Summary
Volumet er en viktig parameter om fysiologiske og patologiske kjennetegner celler. Vi beskriver en fluorescerende utelukkelse metode tillater full-feltet mål i vitro neuronal volum med sub micrometric aksial oppløsning kreves for analyse av neurites og dynamiske strukturer underforstått i dannes hemmer nevronal vekst.
Abstract
Volumet er en viktig parameter om fysiologiske og patologiske kjennetegner neurons på forskjellige tidsskalaer. Neurons er ganske unikt celler om deres utvidet ramified morphologies og dermed øke flere metodiske utfordringer for volummåling. I tilfellet av i vitro dannes hemmer nevronal vekst, bør valgte metodikken inkludere sub micrometric aksial oppløsning kombinert med full-feltet observasjon på tidsskalaer fra minutter til timer eller dager. I motsetning til andre metoder som cellen figur rekonstruksjon AC confocal imaging, elektrisk-baserte målinger eller Atomic Force mikroskopi, har nylig utviklet fluorescens utelukkelse metoden (FXm) potensial til å oppfylle disse utfordringene. Men selv om å være enkel i prinsippet, krever implementering av en høyoppløselig FXm for neurons flere justeringer og en dedikert metodikk. Vi presenterer her en metode basert på kombinasjonen av fluorescens eksklusjon, lav-grovheten flere avdelinger microfluidic enheter og til slutt micropatterning å oppnå i vitro målinger av lokale neuronal volum. Den høye oppløsningen gitt av enheten tillot oss å måle lokale volumet av neuronal prosesser (neurites) og volumet av noen spesifikke strukturer involvert i dannes hemmer nevronal vekst, som veksten kjeglene (GCs).
Introduction
Nøyaktig kunnskap om mobilnettet volum har fått økt oppmerksomhet de siste årene, drevet av spørsmålet om cellen størrelse homeostase encellede mikroorganismer 1 og mer generelt mitotisk celler 2. Men er spørsmålet om celle volum relevant for post mitotisk celler, som neurons utgjør en paradigmatiske eksempel.
Volumet er faktisk en viktig signatur fysiologiske og patologiske hendelsesforløpet i ulike skalaer og tid i neuronal liv, fra forbigående axonal deformasjon knyttet til elektrisk aktivitet (millisekund skala) 3 til den irreversibel neuronal hevelse forekommende i asymptomatisk fasen av nevrodegenerative sykdommer (over år hos mennesker) 4. Største volum endringen skjer imidlertid i en mellomliggende tidsskalaen for dager eller uker (avhengig av vurdert organismen) under dannes hemmer nevronal vekst. Utvidet og kompleks morfologi av neurons reiser flere spørsmål, som regulering av Cellestørrelse. Axonal lengde og diameter er faktisk strengt regulert i vivo, med verdier spesielt for hver neuronal type 5,6.
Disse problemene, komplekse å ta i vivo, kan også rettes i en forenklet måte i vitro. I dette målet, en metode dedikert til volummåling rask nok å følge vekst dynamics (dvs. i en tidsskala minutter) og kompatibel med observasjon over timer eller dager er nødvendig. Flere metoder har blitt utviklet gjennom årene for å gi en direkte eller indirekte tilgang til mobilnettet volum i vitro. Cellen rekonstruksjon fra AC confocal imaging er en av dem, men denne metoden innebærer merking og gjentatt eksponering for lys mens viser en begrenset aksial oppløsning på over 500 nm 7. Merk at disse to siste ulempene er delvis overvunnet av en mer sofistikert og siste metode kalt gitter lys arks mikroskopi 8. Atomic Force mikroskopi er brukt 9 men dette skanningsmetoden er av kjernen langsom og kjedelig. Videre kan den fysisk kontakten krever med cellen forstyrre målingen vurderer ekstreme mykheten av neurons 10. Indirekte metode impedans eller resonans har vært ansatt for ulike celle typer 11, men er utilstrekkelig for utvidet selvklebende celler som neurons.
En av de mest lovende metodene er basert på mål på ekskluderte volumet av celler i et tett kammer fylt med et fluorescerende fargestoff. Metoden for fluorescens eksklusjon (FXm) er enkel i prinsippet som det krever ingen merking, og er egnet for rask, langsiktig optisk avbilding av celle populasjoner med potensielt sub optisk aksial oppløsning. Mer presist, avhenger oppløsningen i z maksimal fluorescens intensiteten i kultur chamber (dvs. i regionen uten celler) delt dynamikkområdet på kameraet, men flere kilder til støy begrense denne ultimate oppløsningen. Denne metoden har vært svært kraftig til å følge volumet av overfører tilhenger celler 12 eller studere endringsvarsel under mitose av pattedyrceller, som grundig beskrevet i 13. Imidlertid utgjøre neurons en metodisk utfordring for FXm vurderer deres omfattende konsekvenser i sub micrometric prosesser.
Vi presenterer her en metode fører til fabrikasjon av glatt FXm kammer til med høy presisjon volumet og neuronal grener og dynamiske strukturer involvert i dannes hemmer nevronal vekst som veksten kjeglene.
Chambers bør ha lignende høyder enn objektet å mål for å optimalisere aksial oppløsning. Derfor designet vi forskjellige FXm enheter preget av sentrale måling kamre av 3 forskjellige høyder. Den tynneste (3 µm i høyden) er dedikert til neurite måling: denne lav høyde utelukker soma, som forblir i nær 15 µm høy mellomliggende kammeret. Tykkere sentrale kammer (10 og 12 µm) er tilstrekkelig høy følge hele cellevekst. Enheten inneholder også to reservoarer plassert på hver side av det sentrale kammeret. Fire injeksjon hull (IH) implementeres dermed og er angitt som følger: innløp og utløp tjene til å innføre av mobilnettet suspensjon i chip, mens de to andre feed reservoarene.
Vi har første fabrikkerte kalibrering coverslips for høyde målinger ved hjelp av photoresist strukturer av kjente geometri. Vi har deretter fotografert gratis voksende nerveceller, men også morphologically begrenset nerveceller i micropatterns av vedheft.
Protocol
Studien ble gjennomført EU retningslinjer på omsorg og bruk av forsøksdyr: 86/609/EØF. Forskning formålet og protokollen er beskrevet i etiske vedlegg av ERCadg prosjektet CellO, som ble godkjent og regelmessig gjennomgås av ERCEA. Institut Curie dyr anlegget har fått lisens #C75-05-18, 24/04/2012, rapportering til Comité d'Ethique no matière d'expérimentation animale Paris sentrum et Sud (National registreringsnummer: #59).
1. fabrikasjon av mold
Merk: Mold omfatter sentrale og mellomliggende kamre koblet til en vik og en stikkontakt, pluss to reservoarer (og viker) ligger på begge sider av sentrale kammeret.
- Bruk flate pinsett manipulere 51 mm diameter silisiumskiver og overføre dem fra ett sted til et annet.
- Sentrale kammer silicon formen
- Fyll en 2-mL plastikk pipe med positiv photoresist. Plasser Pipetter i midten av en 51 mm diameter silisium wafer og trykk på reservoaret til dekker 75 wafer overflaten med photoresist. Spin-coat 3000 RPM for 30 s.
- Overføre kjeks fra spin-coater til en kokeplate, med en overflatetemperatur 100 ° c, 50 s.
- Overføre kjeks fra varmeplaten substrat innehaveren (chuck) av maske aligner. Utsette gjennom "DRIE masken" (se utfyllende filene "masks_neuron_volume_chips.tiff" og "masks_neuron_volume_chips.dxf").
- Fjern kjeks fra chuck og dykke det i et 100-mL glass bandets tallerken med utvikleren (fortynning 1:4 i deionisert vann). Slipp kjeks og vedlikeholde den for 1 min mens forsiktig og kontinuerlig røring størkner parabolen.
Merk: Hvis du vil lagre reagenser, fylle størkner fatet til 1 cm i høyden på maksimum. - Ta tilbake kjeks fra utbygger og senk den i en 100-mL størkner parabol fylt med deionisert vann i ca 10 s.Then sted kjeks på et tørkepapir og tørke den med trykksatt nitrogen bruker en luftpistol.
- Plasser kjeks 50 s på en kokeplate med en overflatetemperatur på 115 ° C.
- Utføre dype-reaktive Ion etsing (DRIE) med følgende parametere (mer om DRIE teknikken kan finnes i referanser 14 og 15); Passivation trinn: 50 sccm av C4F8, han støtte flyte 10 sccm, CP 10 W, Induktivt kombinert Plasma (ICP) 1500 W, totalt press 24 mbar, temperatur 18 ° C; Etsing trinn: 100 sccm av SF6, han støtte flyte 10 sccm, CP 11 W, ICP 1500 W, totalt press 24 mbar, temperatur 18 ° C; Passivation tid: 4 s; Etsing tid: 7 s; Totalt prosessen varighet: vanligvis 5 min for ca 10 µm etset dybde.
- Oppløse photoresist av dykking underlaget i en størkner fat fylte med aceton.
- Senk kjeks i en piranha løsning (2/3 H2O2 (30%) og 1/3 av H2SO4 (95 %)) for 5 min.
Forsiktig: Legge alltid H2O2 først og deretter H2så4 og skyll minst 3 ganger i vaskebuffer vann etter rengjøring.
- Dikte formene tilsvarer mellomliggende kammer ved å utføre trinn 1.2.1 til 1.2.11 etter til parameterne listet i tabeller 1-3.
Merk: Hver tabell tilsvarer en gitt enhet preget av en bestemt høyde på sentrale observasjon kammeret.
Merk: Utføre hele prosessen med økende photoresists høyder (masker 1 til 3 for hver enhet, se utfyllende filene "masks_neuron_volume_chips.tiff" og "masks_neuron_volume_chips.dxf").- Plass etset silisium kjeks på spin-coater substrat abonnenten.
- Kontroller at spin-coater fungerer riktig ved å kontrollere at aspirasjon av underlaget er effektiv (underlaget skal spinne og bo på plass under nominell rotasjonshastigheten).
- Viskositet SU-8 øker høyden på området målrettet tykkelse. Bruk alltid 20-30 mL flasker lagre SU-8 photoresists og helle den på kjeks før spin-belegg (SU-8 kan være for viskøse manipuleres med en plastikk pipe).
- Hell negative epoxy-type photoresist SU-8 i midten av underlaget før dekker ca 75% av silisium kjeks og spinn-coat med parameterne som er angitt i raden "Spincoating" i tabellene.
- Sted belagt kjeks på en kokeplate for varighet og temperatur som er angitt i rad "myk bake".
- Montere etset kjeks og tilstrekkelig "SU-8 masken" på maske aligner.
- Justere etset kjeks med maske med dedikert justering kors (typisk størrelse for disse krysser: 50 µm × 150 µm) designet på hver maske.
Merk: To kors på hver side av enheten er tilstrekkelig (en nederst til venstre) og en øverst til høyre. - Utsett bruker jeg-linjen av maske aligner (bølgelengde 365 nm) med riktige UV dose, som angitt i rad "Eksponering energi".
Merk: Eksponeringstiden er beregnet ved å dele den eksponering energi E spesifikt for hver photoresist ved effektiv UV-lampen, modulert av absorpsjon av masken:
x (1 - absorpsjonmaske). Absorpsjon er omtrent 20% for fleksibel masker og ubetydelig til krom vanskelig mask. - Plass belagt kjeks på en kokeplate for varighet og temperatur angitt i rad "Post bake".
- Forberede to 100-mL glass-bandets retter, som inneholder utvikleren, de andre tomme. Dykket kjeks i eksempelskjemaet for varigheten angitt i rad "Utvikling". Agitere forsiktig størkner parabolen langs utvikling
- Dryss kjeks med isopropanol over tomme størkner parabolen for ca 5 s. Til slutt plasserer kjeks på et tørkepapir og tørke den med trykksatt nitrogen bruker en luftpistol.
- Sted belagt kjeks på en kokeplate for varighet og temperatur som er angitt i rad "Hard bake" (valgfritt).
Merk: Dette trinnet er nyttig å unngå sprekker i photoresist og gir en homogen flat overflate for de neste trinnene. - Gjenta trinn 1.3.1 - 1.3.10 å fullføre prosessene oppført i tabell 1-3.
- Etter det siste trinnet i klima og jordsmonn, silanize siste master mold bestående av 3 lag av negativ photoresists ved å sende to 100 µL dråper av Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl) silane på hver side av master i en 100 mm Petriskål. Seal Petri disken med en plast parafin film og ruge 20 min ved romtemperatur (RT).
Merk: Master mold er klar og kan brukes flere ganger.
- Plass etset silisium kjeks på spin-coater substrat abonnenten.
x (1 - absorpsjonmaske). Absorpsjon er omtrent 20% for fleksibel masker og ubetydelig til krom vanskelig mask.2. fabrikasjon av PDMS chip
- Hell 90 g av silisium-baserte organisk polymer (Polydimethylsiloxane: PDMS) i en 100-mL plast kopp. Legge 10 g av dens herding agent (1:10 i vekt). Rør blandingen med en plastikk pipe for 2-3 minutter.
Merk: Bland 90 g PDMS med 10 g herding agent for fabrikasjon av 6 chips. - Sett blandingen i vakuum desiccator og pumpen i ca 30 min å fjerne luftbobler fanget inn i PDMS.
- Plasser master mold i en P100 Petriskål og hell 15 mL av blandingen på mold bruker en sprøyte.
Merk: 15 mL fører til en total chip høyde på 1,5 mm. - Plasser PDMS-mold strukturen i vakuum desiccator og pumpen til det er ingen flere luftbobler sprengning på overflaten av PDMS.
Merk: Dette trinnet blir ca 30 min. - Dytt kjeks nederst i Petriskål bruker en kjegle tips for å unngå døde PDMS volum under kjeks. Plass PDMS-mold enheten i ovnen satt til 70 ° C i minst 2 timer.
- Demold PDMS blokken under kjemiske hette med en stål flat slikkepott og helle isopropanol på chip. Plass den på stål benken av hetten.
- Skjær rundt silisium kjeks og demold PDMS kopi ved hjelp av en skalpell.
- Skjær rundt (la et 2 mm margin) chip skalpell eller et barberblad.
- Punch viker ved å trykke 1,5 mm diameter puncher fast og betjene å klippe og skjære hull på vik. Gjør det samme på fire dedikert soner av chip der væske injiseres.
- Rengjør chip stikker og peeling teip på microstructured side. Dryss isopropanol på begge sider. Tørk chip med trykksatt nitrogen bruker en luftpistol.
3. fabrikasjon av mønstret coverslips (24 × 24 mm2)
Merk: Manipulere coverslips med buet pinsett.
- Poly-ornithine (PLO) mønstre
- Bruke en O2 rengjøring plasma på glass coverslips. Plasma parametere: pumping ned Press: 0,25 mbar; O2 forsyning varighet: 3 min; gass flyt: 10 sccm; maksimalt avvik: ±5 sccm; plasma varighet: 3 min; Angi Press: 0.36 mbar; maksimalt avvik: ±0.10 mbar; Angi strøm: 50 M; maksimalt avvik: 5%. ventilasjon varighet: 45 s.
- Mix 484 µL av eddiksyre og 56 µL av 3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane, komplett med absolutt etanol å få et samlet volum på 15 mL.
- Ved hjelp av en 1-mL tips kjegle, sette en dråpe 500 µL av denne løsningen på hver dekkglassvæske, vente for 2-3 min. tørke med en renrom mikrofiber vindusvisker.
Merk: Silanized glass coverslips kan lagres til 1 måned ved romtemperatur i plast bokser forseglet med en plast parafin film. - Plass hver dekkglassvæske på et spinn coater ligger i et rent miljø. Sette en dråpe av en positiv photoresist dekker ca 75% av dekkglassvæske (rundt 500 µL) og spin-coat ved 4000 rpm for 30 s til siste tykkelse på 0,45 µm.
- Plass coverslips i 1 min på en kokeplate med en overflatetemperatur på 115 ° C.
- Ved hjelp av en maske aligner, utsette hver dekkglassvæske på en bølgelengde på 435 nm (G-linje) gjennom dedikerte masken i henhold til fabricant-parametere (UV dose om 50-60 mJ.cm-1)
- Forberede 2 glass størkner retter, som inneholder utvikleren (ingen utvanning), det andre som inneholder deionisert vannet.
- Dykke en etter en hver dekkglassvæske i eksempelskjemaet for 1 min mens forsiktig og kontinuerlig røring størkner parabolen. Deretter senke kjeks i deionisert vann ca 5 s. sted kjeks på et tørkepapir og tørke den med trykksatt nitrogen bruker en luftpistol.
- Bruke en aktivisering O2 plasma med samme parametere som 3.1.1.
- Under panseret, avsette fire 170 µL dråper en 100 µg/mL PLO løsning per P100 Petriskål. Satt mønstret mot coverslips på hver av disse dråper. Forsegle Petriskål med en plast parafin film å unngå tørking. Ruge over natten på RT.
Merk: PLO løsningen skal være knyttet til coverslips av capillarity. - Forberede fire mottakere (vanligvis P60 Petri retter), fylle tre av dem med PBS og den fjerde med deionisert vann. Forberede to glass størkner retter av ren etanol.
- Ta ut hver dekkglassvæske fra Petri retter, dukke det i første PBS badekaret for 10-15 s, evakuere væske på en absorberende vev ved å sette dekkglassvæske vertikalt på side, sette det inn med f.eks mønstret ansiktet opp på etanol badet.
Merk: Når oppløsningen av photoresist er fullført, blir det vanskelig å finne mønstret siden av dekkglassvæske. Derfor er det viktig å spore plasseringen. - Plasser etanol bandets rett innenfor en ultralydbad sonicator (120 M / 35 kHz) og la photoresist oppløst i 3 minutter.
Merk: Endre etanol bad hver 4 coverslips for å begrense fortynning av PBS som kan svekke oppløsningen av photoresist. - Ta ut dekkglassvæske fra etanol bad og dykke det flere ganger i andre PBS badekaret. Sjekk det overflate aspektet gjentatte ganger til fet-lignende overflaten som resultatene fra gjenværende væsken filmen etanol forsvinner.
- Dukke for 5-10 s i dekkglassvæske i tredje PBS badekaret. Deretter umiddelbart overføre det til deionisert vannbad. Legg til dekkglassvæske på et tørkepapir og tørke den med trykksatt nitrogen bruker en luftpistol.
Merk: Den siste skylling i deionisert vann brukes til å unngå dannelse av PBS krystaller under tørking trinnet.
- Photoresist strukturer for høyde kalibrering
- Denne fremgangsmåten bare 3.1.4. til 3.1.8. bruker dedikert masken (maske "Photoresist striper", se utfyllende filen "Mask_Photoresist-stripes.dxf").
4. chip montering og siste implementering
- Chip montering glass bunn retter
- Sette både PDMS chip og glass rett som det vil være limt inn i plasma kammeret for overflate aktivisering. Parametere: pumping ned Press: 0,25 mbar; O2 forsyning varighet: 3 min; gass flyt: 10 sccm; maksimalt avvik: ±5 sccm; plasma varighet: 30 s; Angi Press: 0.40 mbar; maksimalt avvik: ±0.10 mbar; Angi strøm: 50 M; maksimalt avvik: 5%. ventilasjon varighet: 45 s.
- Forsiktig plassere aktivert PDMS chip i kontakt med glass-dekkglassvæske og delikat legge press på kantene av chip å obligasjonslån chip å dekkglassvæske. For å øke styrken bonding, plass enheten i ovnen på 70 ° C i 5 til 10 min.
Merk: Trykk ikke deler som inneholder søyler, de kan kollapse under mye press. - Under panseret (dvs. på RT) innen 30 min etter binding, plassere en 10-µL tips kjegle fylt med en 100 µg/mL PLO løsning på IHs og injisere væsken. Justere volumet for å danne en nedgang på toppen av hver IHs. Deretter bruker en 1-mL tips kjegle, legge til PBS i Petriskål rundt brikken.
- La chip på RT med et minimum av 2 h inkubasjon tid. For overnatting inkubasjon forsegle Petriskål bruker en plast parafin film for å unngå tørking.
Merk: Væsken bør ikke lekke utenfor chip ellers chip må kastes. - Trykk en 10-µL tips kjegle lett i hver IH og suge opp overflødig væske. Deretter stikke helt tips membran i stikkontakten og utarbeide gjenværende væsken.
- Erstatte PLO ved laminin følgende instruksjonene i trinn 4.1.5 (tømming) og 4.1.3 (fylling). Ruge på RT 1t.
- Erstatte laminin ved kultur medium følgende instruksjonene i trinn 4.1.5 (tømming) og 4.1.3 (fylling). Sammensetningen av kultur medium: MEM 81,8%. Natrium Pyruvate 100 mM 1%. Glutamax 200 mM 1%. Hest Serum 5%. B27 supplement 2%, N2 supplement 1%, Gentamicin 0,2%. filtrere løsningen med en 220-nm filter. Bruker en 1-mL tips kjegle, erstatte også PBS rundt chip ved dette mediet.
- Sette chip i inkubator reguleres på 37 ° C og 5% CO2 for minst 5 h (eller overnatting) før Nevron seeding.
- Chip montering med mønstret coverslips
Merk: Hvis mønstret coverslips inkluderer positive photoresist referanse objekter, utføre trinnene 4.2.1 til 4.2.9. Ellers utføre bare trinnet 4.2.3, stick PDMS enheten på PLO mønstret dekkglassvæske som angitt i 4.1.2, sette kultur medium i og rundt brikken gå deretter til trinn 4.2.10.- Sette en dråpe vann på et rektangulært tykk mikroskop glass lysbilde og stikke dekkglassvæske på objektglass av capillarity (ikke-mønstret siden vendt av objektglass). Under et mikroskop, Merk plasseringen av photoresist striper på baksiden av objektglass med filt penn.
- Plass mønstret glass dekkglassvæske på maske innehaver av maske aligner. Stole på merket gjort med filt penn Center photoresist referanse objektene.
- Utfør plasma trinn som beskrevet i 4.1.1 på PDMS chip.
- Plass PDMS der mobil substrat innehaveren (chuck) av maske aligner.
Merknad: For å øke fiberoptisk kontrast, plassere en silicon wafer under PDMS chip. Silisium kjeks bør være fast knyttet på chuck under justering prosessen (bruk en gjennomsiktig tape for å holde det til chuck). - Løft chuck på grensen av mekanisk kontakt justere chip med utvalg av photoresist striper på dekkglassvæske.
- Oppnå mekanisk kontakt mellom brikken og dekkglassvæske ved endt opp løfte chuck til overflaten av PDMS søyler touch glass dekkglassvæske.
- Lavere chuck. Fjern dekkglassvæske nå limt til chip fra maske abonnenten. Deretter plassere enheten i en 35 mm Petriskål og overføre alt i ovnen (temperatur: 70 ° C) i 5-10 min å øke bånd styrken.
- Utføre som i trinn 4.1.3.
Merk: Hvis bruker PLO mønster coverslips, gå direkte fra trinn 4.2.7 å gå 4.2.9. - Erstatte PLO ved plating middels følgende fremgangsmåten beskrevet i trinnene 4.1.5 (tømming) og 4.1.3 (fylling). Bruker en 1-mL tips kjegle, erstatte også PBS rundt chip ved dette mediet.
- Sette chip i inkubator reguleres på 37 ° C og 5% CO2 til Nevron seeding, med et minimum av 5 h inkubasjon tid.
5. Nevron kultur
- Forberede 100 mL disseksjon medium (HH medium) ved å blande 10 mL av HBSS 10 x, 2 mL Hepes 1 M og 88 mL sterilt vann i en 200-mL plast bolle.
Merk: HH mediet kan tilberedes dagen før kulturen. - Dissekere hippocampus fra E18 mus embryoet Hentet fra en mor euthanized av cervical forvridning (C57BL/6J mus fra Charles Rivers). Trinnene i disseksjon er f.eks i 16.
- Plass hippocampus i et plastrør som inneholder trypsin (0,3 mL av trypsin 2,5%, uten EDTA i 2,7 mL av HH medium) i 10 min på 37 ° C for å starte kjemiske dissosiasjon.
- Forkaste nesten alle flytende og erstatte den med 5 til 10 mL HH bruke engangs plast pipetter. Gjøre det 3 ganger. For siste fyllet, bruk 1 mL av plating medium i stedet for HH.
- Mekanisk distansere vev ved hjelp av en 1 mL tips-membran av ambisjoner og utkasting hele volumet flere ganger, unngår å gjøre bobler og bruke mer enn 15-20 passasjer.
- I en separat 500 µL mottaker, Forbered en løsning å bruke 5 µL av cellen suspensjon fortynnet i 45 µL av PBS. Ta 1 µL av denne løsningen bruker en 10 µL pipette og utvannet suspensjon inn en Malassez celle teller. Bruk indikasjoner i 17 til å beregne antall celler.
Merk: En enkelt hippocampus vanligvis gir ca 0,5 millioner av neurons. - Sentrifuge 100 x g for 6 min på RT.
- Forkast nedbryting og erstatte den med volumet av plating medium kreves for å oppnå en konsentrasjon av 10 millioner celler/mL. Resuspend celler av suksessivt strebe etter og løs ut celle suspensjon med en 1-mL tips kjegle.
- Utarbeide plating mediet i chip (se trinn 4.1.5). Samle 2-3 µL av ferske resuspended løsningen med en 10-µL pipette og injisere det på innløpet (se injeksjon fremgangsmåten i trinn 4.1.3). Gjenta umiddelbart den samme operasjonen på utsalgsstedet.
- Injisere omtrent samme volum av plating medium i hver reservoaret (se trinn 4.1.3).
Merk: Observere raskt chip under mikroskop for å finne tettheten av celler. I størrelsesorden av den optimale celle samsvarer med ca 5-10 celler i kvadrat overflaten avgrenset 4 pillars (om 0.3 mm2, dvs om 15-20 celler per mm2). - Til slutt gjentar trinn 5.10 hjelp i stedet 0,5-1 µL av cellen suspensjon å nå målrettet celle tetthet.
- Plass frø chip i en inkubator reguleres på 37 ° C 5% CO2.
6. fluorescens utelukkelse observasjon
- Utskifting av kultur medium av tenkelig mediet.
- Forberede tenkelig mediet som 4.1.7 men bruker i stedet MEM uten fenol rød og legge fluorescerende dekstran. I dette målet, fortynne dekstran (molekylvekt 10.000 g/mol, lagerløsning konsentrert rundt 10 mg/mL i PBS) for å oppnå en siste konsentrasjon på 0,5-1 mg/mL i tenkelig medium.
Merk: Bruk dekstran conjugates med absorpsjon/utslipp maxima 496/524 eller 650/668. Foretrekke først 0,45 µm høy positiv photoresist strukturer (å kvitte seg med deres auto fluorescens i rød båndbredden) og andre til bildet neurons (mindre giftig). - Tøm alle innganger med en 10-µL pipette og fylle dem helt med imaging mediet (se trinn 4.1.3 og 4.1.5 for presise metoder for middels erstatning).
- Forberede tenkelig mediet som 4.1.7 men bruker i stedet MEM uten fenol rød og legge fluorescerende dekstran. I dette målet, fortynne dekstran (molekylvekt 10.000 g/mol, lagerløsning konsentrert rundt 10 mg/mL i PBS) for å oppnå en siste konsentrasjon på 0,5-1 mg/mL i tenkelig medium.
- Bildebehandling
- Plass der under en epifluorescence mikroskop utstyrt med en miljømessig kammer reguleres på 37 ° C og 5% av CO2. Bruk en 40 X, numerisk blenderåpning (NA) 0.8 tørr objektive, 30% av kreftene (full kraft: 3 M) og 30 ms av eksponeringstid. Hente bilder av celler på fokus (fra én til flere påfølgende bilder ved time-lapse eksperimenter).
- Bildeanalyser
- Normalisere bilder bakgrunn reduksjon rutinen implementert i dedikert programvare for å få en homogen bakgrunn. Se 13 for detaljer om trinnene i denne programvare for bildebehandling. Produksjon image har en. MAT-format.
- Konvertere. MAT fil til. TIFF 8 biter bilder ved hjelp av rutinen innlegge tilleggsmateriale (conversion_mattotiff.m, som krever importfilevol.m).
- Utføre Import > Bildesekvens på ImageJ å bygge en video fra den. TIFF-bilder.
- Beregne mener intensitet P en plassen området lokalisert i sentrum av en søyle (reference-objekt) og mener intensiteten B av et kvadrat kammeret uten celler (bakgrunn, dvs høyden null). Se 18 et eksempel på detaljert metoder for bildebehandling.
Merk: Den laterale dimensjonen av torget områder brukes intensitet referanser må være halvparten av pilar diameter å få et tilstrekkelig antall piksler og unngå lys forurensning fra Pilar kantene. - Bruke P og B verdier for å etablere lineær konverteringen loven fra intensitet jeg til høyde h:
med hc kjente høyden av kammeret,
og
Merk: PDMS viser ingen synlig autofluorescence. - Velg et område rundt sonen rundt, integrere intensitet bruker ImageJ (se 19 for mer informasjon) og bruke konverteringen loven innhentet i 6.3.5 måle volumet av en celle kupé.
Merk: Sonen rundt kan velges basert på fluorescens sub Mobiltlf elementer som begrepsordbok, f.eksfor valg av vekst kjegler i GFP-LifeAct neurons, velger sonen av interesse i GFP utslipp kanalen, lagre konturene av dette sone benytter en avkastning Bestyrer verktøyet, så målet cellen volumet vedlagt i den samme sonen i utslipp kanalen av dekstran (i rødt).
og
Representative Results
Resultatet av prosessen med fabrikasjon beskrevet i delene 1 og 2 er illustrert av bilder av figur 1A-1B og kurven med figur 1 c. Tabellen i figur 1 d viser grovheten verdiene av to forskjellige representative områdene PDMS chip, dvs i central og 20 µm høy neste mellomliggende kammeret. En nedgang i grovhet med en faktor på ca 7 er innhentet ved hjelp av etset Si wafer i stedet for SU-8 photoresist. Deretter ble FXm først brukt på en photoresist stripe av kjente geometri (figur 2A) innen en 10 µm høy kammer. Etter bildebehandling og intensitet til høyde konvertering (se grafen til figur 2B), FXm profiler på tverrsnitt langs denne stripe (figur 2C) gi ønsket høyde profilene (figur 2D). Figur 2D viser sammenligningen mellom profiler får mekanisk profilometry og FXm metoder. Disse profilene, inkludert kanten og platå verdi, er svært like, validere metoden. Spredning av FXm data er ikke representative for full oppløsning metoden som ytterligere vurdert i Figur 3 og Figur 4, men resultatene fra den lave intensiteten ansatt for å unngå en mulig effekt av den meget svakt Auto-fluorescens av photoresist i GFP kanalen.
Så observerte vi neurites i 3 µm og 10 µm høy chambers (Figur 3). Standardavviket for bakgrunnsstøy er 18 nm etter intensitet høyde konvertering og bakgrunn rettingen. Denne verdien er litt høyere enn fysisk grovheten på PDMS overflater støpt på silisium overflater (12 nm, se tabellen i figur 1 d) men mye lavere enn grovheten målt på PDMS innhentet fra SU-8 former. Disse resultatene markere merverdien av boring i silisiumskiver i stedet for å åpne hull i SU-8 photoresist å kaste søyler. Så lav verdi gir en høy signal til støyforhold og svært klare bilder i volum som det som vises i figur 3A. Som et eksempel på dataene som kan hentes fra slike bilder, vi beregnet volumet av 1.6 µm (dvs. 10 piksler) bredt neurite skjær (se grafen til figur 3B). Bruke i en første tilnærming en lineær tilpasning av disse dataene gir mening neurite høydeverdien om 400 nm, sammenlignes med f.eks 500-nm axonal diameter funnet i 10 dager gamle pups i corpus callosum 5. Vi også kombinert FXm med micropatterns av vedheft serielt abutted 2 µm og 6 µm Sjøstriper på 30 µm i lengde. Vårt mål var å studere påvirkning av neurite bredden på formen 3D. Figur 3 c viser en 3D representasjon i falske farger av en hel Nevron bilde innhentet i en 10 µm høy kammer. Neurites sprer seg på 2 µm og 6 µm Sjøstriper, mens soma ligger på enden av den største stripen. Høyde profiler ble trukket i tre forskjellige tverrsnitt. I sammenheng med diagrammet vises i figur 3A, integrert overflaten over tverrsnitt øke med neurite bredden (figur 3D).
Vi har også fokusert på vekst membran (GC) 3D strukturer. Figur 4 A-B viser to forskjellige GC profiler innhentet i en 3 µm høy kammer, som markere forgrenet sub strukturen. I tillegg utført vi time-lapse eksperimenter for å følge dynamikken i volumet av GCs i en 12 µm høy kammer. Figur 4C viser en syklus av krymping og reaktivering av et gitt GC innenfor en tidsskala på noen titalls minutter. Gjennom bruk av GFP-lifeact mus, veksten kjeglene ble lokalisert i GFP utslipp bølgelengde (510 nm) fra deres høy begrepsordbok konsentrasjon. Overflaten identifisert på bølgelengde ble brukt til å integrere over dekstran utslipp bølgelengde på 647 nm å beregne GC volum. Figur 4 d viser endelig fordeling av GC volumet på forskjellige tidspunkt og sted på tre ulike neurons, sentrert på en verdi av ca 6 µm3.
Figur 1: FXm PDMS kamre. (A) ordninger for de fire ulike viktigste trinnene i microfabrication fører til siste mold. Plasseringen av innløp og utløp reservoarene er angitt. Skalere barer: 1 mm. (B) bilde av PDMS FXm kammeret får en optisk profilometer. Dette bildet viser sentrale kammeret som inneholder 3 rader 10 µm høye søyler og mellomliggende chambers på 20, 50 og 90 µm i høyden. Skala bar: 500 µm. (C) tverrsnittvisningen av chip langs to stiplede linjer trukket i (B). Gul/gull: tverrsnitt langs pilarer, blå: tverrsnitt mellom søyler. (D) at verdiene for PDMS grovheten målt på 50 × 50 µm2 områder støpt på silisium og på 20 µm høy SU-8 mellomliggende kammeret (se pilene for plasseringen av disse områdene). Mean verdier Hentet fra målinger av tre forskjellige områder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kalibrering av FXm metoden bruker en photoresist stripe som gjenstand for interesse. (A) GFP-fluorescens bilde tatt i en 10 µm høy kammer fylt med 10 000 MW dekstran absorberende på 488 nm på 1 mg/mL. (B: bakgrunn, P: søyle). Observasjon med en tørr 40 X NA 0,8 mål. Skala bar: 50 µm. (B) lineær kalibrering lov innhentet fra mener intensiteten av de to fargede rektanglene i A. (C) fluorescens intensitet profil på nivået på den blå stiplet linjen vises i (A), krysset photoresist stripe (0,45 µm høy positiv photoresist). (D) sammenligning av profiler Hentet fra mekaniske profilometer (svarte prikker) og FXm etter intensitet til høyde konvertering av data i (B) (blå prikker). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Neurite volum bildebehandling. (A) Neurite strekker seg inn i sentrale 3 µm høy kammeret fra soma ligger i neste 15 µm mellomliggende kammeret. Bildebehandling utført med 10 000 MW dekstran absorberende på 488 nm og en 40 X, NA 0,8 tørr mål. Rammemargen innhentet etter bruk av bakgrunnen reduksjon rutinemessig høydepunktene de to neurites og valgte å plotte grafen til høyre. Skalere barer: 30 µm. (B) Neurite skive volum som en funksjon av neurite bredde innhentet fra 22 profiler (gjennomsnitt på 10 bildepunkter, dvs på en 1.6 µm "neurite del") vises i (A). Den heltrukne linjen representerer en lineær tilpasning av skråningen 0,4 µm passerer gjennom origo. (C) falske fargebilde av en mønstret Nevron på en selvklebende stripe laget av påfølgende 2 µm og 6 µm bredt stubber (representert i hvitt). Målinger ble gjort i en 10 µm høy kammer fylt med 10 000 MW dekstran absorberende på 647 nm og bruker en 40 x NA 0,8 tørr mål. (D) høyde profiler for de fargede stiplede linjene vises i (C), holde samme fargekode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: statisk og dynamisk vekst kjegle bildebehandling. (AB) Vekst kjegle høyde profiler oppnådd i en 3 µm høy kammer etter intensitet til høyde konvertering retning gul vises i tilknyttede bildene. Observasjon utført med fyll med 10 000 MW dekstran absorberende på 488 nm og en 40 X, NA 0,8 tørr mål. (C) hele Nevron imaging i en 12 µm høy kammer fylt med 10 000 MW dekstran absorberende på 647 nm. Observasjoner er gjort i to fluorescerende kanaler: GFP for vekst kjegle lokalisering (stiplet gul linje) og CY5 til å beregne GC volum fra fluorescens eksklusjon. Overflaten inkludert av stiplede gule linjer ble brukt til å beregne GC volum. Diagrammet viser variasjonen av GC volum over tid, og tilknyttede morphologies i både GFP og CY5 kanaler på to representant ulike tidspunkt. Alle data ble kjøpt med en 40 x NA 0,8 tørr mål hver 3 min. skala barer: 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Maskere 1:8 µm laget | Maske 2:30 µm lag | Maske 3:40 µm lag |
| SU-8 type | 2007 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 2000 rpm | 30 s @ 3050 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Myk bake | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Eksponering energi | 110 mJ/cm2 | 155 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Etter eksponering bake | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Utvikling | 2 min 30 s | 5 min | 6 min |
| Hard bake (valgfritt) | 3-5 minutter @ 200 ° C | 3-5 minutter @ 200 ° C | 3-5 minutter @ 200 ° C |
Tabell 1: klima og jordsmonn fremgangsmåten utført for å bygge et apparat som inneholder en sentral kammer av 12 μm høyde. Høyder av mellomliggende kamre: 20, 50 og 90 µm.
| Trinn | Maske 1:10 µm lag | Maske 2:30 µm lag | Maske 3:40 µm lag |
| SU-8 type | 2007 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 1500 rpm | 30 s @ 3050 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Myk bake | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Eksponering energi | 125 mJ/cm2 | 155 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Etter eksponering bake | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Utvikling | 2 min 30 s | 5 min | 6 min |
| Hard bake (valgfritt) | 3-5 minutter @ 200 ° C | 3-5 minutter @ 200 ° C | 3-5 minutter @ 200 ° C |
Tabell 2: klima og jordsmonn fremgangsmåten utført for å bygge et apparat som inneholder en sentral kammer av 10 μm høyde. Høyder av mellomliggende kamre: 20, 50 og 90 µm.
| Trinn | Maske 1:12 µm lag | Maske 2:32 µm lag | Maske 3:40 µm lag |
| SU-8 type | 2015 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 3250 rpm | 30 s @ 2500 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Myk bake | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Eksponeringstid | 140 mJ/cm2 | 157 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Etter eksponering bake | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Utvikling | 3 min | 5 min | 6 min |
| Hard bake (valgfritt) | 3-5 minutter @ 200 ° C | 3-5 minutter @ 200 ° C | 3-5 minutter @ 200 ° C |
Tabell 3: klima og jordsmonn fremgangsmåten utført for å bygge et apparat som inneholder en sentral Mysteriekammeret 3 μm høyde. Høyder av mellomliggende kamre: 18, 50 og 90 µm.
Utfyllende data 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Skjematisk visning av masker brukt å dikte PDMS enheten (DRIE maske og masker 1-3). Klikk her for å laste ned denne filen.
Utfyllende data 2: filen "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektroniske filer tillater for å dikte DRIE masken og masker 1-3. Klikk her for å laste ned denne filen.
Utfyllende data 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektroniske filer tillater for å dikte masken brukes til klima og jordsmonn av photoresist striper. Klikk her for å laste ned denne filen.
Utfyllende data 4: fil conversion_mattotiff.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Utfyllende data 5: fil importfilevol.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Volum bildebehandling av neurons utgjør en utfordring for FXm teknikken på grunn av lang og tynn utvidelser av disse cellene. Denne protokollen beskriver varianter av den samme typen microfluidic enhet dedikert Nevron bildebehandling.
Foruten aspektene ved microfluidic design, valg av målet er grunnleggende for fluorescens utelukkelse bildebehandling og innebærer en avveining mellom lateral oppløsning og bilde klarhet. Det har vært vist i 13 at en høy NA fører til en dybde av fokus mindre enn kammer høyden ikke var skadelig for presisjonen av volummåling hvis imaging ble utført på fokus og en tilstrekkelig margin står mellom konturen for objektet av jeg nterest og grensene for integrering overflaten. Men svekker bruk av et kammer mye høyere enn dybden av fokus bildeskarphet på grunn av Foton diffusjon, som utjevner kantene på objekter av interesse. Fabrikasjon av en 3 µm høy kammer redusert dette lateral sløret og gitt svært godt definerte fluorescerende utelukkelse bilder selv med høy NA (0,8) 40 X mål å visualisere neuronal grener med lateral høyoppløselig.
Chip montering er et kritisk punkt, spesielt i 3 µm høy kamre, men forsiktig manipulasjon som beskrevet i 4.1.2 unngår sammenbruddet av taket. Høy overflaten volumkontrollen tilknyttet disse tynne kamre reiste også spørsmålet om stabilitet dekstran konsentrasjon over tid. Vi har sjekket at overflaten absorpsjon av dekstran etter en natt med inkubering var ubetydelig: etter erstatter dekstran av PBS, forskjellen av intensitet pilaren og bakgrunnen var ca 1 per 1000 av første intensitet kontrasten mellom disse to regionene i nærvær av dekstran. Merk at neurons kan overholde både bunn-dekkglassvæske og PDMS taket. Denne effekten forsvinner når bruke mønstret coverslips (dvs. når vi ikke ruge selvklebende molekyler innenfor PDMS kammeret) som belegget er derfor strengt lokalisert på bunnen av kammeret.
Bortsett fra deres utfordrende morfologi, neurons er ganske egnet til FXm skyldes det faktum at en av stor begrensning av metoden, i.e. dekstran endocytose, er svært begrenset i disse cellene. Vi velger en 10 kDa formulering å undertrykke på lang rekkevidde (timer) noen synlig endocytose fenomener.
Avslutningsvis er FXm konseptuelle enkelhet balansert av et sett med eksperimentelle problemer som er løst av nåværende protokollen, for eksempel nanometric PDMS råhet og micrometric kammeret høyde eller bakgrunn korreksjon korrigere ujevnheter i PDMS loftet mellom søyler. Men gir bruk av en tett microfluidic kammer begrense fluorescerende mediet noen spesifikke begrensninger som behovet for støtte pilarer, som senker effektivt overflaten tilgjengelig for celleadhesjon eller nødvendigheten av å ekskludere soma fra sentralt kammer å observere neuronal utvidelser med den høyeste klarheten, som begrenser regionene i cellen tilgjengelig for høy oppløsning observasjon. En mulig utviklingen av denne metoden ville være å bli kvitt denne fysiske confinement, erstattes av en optisk. Den nye utviklingen av lys ark mikroskopi kan kombineres advantageously med FXm i fremtiden.
Disclosures
Forfatterne erklære noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne ChiLab, materialer og Microsystems laboratorium - Politecnico di Torino - DISAT, i person av Prof C F Pirri, Dr. M Cocuzza og Dr. S L Marasso, for deres dyrebare støtte i Prosessutvikling og enhet fabrikasjon. Vi takker Victor Racine fra Quantacell diskusjonsforum og kundestøtte i bildebehandling. Vi er takknemlige for Isabelle Grandjean og Manon Chartier fra dyr anlegget Institut Curie for deres støtte for mus, og Pablo Vargas og Ana-Maria Lennon (Institut Curie) for å gi oss GFP LifeAct mus. Vi er takknemlige for Olivier Thouvenin fra Institut Langevin og Clotilde Cadart, Larisa Venkova og Matthieu Piel fra Institut Curie - UMR 144, for deres hjelp i forståelsen av fluorescens utelukkelse metoden. Til slutt, vi takker teknologisk plattform Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) for deres støtte i microfabrication. Dette arbeidet var støttes delvis av den europeiske Research Council avansert Grant nr. 321107 "CellO," PSL Université (SwithNeuroTrails prosjekt), ANR Investissement d'Avenir, og IPGG Labex og Equipex.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
| NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
| Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
| Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
| Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
| PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
| Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
| Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
| Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
| Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
| Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
| Masks | |||
| DRIE | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
| S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
| Small laboratory equipment | |||
| 1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
| Scalpel or razor blade | |||
| 9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
| Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
| Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
| Substrates | |||
| Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
| 24x24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
| Photoresists and developpers | |||
| AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
| AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
| SU-8 2007 | MicroChem | ||
| SU-8 2025 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
| Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
| MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
| Laboratory consumables | |||
| Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies - ThermoFisher | ||
| P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
| 20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
| Transparent scotch tape | |||
| Square wipes | VWR | 115-2148 | |
| Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
| Chemicals | |||
| (3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
| PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| isopropanol | W292907 | ||
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 - 50 mL | |
| Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
| 3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
| acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
| Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies - ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
| Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies - ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
| Culture medium | |||
| MEM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 21090-022 | |
| Horse Serum | LifeTechnologies - ThermoFisher | 26050088 | |
| B27 | LifeTechnologies - ThermoFisher | 12587-010 | |
| Glutamax 200 mM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 11360-070 | |
| Gentamicin | LifeTechnologies - ThermoFisher | 15710-049 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| HBSS 10x | LifeTechnologies - ThermoFisher | 14180-046 | |
| Hepes 1M | LifeTechnologies - ThermoFisher | 15630-056 | |
| trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
| Neurobasal | LifeTechnologies - ThermoFisher | 21103-049 | |
| Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies - ThermoFisher | 12348-017 | |
| Softwares | |||
| Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
| ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
| Routine | ImageJ | Supplementary data | |
| Routine | Matlab | Supplementary data |
References
- Jun, S., Taheri-Araghi, S. Cell-size maintenance: universal strategy revealed. Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).
- Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis. J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).
- Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals. Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).
- Iacono, D., et al. Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).
- Cheli, V. T., et al. Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice. J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).
- Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures. J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PloS one. 10 (3), (2015).
- Aguet, F., et al. Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).
- Roland, A. B., et al. Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth. eLife. 3, (2014).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization. Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).
- Bottier, C., et al. Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique. Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).
- Cadart, C., et al. Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells. Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).
- Marasso, S. L., et al. A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors. Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).
- Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas. Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).
- Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Götz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).
- abcam. Counting cells using a hemocytometer. , Available from: http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2017).
- ImageJ. Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing. , Available from: https://imagej.net/Image_Intensity_Processing (2017).
- ImageJ. 19. Tools. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html (2017).
