da placa.
- Clique no botão 'Iniciar' para executar a leitura de luminescência.
- Conforme necessário, exporte os resultados em um formato de planilha usando o 'Explorer' incorporado dentro do software de controle.
2. a quantificação da atividade de γ-Secretase
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Defina um sinal de luminescência emitida pelo CG ou células NG tratadas com 0,1% DMSO em meio de cultura contendo 1 tetraciclina μg/mL como 100% relativo γ-secretase atividade sozinha.
- Estimar a luminescência de fundo de células CG ou NG, tratando as células com o meio de crescimento que não inclui tetraciclina.
- Normalizar os sinais do luciferase de CG ou NG células que são cultivadas com meio de cultura contendo 1 tetraciclina μg/mL e qualquer 1 μM CL-387.785 ou 1 μM de DAPT com o sinal do luciferase emitido por CG tratados com DMSO ou NG células (atividade de γ-secretase relativa de 100%, como definido em 2.1).
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Representative Results
Inibição de ErbB2 pelo CL-387.785 diferencialmente pode promover o processamento de APP-C99 por Γ -secretase sem afetar a clivagem do entalhe
Para estabelecer um ensaio baseados em células que quantitativamente pode medir a clivagem proteolítica de um substrato específico γ-secretase, geramos a linhagem de células HEK293-derivado CG por transfection co estável de uma tetraciclina-inducible C-terminal Gal4/VP16-tag APP-C99 e um gene repórter do Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase. Uma linha de celular NG paralela também foi estabelecida a ensaiar para a clivagem de γ-secretase de NΔE. Nas células de NG, uma tetraciclina-inducible C-terminal Gal4/VP16-tag NΔE e um gene repórter do luciferase orientada por promotor de Gal4 foram estàvel co transfectadas em células HEK293. A clivagem de γ-secretase de APP-C99 em células CG e a clivagem de γ-secretase de NΔE nas células NG primeiro foram confirmados por tratamento de CG e NG células com diferentes concentrações de DAPT, um inibidor de γ-secretase pan que bloqueia a clivagem de todos (de substratos de γ-secretase A Figura 1). Os dados demonstraram também que γ-secretase em CG andNG células expostas a níveis comparáveis de catálise.
Para validar a eficiência dos ensaios baseados em células específicas do substrato para segmentações de γ-secretase, examinamos os sinais de luminescência em CG e NG cellstreated com um inibidor de dupla ErbB1/2 CL-387.785, que tem sido mostrado para diferencialmente modulam Γ-secretase clivagem da APP-C99 e NΔE21. Anteriormente, nós identificamos CL-387.785 como um modulador seletivo γ-secretase devido a sua interferência com a interação da proteína-proteína entre presenilina 1 (PS1) e C99 e ausência de interferência com a interação entre o PS1 e NΔE21. Aqui, dados mostram que o tratamento com CL-387.785 bloqueado o processamento de APP-C99 em células CG, Considerando que a proteólise de NΔE nas células NG não foi afetado (Figura 2). Estes resultados demonstram a eficácia das células CG e NG em distinguir entre clivagem C99 e NΔE, em um formato que é propício para plataformas de seleção da elevado-produção.
Figura 1: O ensaio de γ-secretase celular APP C99-específicos (células CG). Células CG foram semeadas em microplacas de 96 poços (20.000 células/poço) durante a noite e tratadas com 1 μM de CL-387.785 ou DAPT na presença de tetraciclina 1 μg/mL a 37 ° C por 24 h. A luminescência derivada de proteólise γ-secretase-mediada do C99-GV foi quantificada após a adição do reagente de ensaio 100 μL/poço do luciferase. O sinal do luciferase emitido pelas células tratadas com veículo sozinho (0,1% DMSO) foi definido como luminescência relativa de 100%. Dados são mostrados como a média ± DP de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O ensaio de γ-secretase celular de entalhe específicos (células NG). Células de NG foram semeadas em microplacas de 96 poços (20.000 células/poço) durante a noite e tratadas com 1 μM de CL-387.785 ou DAPT na presença de tetraciclina 1 μg/mL a 37 ° C por 24 h. A luminescência derivada de proteólise γ-secretase-mediada da NΔE-GV foi quantificada após a adição do reagente de ensaio 100 μL/poço do luciferase. O sinal do luciferase emitido pelas células tratadas com veículo sozinho (0,1% DMSO) foi definido como luminescência relativa de 100%. Dados são mostrados como a média ± DP de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os resultados promissores de um fase 1b ensaio de aducanumab imunoterapia para AD estabeleceram firmemente o papel crítico de Aβ na patogênese da AD22 e sugerem que abordagens anti-Aβ ainda são uma estratégia viável para o desenvolvimento de drogas antianúncios. Aqui, descrevemos ensaios cell-based, para quantificar a proteólise γ-secretase-catalisada de APP-C99 e NΔE usando sistemas de repórter de luciferase de vaga-lume. APP-C99 e NΔE são os dois substratos de γ-secretase mais bem estudados e juntos representam as atividades patogénicas e fisiológicas de γ-secretase13. Nossas descobertas que downregulation de ErbB2 pelo CL-387.785 preferencialmente pode reduzir os níveis de estado estacionário de APP-C99 e secretada Aβ é secundado por ensaios celulares os substrato específicas do γ-secretase, descrito no presente estudo. O protocolo atual assim fornece uma abordagem eficiente para a descoberta do romance γ-secretase moduladores.
Os méritos deste paradigma de ensaio de substrato específico γ-secretase são multifacetados. Por exemplo, estes ensaios de substrato específico γ-secretase poderiam ser utilizados em uma tela preliminar para excluir potenciais inibidores de γ-secretase não-seletivo de desenvolvimento e fornecer uma avaliação quantitativa que é relevante para minimizar efeitos colaterais potenciais. A eficácia biológica de compostos ativos identificados deste método pode então ser mais validada em células neuronais e modelos animais de AD, conforme demonstrado no recentemente21. Além disso, a homogeneidade das linhas celulares estável CG e NG é fundamental para a reprodutibilidade dos nossos resultados experimentais. Importante, a expressão tetraciclina-inducible do C99-GV ou NΔE-GV efetivamente impede a saturação da expressão do repórter do luciferase que é visto em outros sistemas onde C99 ou NΔE é constitutivamente expressa. Esta expressão tetraciclina-inducible resulta em um sinal de luciferase altamente confiável e consistente que correlaciona diretamente com a atividade de γ-secretase, permitindo a comparação de γ-secretase atividades de clivagem entre dois substratos diferentes (APP-C99 contra NΔE), ou de experimento para experimento em uma maneira altamente eficiente. A fim de obter os melhores resultados, a atividade de solução de tetraciclina deve ser monitorizada periodicamente (de preferência uma vez por mês) para garantir a eficiência de indução ideal. Como uma vantagem adicional, a homogeneidade dessas plataformas elimina a necessidade de normalização do luciferase de vaga-lume com expressão de luciferase Renilla constitutiva. Finalmente, tratando de CG e NG células com 1 µM de avagacestat, um conhecido poupadores de entalhe γ-secretase inibidor, pode servir como um controle positivo para o ensaio.
Uma ressalva possível de usar a plataforma de ensaio presente é que a superexpressão de substratos de γ-secretase e saturação subsequente do repórter transcriptional em nossos ensaios tem algum potencial para mascarar a atividade inibitória e contribuir para discrepantes potência inibitória entre os diferentes ensaios23. Esta complicação potencial ressalta a necessidade de plataformas de ensaio secundário para validar a eficácia dos inibidores de γ-secretase poupadores de entalhe, como mostrado recentemente21. Outra limitação potencial desta abordagem é que dada a mais de 90 diferentes membrana proteínas foram identificadas como substratos de γ-secretase, as presente ensaio plataformas não fornecem um perfil completo de seletividade de substrato de γ-secretase. Ao longo destas linhas, poupando a inibição de clivagem de entalhe pode não ser a melhor leitura com o qual deseja avaliar γ-secretase-inibidores. Devem ser tomadas precauções devido ao fato de que avagacestat, um inibidor de γ-secretase poupadores de entalhe, falha para melhorar a cognição24e é provável que a inibição de entalhe pode não ser a única base para a toxicidade associada com inibidores de γ-secretase pan 25. o verdadeiro utilitário de hits identificado por esta nova abordagem poderia dobradiça sobre se os inibidores de γ-secretase entalhe poupadores recentemente identificados possuem novas entidades químicas que não estão presentes no avagacestat, e se a eficácia destes inibidores pode ser validados usando modelos no vivo do anúncio.
Em conclusão, acreditamos que a abordagem apresentada grandemente pode acelerar o desenvolvimento dos inibidores de APP-C99-específico γ-secretase/moduladores para uso clínico. Não há nenhuma negação que inibidores de γ-secretase, quer sejam poupadores de entalhe ou não, potencialmente poderia iniciar a toxicidade em pacientes com AD, que levaria a tolerabilidade indesejável e resultados como anteriormente sugeriram26. No entanto, com a introdução de novas ferramentas de químicas e de esquemas de validação melhorada21, γ-secretase deve continuar a ser um alvo de droga atraente devido à sua complexidade bioquímica, que requerem mais estudos pré-clínicos e clínicos para explorar seu relevância terapêutica no AD.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores graças a facilidade do núcleo do Instituto de celular e biologia organísmica, Academia Sinica, apoio técnico. Este estudo foi suportado pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan (mais-103-2320-B-001-016-MY3 para Y.-F. L.), o programa de inovação translacional de Biofarmacêutica desenvolvimento – tecnologia de apoio a plataforma eixo regime (NP7 para Y.-F.L.) e Academia Sinica (para Y.-F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
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