Summary
Volym är en viktig parameter om fysiologiska och patologiska egenskaperna hos cellerna. Vi beskriver en fluorescerande utslagning metod så att full-fältmätningar av in vitro- neuronala volym med sub Mikrometerinställning axiella upplösning krävs för analysen av neuriter och dynamiska strukturer antyds i neuronal tillväxt.
Abstract
Volym är en viktig parameter angående fysiologiska och patologiska kännetecken av nervceller på olika tidsskalor. Nervceller är ganska unika celler angående deras utökade förgrenat morfologier och följaktligen höja flera metodologiska utmaningar för volymmätning. I det särskilda fallet med in vitro- neuronal tillväxt, bör den valda metoden inkluderar sub Mikrometerinställning axiella upplösning kombinerat med full-fält observation på tidsskalor från minuter till timmar eller dagar. Till skillnad från andra metoder som cell form återuppbyggnad med confocal imaging, elektriskt-baserade mätningar eller Atomic Force Microscopy, har den nyligen utvecklade fluorescens utslagning metoden (FXm) potential att uppfylla dessa utmaningar. Men trots att de är enkla i dess princip, kräver genomförandet av en högupplöst FXm för nervceller flera justeringar och en särskild metod. Vi presenterar här en metod baserad på kombinationen av fluorescens utslagning, låg-ojämnheter flera fack mikroflödessystem enheter och slutligen micropatterning att uppnå in vitro- mätningar av lokal neuronala volym. Den höga upplösningen som tillhandahålls av enheten tillät oss att mäta den lokala volymen av neuronala processer (neuriter) och volymen av vissa specifika strukturer som deltar i neuronal tillväxt, såsom tillväxt kottar (GCs).
Introduction
Exakt kunskap om cellulära volym har uppmärksammats ökat under de senaste åren, driven av frågan om cell storlek homeostas i encelliga mikroorganismer 1 och mer generellt i mitotiska celler 2. Frågan om cellvolym är dock relevant också för efter mitotiska celler, som nervceller utgör en paradigmatisk exempel.
Volymen är faktiskt en viktig signatur av fysiologiska och patologiska händelser vid olika skalor och tidpunkter i neuronala liv, från övergående axonal deformation är associerad till elektrisk aktivitet (millisekund skala) 3 till den oåterkalleliga neuronala svullnad som inträffar under den asymtomatiska fasen av neurodegenerativa sjukdomar (åren hos människa) 4. I största Volymändring sker dock i en mellanliggande tidsskala dagar eller veckor (beroende på den ansedda organismen) under neuronal tillväxt. Utökad och komplexa morfologi av nervceller väcker multiplar frågor, bland vilka regleringen av cellstorleken. Axonal längd och diameter är verkligen hårt reglerad i vivo, med värden som är specifika för varje neuronala typ 5,6.
Dessa frågor, komplexa att hantera i vivo, kan också behandlas på ett förenklat sätt in vitro-. I detta mål krävs en metod tillägnad volymmätning snabbt nog att följa tillväxtdynamik (dvs. i en tidsskala minuter) och kompatibel med observation över timmar eller dagar. Flera metoder har utvecklats under åren för att ge en direkt eller indirekt tillgång till cellulära volym in vitro. Cell återuppbyggnad från confocal imaging är en av dem, men denna metod innebär märkning och upprepade exponeringar för ljus medan du visar en begränsad axiella upplösning på ca 500 nm 7. Observera att dessa två sista nackdelar delvis övervinnas genom en mer sofistikerad och senaste metod som heter galler ljus ark mikroskopi 8. Atomic Force Microscopy har varit användas 9 men denna skanning metod är av kärnan långsam och omständlig. Den fysiska kontakten som det kräver med cellen kan dessutom störa mätningen med tanke på den extrema mjukheten av nervceller 10. Indirekta metoden använder impedans eller resonans har använts för olika cell typer 11, men är otillräcklig för utökad självhäftande celler som nervceller.
En av de mest lovande metoderna bygger på måttet på den uteslutna mängden celler i en nära kammare fylld med ett fluorescerande färgämne. Metoden fluorescens utslagning (FXm) är enkel i sin princip eftersom det kräver ingen märkning, och är lämplig för snabba och långsiktiga optisk avbildning av cellpopulationer med en potentiellt sub optiska axiella upplösning. Mer exakt, beror upplösningen i z på maximal fluorescensintensiteten i kultur kammaren (dvs. i regionen saknar celler) dividerat med det dynamiska omfånget av kameran, även om flera bullerkällor begränsa denna ultimata resolution. Denna metod har varit mycket kraftfullt att följa volymen av migrerar vidhäftande celler 12 eller studera Volymändring under Mitos av däggdjursceller, som noggrant beskrivs i 13. Nervceller utgör emellertid en metodologisk utmaning för FXm med tanke på deras omfattande förgrening in i sub Mikrometerinställning processer.
Vi presenterar här en metod som leder till tillverkning av släta FXm chambers att komma åt med hög precision volym och höjd av neuronala grenar och dynamiska strukturer som deltar i neuronal tillväxt som tillväxt kottar.
Chambers bör ha liknande höjder än objektet att mäta för att optimera axiella upplösning. Därför har vi utformat olika FXm enheter kännetecknas av centrala mätning kammare i tre olika höjder. Den tunnaste (3 µm i höjd) är tillägnad neurite mätning: här låg höjd utesluter soma, som förblir i nära 15 µm hög mellanliggande kammaren. Tjockare centrala chambers (10-12 µm) är tillräckligt höga för att följa den hela celltillväxten. Enheten har även två reservoarer placerade på vardera sidan av den centrala kammaren. Fyra injektion hål (IH) genomförs således och betecknas enligt följande: in- och utlopp tjänar till att införa de cellulära suspensioner i chipet, medan de två andra foder behållarna.
Vi har första fabricerade kalibrering coverslips för höjdmätningar med fotoresist strukturer av känd geometri. Vi har sedan avbildas gratis växande nervceller, men också morfologiskt begränsad nervceller in i micropatterns av vidhäftning.
Protocol
Studien genomfördes i enlighet med Europeiska gemenskapens riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur: 86/609/EEG. Syftet forskning och protokollet beskrivs i projektet etiska bilaga av ERCadg CellO, som godkändes och granskas regelbundet av ERCEA. Institut Curie djuranläggningen har fått licens #C75-05-18, 24/04/2012, rapportering till Comité d'Ethique sv matière d'expérimentation animale Paris centrum et Sud (nationella registreringsnummer: #59).
1. tillverkning av mögel
Obs: Mögel omfattar centrala och mellanliggande kammare ansluten till ett inlopp och en utlopp, plus två reservoarer och vikar belägen på båda sidor av den centrala kammaren.
- Använd platta pincett för att manipulera 51 mm diameter kiselskivor och överföra dem från en plats till en annan.
- Centrala kammaren silikon mögel
- Fyll 2 mL plast pipett med positiv fotoresist. Placera pipetten i mitten av en 51-mm diameter kisel wafer och tryck på dess behållare tills täcker cirka 75% av wafer ytan med fotoresist. Spinn-rocken vid 3000 rpm för 30 s.
- Överföra rånet från den spin-bestrykare till en värmeplatta, med en yttemperatur på 100 ° C, 50 s.
- Överföra rånet från värmeplattan till innehavaren substrat (chuck) av den mask aligner. Exponera genom ”DRIE masken” (se kompletterande filer ”masks_neuron_volume_chips.tiff” och ”masks_neuron_volume_chips.dxf”).
- Ta bort rånet från chucken sedan dyka det i en 100 mL glas utkristalliseras maträtt som innehåller utvecklaren (spädning 1:4 i avjoniserat vatten). Släpp rånet och behålla den för 1 min under kontinuerligt och försiktigt omrörning crystallizing skålen.
Obs: För att spara reagenser, fylla crystallizing skålen till 1 cm i höjd på högsta. - Ta tillbaka rånet från utvecklaren och dränka det i en 100 mL crystallizing skål fylld med avjoniserat vatten för cirka 10 s.Then plats rånet på ett hushållspapper och torka den med trycksatt kväve med en luftpistol slag.
- Placera rånet för 50 s på en värmeplatta med en yttemperatur på 115 ° C.
- Utföra djup-Reactive Ion etsning (DRIE) med följande parametrar (mer information på DRIE tekniken kan hittas i referenser 14 och 15); Passivering steg: 50 sccm av C4F8, han backa flöde 10 sccm, CP 10 W, induktivt kopplad Plasma (ICP) 1500 W, totalt tryck 24 mbar, temperatur 18 ° C; Etsning steg: 100 sccm av SF6, han backa flöde 10 sccm, CP 11 W, ICP 1500 W, totalt tryck 24 mbar, temperatur 18 ° C; Passivering tid: 4 s; Etsning tid: 7 s; Total tidslängd: vanligtvis 5 min för ca 10 µm etsade djup.
- Upplösa fotoresist vid dykning substratet i en crystallizing skål fylld med aceton.
- Dränka rånet i en piranha lösning (2/3 H2O2 (30%) och 1/3 H2SO4 (95 %)) för 5 min.
Försiktighet: Lägg alltid H2O2 först och sedan H2så4 och skölj minst 3 gånger i avjoniserat vatten efter rengöring.
- Tillverka formarna motsvarar mellanliggande kamrarna genom att utföra steg 1.2.1 till 1.2.11 efter de parametrar som anges i tabellerna 1-3.
Obs: Varje tabell motsvarar en viss enhet kännetecknas av en viss höjd på central observation avdelningen.
Obs: Utföra hela processen med ökande fotoresister höjder (masker 1 till 3 för varje enhet, se kompletterande filer ”masks_neuron_volume_chips.tiff” och ”masks_neuron_volume_chips.dxf”).- Placera etsade kisel rånet på hållaren spin-bestrykare substrat.
- Kontrollera att den spin-bestrykare fungerar korrekt genom att kontrollera att aspiration av substratet är effektiv (substratet bör snurra och bo på plats under den nominella varvtal).
- Viskositeten hos SU-8 ökar med höjden av intervallet riktade tjocklek. Använd alltid 20-30 mL flaskor för att lagra SU-8 fotoresister och häll det på rånet innan spin-beläggning (SU-8 kan vara alltför trögflytande att manipuleras med plast pipett).
- Häll negativa epoxy-typ fotoresist SU-8 i mitten av substratet tills täcker cirka 75% av kisel rånet, sedan spinn-rocken med parametrar som anges i rad ”Spincoating” i tabellerna.
- Plats belagda rånet på en värmeplatta för varaktighet och temperaturen anges i raden ”mjuk baka”.
- Montera etsade rånet och adekvat ”SU-8 masken” på den mask aligner.
- Justera etsade rånet med mask med dedikerad anpassning kors (typisk storlek av dessa korsar: 50 µm × 150 µm) utformad på varje mask.
Obs: Två kors på varje sida av enheten är tillräcklig (en längst ner till vänster) och en uppe till höger. - Exponera med jag-linjen i den mask aligner (våglängd 365 nm) med en lämplig UV-dos, som anges i rad ”exponering energi”.
Obs: Exponeringstiden är beräknad genom att dividera den exponering energi E specifikt för varje fotoresist med effektiva kraften i UV-lampan, moduleras av absorberingen av masken:
x (1 - Absorptionmask). Absorptionen är ca 20% för flexibel masker och försumbar för krom hård mask. - Plats belagda rånet på en värmeplatta för varaktighet och temperaturen anges i raden ”Post baka”.
- Förbered två 100 mL glas-utkristalliseras rätter, en som innehåller utvecklaren, de andra tomma. Dive rånet i exploatören för varaktighet anges i raden ”utveckling”. Skaka försiktigt crystallizing skålen längs utveckling
- Strö rånet med isopropanol ovanför den tomma crystallizing skålen för ungefär 5 s. Slutligen, placera rånet på ett hushållspapper och torka den med trycksatt kväve med en luftpistol slag.
- Plats belagda rånet på en värmeplatta för varaktighet och temperaturen anges i raden ”hårda baka” (valfritt).
Obs: Detta steg är användbart för att undvika sprickor i fotoresist och ger en homogen platt yta för nästa steg. - Upprepa steg 1.3.1 - 1.3.10 att slutföra de processer som anges i tabell 1-3.
- Efter det sista steget av photolithographyen, silanize slutliga master mögel som består av 3 lager av negativa fotoresister av avsänding två 100 µL droppar av Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl) silan på varje sida Master i en 100 mm petriskål. Försegla Petri disken med en plast paraffin film och inkubera 20 min i rumstemperatur (RT).
Obs: De herre mögel är klar och kan användas flera gånger.
- Placera etsade kisel rånet på hållaren spin-bestrykare substrat.
x (1 - Absorptionmask). Absorptionen är ca 20% för flexibel masker och försumbar för krom hård mask.2. tillverkning av PDMS chip
- Häll 90 g av kisel-baserade organisk polymer (Polydimetylsiloxan: PDMS) till en 100 mL plastmugg. Tillsätt 10 g dess härdare (1:10 i vikt). Rör blandningen med plast pipett för 2-3 min.
Obs: Blanda 90 g av PDMS med 10 g härdare för tillverkning av 6 marker. - Lägg blandningen i en vakuum exsickator och pump för ca 30 min för att avlägsna luftbubblor som fångade in PDMS.
- Placera den herre mögel i en P100 petriskål och häll 15 mL av blandningen på mögel med en spruta.
Obs: 15 mL leder till total chip höjd 1,5 mm. - Placera PDMS-mögel strukturen inom ett vakuum exsickator och pumpen tills det finns inga fler luftbubblor som spricker ytan av PDMS.
Obs: Detta steg tar ca 30 min. - Tryck rånet på botten av petriskål med en kon-tips för att undvika döda PDMS volym under rånet. Placera enheten PDMS-mögel i ugnen till 70 ° C i minst 2 h.
- Demold PDMS blocket under en kemisk huva med en rostfri platta spatel och hälla isopropanol på chip. Placera den på den rostfria bänken av huven.
- Skär runt kisel rånet och demold PDMS repliken med en skalpell.
- Skär runt (lämna en 2 mm marginal) chip med en skalpell eller ett rakblad.
- Punch vikar genom att trycka på den 1,5 mm diameter hålslag ordentligt och aktivera den för att skära och rista i hålet på inloppet. Gör likadant på de fyra dedikerade zonerna av chip där vätskan kommer att injiceras.
- Rengöra chip stickning och peeling tejp på microstructured sida. Strö isopropanol på båda sidor. Torka sedan chip med trycksatt kväve med en luftpistol slag.
3. tillverkning av mönstrade coverslips (24 × 24 mm2)
Obs: Manipulera coverslips med böjd pincett.
- Poly-ornithine (PLO) mönster
- Applicera en O2 rengöring plasma på glas coverslips. Parametrar plasma: pumpa ner trycket: 0,25 mbar; O2 leverans längd: 3 min; Gasa flöde: 10 sccm; Maximiavvikelse: ±5 sccm; plasma-längd: 3 min; Ställ in trycket: 0.36 mbar; Maximiavvikelse: ±0.10 mbar; Ange makt: 50 W; Maximiavvikelse: 5%. avluftning varaktighet: 45 s.
- Blanda 484 µL av ättiksyra och 56 µL av 3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane, komplett med absolut etanol att få en total volym på 15 mL.
- Använda en 1 mL spetskonen, sätta en droppe 500 µL av denna lösning på varje täckglas, vänta 2-3 min. torka med ett renrum microfiber wiper.
Obs: Silaniserad glas coverslips kan förvaras upp till 1 månad vid rumstemperatur inom plastlådor förseglade med en plast paraffin film. - Placera varje täckglas på en spin coater ligger i renrumsmiljö. Sätta en droppe av en positiv fotoresist täcker ca 75% av täckglas (ca 500 µL) och spinn-rocken vid 4000 rpm för 30 s för att nå en slutlig tjocklek 0,45 µm.
- Placera coverslips för 1 min på en värmeplatta med en yttemperatur på 115 ° C.
- Använda en mask-aligner, exponera varje täckglas vid en våglängd på 435 nm (G-line) genom dedikerad masken enligt Ferrari parametrar (UV dos om 50-60 mJ.cm–1)
- Förbered 2 glas utkristalliseras rätter, en som innehåller utvecklaren (ingen utspädning), den andra som innehåller avjoniserat vatten.
- Dyk en av varje täckglas i exploatören för 1 min under kontinuerligt och försiktigt omrörning crystallizing skålen. Sedan dränka rånet i avjoniserat vatten för cirka 5 s. plats rånet på ett hushållspapper och torka den med trycksatt kväve med en luftpistol slag.
- Applicera en aktivering O2 plasma med samma parametrar som i 3.1.1.
- Under huven, avsätta fyra 170 µL droppar en 100 µg/mL PLO lösning per P100 petriskål. Sätta coverslips mönstrade ansikte på var och en av dessa droppar. Försegla petriskål med en plast paraffin film att undvika uttorkning. Inkubera över natten vid RT.
Obs: PLO lösningen bör sitta kvar i coverslips genom kapillaritet. - Förbereda fyra mottagare (vanligtvis P60 petriskålar), fylla tre av dem med PBS och den fjärde med avjoniserat vatten. Förbered två glas utkristalliseras rätter av ren etanol.
- Ta ut varje täckglas från Petriskålarna, dränka det i första PBS badet för 10-15 s, evakuera vätskan på ett absorberande vävnad genom att sätta täckglaset vertikalt på sidan, Lägg det med t.ex. i mönstrade upp inne i etanol-badet.
Obs: När upplösningen av fotoresist är klar, det blir svårt att lokalisera den mönstrade sidan av täckglaset. Därför är det viktigt i detta skede kan spåra sitt läge. - Placera den etanol som utkristalliseras maträtt inom ett ultraljudsbad någon sonikator (120 W / 35 kHz) och låt den fotoresist upplösas i 3 min.
Obs: Ändra etanol badet varje 4 coverslips för att begränsa utspädning av PBS som kan försämra upplösningen av fotoresist. - Ta ut täckglaset från etanol badet, sedan dyka det flera tider in i andra PBS-badet. Kontrollera ytan aspekten upprepade gånger tills det fet-liknande yta som resultat från kvarvarande flytande filmen etanol försvinner.
- Dränka för 5-10 s täckglaset in i tredje PBS-badet. Sedan omedelbart överföra det till avjoniserat vattenbad. Placera täckglaset på ett hushållspapper och torka den med trycksatt kväve med en luftpistol slag.
Obs: Den sista sköljningen i avjoniserat vatten används för att undvika bildandet av PBS kristaller under torkning steg.
- Fotoresist strukturer för höjd kalibrering
- Utför endast steg 3.1.4. till 3.1.8. använda dedikerade masken (mask ”fotoresist ränder”, se kompletterande filen ”Mask_Photoresist-stripes.dxf”).
4. chip montering och slutrapporter om genomförandet
- Chip montering på glas botten rätter
- Lägga både PDMS chip och glas skålen som det kommer att bindas in i plasma kammaren för ytan aktiveringen. Parametrar: pumpa ner trycket: 0,25 mbar; O2 leverans längd: 3 min; Gasa flöde: 10 sccm; Maximiavvikelse: ±5 sccm; plasma varaktighet: 30 s; Ställ in trycket: 0.40 mbar; Maximiavvikelse: ±0.10 mbar; Ange makt: 50 W; Maximiavvikelse: 5%. avluftning varaktighet: 45 s.
- Försiktigt in aktiverad PDMS chip i kontakt med täckglaset, och fint tryck på kanterna av chip till bond chip till täckglaset. För att öka bindningstyrkan, placera enheten i ugn på 70 ° C i 5-10 min.
Obs: Tryck inte på delar som innehåller pelarna, de skulle kollapsa av för mycket tryck. - Under huven (dvs på RT) och inom 30 min efter limning, placera en 10-µL spetskonen fyllda med en 100 µg/mL PLO lösning på IHs och sedan injicera vätskan. Justera volymen för att bilda en droppe överst på varje IHs. Sedan använda en 1 mL spetskonen, lägga till PBS i petriskål runt chipet.
- Låt chipet på RT med minst 2 h inkubationstiden. För natten inkubation, täta petriskål med en plast paraffin film för att undvika uttorkning.
Anmärkning: Vätska bör inte läcka utanför chip annars chip måste kasseras. - Tryck på en 10-µL spetskonen lätt in varje IH och suga upp överskottet av vätska. Sedan stick helt spetskonen inuti utloppet och dra upp återstående vätskan.
- Byt ut PLO laminin följande instruktionerna i steg 4.1.5 (tömning) och 4.1.3 (fyllning). Inkubera vid RT i 1 h.
- Ersätta laminin med odlingsmedium följande instruktionerna i steg 4.1.5 (tömning) och 4.1.3 (fyllning). Sammansättning av odlingssubstratet: MEM 81,8%; Natrium pyruvat 100 mM 1%; Glutamax 200 mM 1%; Häst Serum 5%; B27 komplettera 2%, N2 tillägg 1%, Gentamicin 0,2%; Filtrera lösningen med en 220-nm filter. Använda en 1 mL spetskonen, ersätta också PBS kring chip av detta medium.
- Placera chipet i inkubatorn regleras på 37 ° C och 5% CO2 för minst 5 h (eller över natten) innan neuron sådd.
- Chip montering med mönstrad coverslips
Obs: Om de mönstrade coverslips inkluderar positiv fotoresist referensobjekt, utför steg 4.2.1 till 4.2.9. Annars utför endast steg 4.2.3, stick PDMS enheten på det PLO mönstrad täckglaset som anges i punkt 4.1.2, sätta odlingsmedium inuti och runt chip går sedan till steg 4.2.10.- Deponera en droppe vatten på en rektangulär tjock glas objektglas och sticka täckglaset i glas bilden av kapillaritet (icke-mönstrade sidan mot glasskiva). I Mikroskop, markera platsen för fotoresist ränderna på baksidan av en glasskiva med en tuschpenna.
- Placera det mönstrade täckglaset på mask innehavaren av den mask aligner. Förlitar sig på varumärket gjort med en tuschpenna att centrera fotoresist referensobjekt.
- Utför steget plasma som beskrivs i 4.1.1 på PDMS chip.
- Placera PDMS chipet på mobila substrat innehavaren (chuck) av den mask aligner.
Obs: För att öka fiberoptiska kontrast, placera en silicon wafer under PDMS chip. Silicon rånet ska vara stadigt fäst på chucken under justeringsprocessen (Använd en genomskinlig tejp att hålla det till chucken). - Lyft chucken på gränsen för mekanisk kontakt att anpassa chip med utbudet av fotoresist ränder ligger på täckglaset.
- Uppnå mekanisk kontakt mellan chip och täckglaset av färdigställande lyfta chucken tills ytan av PDMS pelare touch på täckglas.
- Lägre chucken. Ta bort den täckglas nu bundna till chip från innehavaren mask. Sedan placera enheten i en 35 mm petriskål och överföra allt in i ugnen (temperatur: 70 ° C) för 5-10 min att öka bindningstyrkan.
- Utför som i steg 4.1.3.
Obs: om använder PLO mönstrade coverslips, gå direkt från steg 4.2.7 att kliva 4.2.9. - Byt ut PLO med plätering medium följande procedurerna som beskrivs i steg 4.1.5 (tömning) och 4.1.3 (fyllning). Använda en 1 mL spetskonen, ersätta också PBS kring chip av detta medium.
- Placera chipet i inkubatorn regleras på 37 ° C och 5% CO2 tills neuron sådd, med ett minimum av 5 h inkubationstiden.
5. neuron kultur
- Bereda 100 mL dissektion medium (HH medium) genom att blanda 10 mL HBSS 10 x, 2 mL Hepes 1 M och 88 mL sterilt vatten i en 200 mL-kolv för plast.
Obs: HH mediet kan förberedas dagen innan kulturen. - Dissekera hippocampus från E18 möss embryo extraheras från en mor euthanized av cervikal dislokation (C57BL/6J möss från Charles Rivers). Steg av dissektion är t.ex. detaljerade i 16.
- Placera hippocampus i ett plaströr som innehåller trypsin (0,3 mL av trypsin 2,5%, w/o EDTA till 2,7 mL HH medium) under 10 minuter vid 37 ° C för att initiera kemiska dissociation.
- Kassera nästan all vätska och ersätta det med 5 till 10 mL HH använda disponibel plast pipetter. Gör det 3 gånger. För den senaste fyllningen, Använd 1 mL plätering medium i stället för HH.
- Mekaniskt separera vävnader med en 1 mL-spetskonen genom blivande och mata ut den full volymen flera gånger, för att undvika att göra bubblor och använda mer än 15-20 stycken.
- I en separat 500 µL mottagare, Förbered en lösning med 5 µL cellsuspension utspätt i 45 µL av PBS. Ta 1 µL av denna lösning med 10 µL pipett och infoga den utspädda suspensionen i en Malassez cell räknare. Använd de uppgifter som anges i 17 för att uppskatta antalet celler.
Obs: En enda hippocampus ger vanligtvis ca 0,5 miljoner nervceller. - Centrifugera vid 100 x g under 6 minuter på RT.
- Avlägsna supernatanten och ersätta det med volymen av plätering medium krävs för att uppnå en koncentration av 10 miljoner celler/mL. Återsuspendera cellerna av successivt aspire och mata ut cellsuspension med en 1 mL spetskonen.
- Utarbeta plätering mediet närvarande i chip (se steg 4.1.5). Samla 2-3 µL av färska återsuspenderad lösningen med 10-µL pipett och injicera det vid inloppet (se injektionsproceduren i steg 4.1.3). Upprepa omedelbart samma operation vid utloppet.
- Injicera ungefär samma volym av plätering medium i varje reservoar (se steg 4.1.3).
Obs: Observera snabbt chipet under mikroskopet för att kontrollera tätheten av celler. Storleksordningen av optimal cell densiteten som motsvarar ca 5-10 celler inom fyrkantiga ytan avgränsade med 4 pelare (om 0,3 mm2, dvs om 15-20 celler per mm2). - Så småningom Upprepa steg 5.10 använda istället 0,5-1 µL cellsuspension att nå riktade cell densiteten.
- Placera de seedade chipet i en inkubator som regleras i 37 ° C 5% CO2.
6. fluorescens utslagning observation
- Byte av odlingsmedium av imaging medium.
- Förbered imaging medium liksom 4.1.7 men Använd i stället MEM saknar fenolrött och tillsätt fluorescerande dextran. I detta mål, späd dextran (molekylvikt 10 000 g/mol, stamlösning koncentrerad på 10 mg/mL i PBS) för att uppnå en slutlig koncentration av 0,5-1 mg/mL i imaging medium.
Obs: Använd Dextran konjugat med Absorption/utsläpp maxima 496/524 eller 650/668. Föredra först att bild 0,45 µm hög positiv fotoresist strukturer (för att bli av med sin auto fluorescens i den röda bandbredden) och andra bilden nervceller (mindre giftiga). - Töm alla vikar med 10-µL pipett och åter fylla dem helt med imaging mediet (se steg 4.1.3 och 4.1.5 för vilken exakt metod av medelstora byte).
- Förbered imaging medium liksom 4.1.7 men Använd i stället MEM saknar fenolrött och tillsätt fluorescerande dextran. I detta mål, späd dextran (molekylvikt 10 000 g/mol, stamlösning koncentrerad på 10 mg/mL i PBS) för att uppnå en slutlig koncentration av 0,5-1 mg/mL i imaging medium.
- Imaging
- Placera chipet under ett epifluorescensmikroskop utrustad med en klimatkammare regleras vid 37 ° C och 5% av CO2. Använd en 40 X, numeriska bländaröppningen (NA) 0,8 torka objektiva, 30% av full effekt (full styrka: 3 W) och 30 ms för exponeringstid. Skaffa bilder av celler vid fokus (från single till flera på varandra följande bilder vid time-lapse experiment).
- Bildanalys
- Normalisera bilder med rutinen bakgrund minskning genomföras i särskild programvara för att få en homogen bakgrund. Se 13 för information om bildbehandling steg som ingår i detta program. Bild har en. MATTA-format.
- Konvertera. MAT fil till. TIFF 8 bitar bilder med rutin införa kompletterande material (conversion_mattotiff.m, som uppmanar till importfilevol.m).
- Utför Import > bildsekvens på ImageJ att bygga en video från den. TIFF-bilder.
- Beräkna genomsnittlig intensitet P en kvadrat område som lokaliseras i centrera av en pelare (referensobjekt) och genomsnittliga intensiteten B i en kvadrat område på avdelningen saknar celler (bakgrund, d.v.s. höjd noll). Se 18 exempel på detaljerad metod för bildbehandling.
Obs: Den laterala dimensionen av de fyrkantiga områden används som intensitet referenser måste vara ungefär hälften av pelare diameter att få ett tillräckligt antal pixlar samtidigt undvika ljusföroreningar från pelaren kanter. - Använd värdena P och B för att upprätta linjär konvertering lagen från intensitet jag till höjd h:
med hc kända höjden på avdelningen,
och
Obs: PDMS visar inga detekterbara autofluorescens. - Välj ett område runt zonen av intresse, integrera intensitet använder ImageJ (se 19 för mer information) och tillämpa den konvertering lag erhållits i 6.3.5 att mäta volymen av en cell kupé.
Obs: Zonplanera av intresse kan väljas baserat på fluorescensen av sub cellulära element liknar aktin, t.ex., för val av tillväxt koner i GFP-LifeAct nervceller, Välj zonen av intresse i GFP utsläpp kanalen, spara konturen av detta zon med en ROI manager verktyget, sedan åtgärd cell volymen inneslutna inom samma zon i kanalen utsläpp av dextran (i rött).
och
Representative Results
Resultatet av processen för tillverkning som beskrivs i avsnitt 1 och 2 illustreras av bilder av figur 1A-1B och kurvan i figur 1 c. Tabellen i figur 1 d visar ojämnheter värdena av två olika representativa områden av PDMS chip, dvs i central och 20 µm hög nästa mellanliggande kammaren. En minskning av ojämnheter med en faktor på ca 7 har erhållits med etsade Si wafer i stället för SU-8 fotoresist. FXm var sedan först tillämpas på en fotoresist rand av känd geometri (figur 2A) inom en 10 µm hög kammare. Efter bildbehandling och intensitet till höjd konvertering (se grafen av figur 2B), FXm profiler utförs på tvärsnitt längs denna rand (figur 2 c) ger önskad höjd profiler (figur 2D). Figur 2D visar jämförelsen mellan profiler som erhållits med mekanisk profilometry och FXm metoder. Dessa profiler, inklusive kant och platå värde, är mycket lika, validera metoden. Observera att spridningen av FXm data inte är representativa för den ultimata resolutionen av metoden, som vidare bedömas i figur 3 och figur 4, men resultaten från lågintensivt anställd för att undvika en möjlig effekt av den mycket svaga Auto-fluorescens av fotoresist i GFP-kanal.
Då observerade vi neuriter i 3 µm och 10 µm hög kammare (figur 3). Standardavvikelsen för bakgrundsljud är ungefär 18 nm efter intensitet till höjd konvertering och bakgrunden korrigering. Detta värde är något högre än fysiska ojämnheter på PDMS ytor gjuten på kisel ytor (12 nm, se tabellen i figur 1 d) men mycket lägre än den strävhet som mäts på PDMS erhållits från SU-8 formar. Dessa resultat belysa mervärdet av att borra brunnar i kiselskivor i stället för att öppna hål i SU-8 fotoresist att gjuta pelarna. Ett sådant lågt värde tillåter en hög signal till brus-förhållande och mycket tydliga bilder i volym som det visas i figur 3A. Som ett exempel på data som hämtas från sådana bilder, vi beräknas volymen av 1,6 µm (dvs 10 pixlar) brett neurite skiva (se grafen av figur 3B). Använda i en första approximation en linjär passform av dessa data ger en genomsnittlig neurite höjdvärde av cirka 400 nm, att jämföras med t.ex. 500-nm axonal diameter Funna i 10 dagar gamla ungar inom corpus callosum 5. Vi har också kombinerat FXm med micropatterns av vidhäftning bestående av seriellt abutted 2 µm och 6 µm breda ränder 30 µm i längd. Vårt mål var att studera inverkan av neurite bredd på dess 3D-formen. Figur 3 c visar en 3D-representation i falsk färg av en hela neuron-bild som erhållits i en 10 µm hög kammare. Neuriter sprids på 2 µm och 6 µm breda ränder, medan soma ligger på delen av den största randen. Höjd profiler drogs i tre olika tvärsnitt. I konsekvens med graph visas i figur 3A, integrerade ytan över tvärsnitt ökar med neurite bredd (figur 3D).
Vi har också fokuserat på tillväxt kon (GC) 3D-strukturer. Figur 4 A-B visar två olika GC profilerna som erhållits i en 3 µm hög kammare, som belyser deras Grenade sub-strukturen. Dessutom utförde vi time-lapse experiment för att följa dynamiken i volymen av GCs i en 12 µm hög kammare. Figur 4 c visar en cykel av krympande och reaktivering av en given GC inom en tidsskala på några tiotals minuter. Tack vare användningen av GFP-lifeact möss, tillväxt kottar var lokaliserade i GFP utsläpp våglängden (510 nm) från deras höga aktin koncentration. Den ytan som identifierats vid våglängden som användes för att integrera över dextran utsläpp våglängden på 647 nm att beräkna GC volym. Figur 4 d visar slutligen fördelningen av GC volym vid olika tidpunkter och läge på tre olika neuroner, centrerad på ett värde av ca 6 µm3.
Figur 1: FXm PDMS chambers. (A) system av fyra olika huvudsakliga stegen av mikrofabrikation leder till den slutliga mögel. Platsen av inlopp, utlopp och reservoarer indikeras. Skala barer: 1 mm. (B) bild av PDMS FXm kammaren erhålls med en optisk profilometer. Denna bild visar den centrala kammaren innehållande 3 rader av 10 µm hög pelare och mellanliggande avdelningar med 20, 50 och 90 µm i höjd. Skalstapeln: 500 µm. (C) tvärsnittsvyn av chip i två streckad linje dras i (B). Gul/guld: tvärsnitt utefter pelare, blå: tvärsnitt mellan pelarna. (D) menar värden av PDMS råhet mätt på 50 × 50 µm2 områden gjutna på kisel och på 20 µm hög SU-8 mellanliggande förbränningskammaren (se pilarna för lokalisering av dessa områden). Genomsnittliga värden erhölls från mätningar av tre olika områden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kalibrering av FXm metoden använder en fotoresist rand som objekt av intresse. (A) GFP-fluorescens bild tagen i en 10 µm hög kammare fylld med 10.000 MW dextran absorberande på 488 nm vid 1 mg/mL. (B: bakgrund, P: pelaren). Observation med en torr 40 X NA 0,8 objektiv. Skalstapeln: 50 µm. (B) linjär kalibrering lag erhållits från genomsnittliga intensiteten av de två färgade rektanglar som visas i A. (C) fluorescens intensiteten profil erhålls i nivå med den blå streckad linje visas i (A), passerar fotoresist rand (0.45 µm hög positiv fotoresist). (D) jämförelse av de profiler som erhålls från mekaniska profilometer (svarta prickar) och FXm efter intensitet till höjd konvertering av data av (B) (blå prickar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Neurite volym imaging. (A) Neurite sträcker sig in i centrala 3 µm hög kammaren från soma ligger i nästa 15 µm mellanliggande kammaren. Imaging utförs med 10 000 MW dextran absorberande på 488 nm och en 40 X, NA 0,8 torka mål. Den infällda erhållits efter användning av rutinen bakgrund minskning belyser de två neuriter och valt att rita grafen till höger. Skala barer: 30 µm. (B) Neurite skiva volym som en funktion av neurite bredd erhålls från 22 profilerna (genomsnitt på 10 pixlar, dvs på en 1,6 µm ”neurite slice”) visas i (A). Den heldragna linjen representerar en linjär passform lutning 0,4 µm passerar genom origo. (C) falsk färgbild av en mönstrad neuron på en självhäftande remsa tillverkad av successiva 2 µm och 6 µm breda stubbar (representerade i vitt). Mätningarna gjordes i en 10 µm hög kammare fylld med 10.000 MW dextran absorberande på 647 nm och använder en 40 x NA 0,8 torka mål. (D) höjd profiler motsvarar de färgade streckade linjer som visas i (C), att hålla samma färgkod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: statiska och dynamiska tillväxt kon imaging. (A-B) Tillväxt kon höjd profiler erhålls i en 3 µm hög kammare efter intensitet till höjd konvertering längs de gula linjerna som visas i tillhörande bilder. Observation som utförs med en fyllning med 10 000 MW dextran absorberande på 488 nm och en 40 X, NA 0,8 torka mål. (C) hela neuron imaging i en 12 µm hög kammare fylld med 10.000 MW dextran absorberande på 647 nm. Observationer har gjorts i två fluorescerande kanaler: GFP för tillväxt kon lokalisering (streckad gul linje) och CY5 att beräkna GC volym från fluorescens utslagning. Ytan ingår streckad gul linje användes för att beräkna GC volym. Diagrammet visar variationen av GC volym över tid och associerade morfologier i både god Jordbrukarsed och CY5 kanaler i två representativa olika tidpunkter. Alla data förvärvades använder en 40 x NA 0,8 torka mål varje 3 min. skala barer: 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Steg | Maskera 1:8 µm skikt | Maskera 2:30 µm skikt | Maskera 3:40 µm skikt |
| SU-8 typ | 2007 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 2000 rpm | 30 s @ 3050 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Mjuk baka | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Exponering energi | 110 mJ/cm2 | 155 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Efter exponering baka | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Utveckling | 2 min 30 s | 5 min | 6 min |
| Hårda baka (tillval) | 3-5 min vid 200 ° C | 3-5 min vid 200 ° C | 3-5 min vid 200 ° C |
Tabell 1: utförda Photolithography steg för att bygga en enhet som innehåller en central avdelning med 12 μm i höjd. Höjder på mellanliggande avdelningar: 20, 50 och 90 µm.
| Steg | Maskera 1:10 µm skikt | Maskera 2:30 µm skikt | Maskera 3:40 µm skikt |
| SU-8 typ | 2007 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 1500 rpm | 30 s @ 3050 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Mjuk baka | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Exponering energi | 125 mJ/cm2 | 155 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Efter exponering baka | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Utveckling | 2 min 30 s | 5 min | 6 min |
| Hårda baka (tillval) | 3-5 min vid 200 ° C | 3-5 min vid 200 ° C | 3-5 min vid 200 ° C |
Tabell 2: utförda Photolithography steg för att bygga en enhet som innehåller en central avdelning med 10 μm i höjd. Höjder på mellanliggande avdelningar: 20, 50 och 90 µm.
| Steg | Maskera 1:12 µm skikt | Maskera 2:32 µm skikt | Maskera 3:40 µm skikt |
| SU-8 typ | 2015 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 3250 rpm | 30 s @ 2500 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Mjuk baka | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Exponeringstid | 140 mJ/cm2 | 157 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Efter exponering baka | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C |
| Utveckling | 3 min | 5 min | 6 min |
| Hårda baka (tillval) | 3-5 min vid 200 ° C | 3-5 min vid 200 ° C | 3-5 min vid 200 ° C |
Tabell 3: utförda Photolithography steg för att bygga en enhet som innehåller en central avdelning med 3 μm i höjd. Höjder på mellanliggande avdelningar: 18, 50 och 90 µm.
Kompletterande data 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematisk bild av de masker som används för att tillverka PDMS enheten (DRIE mask och masker 1-3). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande data 2: filen ”masks_neuron_volume_chips.dxf”. Elektroniska filer gör det möjligt för att tillverka DRIE masken och masker 1-3. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande data 3: ”Mask_Photoresist-stripes.dxf”. Elektroniska filer gör det möjligt för att tillverka den mask som används för photolithographyen av fotoresist ränder. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande data 4: fil conversion_mattotiff.m vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande data 5: fil importfilevol.m vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
Volym avbildning av nervceller utgör en utmaning för FXm teknik på grund av de långa och tunna förlängningar av dessa celler. Det här protokollet beskriver varianter av samma typ av mikrofabricerade enhet tillägnad neuron imaging.
Bredvid delarna av mikrofabricerade design, val av målet är grundläggande för fluorescens utslagning imaging och innebär en avvägning mellan laterala upplösning och bildskärpa. Det har visats i 13 att en hög NA som leder till ett djup av fokus mindre än höjden som kammaren inte var skadligt för precisionen för volymmätning om imaging utfördes på fokus och om en tillräcklig marginal lämnas mellan konturen av objektet av i nterest och gränserna för integration ytan. Dock försämrar användningen av en kammare som är mycket högre än skärpedjupet skärpa på grund av fotonen diffusion, vilket jämnar ut kanterna av anmärker av intresserar. Tillverkning av en 3 µm hög kammare minskar denna laterala oskärpa och förutsatt exceptionellt väl definierade fluorescerande utslagning bilder även med hög NA (0,8) 40 X mål att visualisera neuronala grenar laterala med hög upplösning.
Chip montering är ett kritiskt steg, särskilt när det gäller 3 µm hög chambers, men försiktig manipulation som beskrivs i punkt 4.1.2 undviker kollapsen av taket. Kicken ytbehandlar volym-förhållande som är kopplade till dessa tunna kammare upp även frågan om stabiliteten i Dextran koncentration över tid. Vi har kontrollerat att ytan absorptionen av Dextran efter en natt av inkubering var försumbar: efter ersättande Dextran av PBS, är skillnaden i stödnivå mellan pelaren och bakgrunden var ungefär 1 per 1000 av den ursprungliga intensitet kontrasten mellan dessa två regioner i närvaro av Dextran. Observera att nervceller kan följa både på det nedre täckglaset och på PDMS taket. Denna effekt försvinner när med mönstrade coverslips (dvs. när vi inte Inkubera självhäftande molekyler inom PDMS kammaren), som beläggningen är därför strängt lokaliserade nedtill på kammaren.
Förutom sin utmanande morfologi, nervceller är snarare lämpade för FXm på grund av att en av den största begränsningen av metoden, dvs dextran endocytos, är mycket begränsad i dessa celler. Vi väljer en 10 kDa formulering att undertrycka på lång räckvidd (timmar) någon synlig endocytos fenomen.
Sammanfattningsvis, balanseras konceptuella enkelheten i FXm av en rad experimentella problem som har lösts av detta protokoll, till exempel nanometriska PDMS strävhet och Mikrometerinställning kammare höjd eller bakgrundskorrektion att korrigera för unevennessen av PDMS taket mellan pelarna. Men ger användningen av en nära mikroflödessystem kammare att begränsa det fluorescerande mediet några särskilda begränsningar som behovet av stödpelarna, vilket sänker den effektiva ytan för celladhesion, eller nödvändigheten att utesluta soma från central kammare att iaktta neuronala förlängningar med den högsta klarhet, som begränsar regionerna i cellen tillgänglig för högupplösta observation. En möjlig utveckling av denna metod skulle vara att bli av med denna fysiska inneslutningen, för att ersättas av en optisk. Den nya utvecklingen av lätta blad mikroskopi kan kombineras med fördel med FXm i framtiden.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna ChiLab, material och Microsystems laboratorium - Politecnico di Torino - DISAT, i personen av Prof. C F Pirri, Dr M Cocuzza och Dr S L Marasso, för deras värdefulla stöd i processutveckling och enheten fabrication. Vi tackar Victor Racine från Quantacell för diskussion och stöd i bildbehandling. Vi är tacksamma att Isabelle Grandjean och Manon Chartier från djur anläggning av Institut Curie för deras stöd för möss, och Pablo Vargas och Ana-Maria Lennon (Institut Curie) för att förse oss med GFP LifeAct möss. Vi är tacksamma att Olivier Thouvenin från Institut Langevin och Clotilde Cadart, Larisa Venkova och Matthieu Piel från Institut Curie - UMR 144, för deras hjälp i förståelsen av fluorescens uteslutandet metod. Slutligen tackar vi den tekniska plattformen av Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) för deras stöd i mikrofabrikation. Detta arbete stöds delvis av den europeiska forskningen rådet Advanced Grant nr 321107 ”CellO” PSL Université (SwithNeuroTrails-projektet), ANR Investissement pris, och IPGG Labex och Equipex.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
| NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
| Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
| Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
| Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
| PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
| Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
| Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
| Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
| Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
| Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
| Masks | |||
| DRIE | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
| S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
| Small laboratory equipment | |||
| 1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
| Scalpel or razor blade | |||
| 9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
| Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
| Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
| Substrates | |||
| Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
| 24x24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
| Photoresists and developpers | |||
| AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
| AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
| SU-8 2007 | MicroChem | ||
| SU-8 2025 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
| Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
| MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
| Laboratory consumables | |||
| Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies - ThermoFisher | ||
| P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
| 20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
| Transparent scotch tape | |||
| Square wipes | VWR | 115-2148 | |
| Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
| Chemicals | |||
| (3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
| PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| isopropanol | W292907 | ||
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 - 50 mL | |
| Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
| 3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
| acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
| Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies - ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
| Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies - ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
| Culture medium | |||
| MEM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 21090-022 | |
| Horse Serum | LifeTechnologies - ThermoFisher | 26050088 | |
| B27 | LifeTechnologies - ThermoFisher | 12587-010 | |
| Glutamax 200 mM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 11360-070 | |
| Gentamicin | LifeTechnologies - ThermoFisher | 15710-049 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| HBSS 10x | LifeTechnologies - ThermoFisher | 14180-046 | |
| Hepes 1M | LifeTechnologies - ThermoFisher | 15630-056 | |
| trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
| Neurobasal | LifeTechnologies - ThermoFisher | 21103-049 | |
| Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies - ThermoFisher | 12348-017 | |
| Softwares | |||
| Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
| ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
| Routine | ImageJ | Supplementary data | |
| Routine | Matlab | Supplementary data |
References
- Jun, S., Taheri-Araghi, S. Cell-size maintenance: universal strategy revealed. Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).
- Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis. J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).
- Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals. Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).
- Iacono, D., et al. Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).
- Cheli, V. T., et al. Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice. J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).
- Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures. J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PloS one. 10 (3), (2015).
- Aguet, F., et al. Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).
- Roland, A. B., et al. Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth. eLife. 3, (2014).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization. Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).
- Bottier, C., et al. Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique. Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).
- Cadart, C., et al. Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells. Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).
- Marasso, S. L., et al. A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors. Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).
- Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas. Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).
- Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Götz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).
- abcam. Counting cells using a hemocytometer. , Available from: http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2017).
- ImageJ. Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing. , Available from: https://imagej.net/Image_Intensity_Processing (2017).
- ImageJ. 19. Tools. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html (2017).
