Summary
Nieuwe protocollen worden hier beschreven om te isoleren en karakteriseren van deeltjes afgeleid van mens en muis neutrofiele granulocyten. Deze protocollen gebruiken ultracentrifugatie en stroom cytometry immunoblotting technieken voor het analyseren van microparticle inhoud, en ze kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de rol van deeltjes afgeleid van verschillende celtypes in cellulaire functie.
Abstract
Polymorfonucleaire neutrofiele afkomstige deeltjes (PMN)-MPs) zijn lipide dubbelgelaagde, sferische microvesicles met maten, variërend van 50 – 1.000 nm in diameter. Parlementsleden zijn een nieuwe ontwikkeling, belangrijk onderdeel van cel naar cel communicatie en signalering machines. Vanwege hun omvang en de aard van hun release, tot voor kort MP bestaan werd over het hoofd gezien. Echter, met verbeterde technologie en analytische methoden hun functie in gezondheid en ziekte is nu in opkomst. De hier gepresenteerde protocollen beogen te isoleren en karakteriseren van PMN-MPs door stroom cytometry en immunoblotting. Bovendien worden de verschillende uitvoering voorbeelden gegeven. Deze protocollen voor MP isolatie zijn snelle, goedkope en vereisen niet het gebruik van dure kits. Bovendien, zij maken voor de etikettering van MPs na het isoleren, evenals het vooraf labeling van broncellen voorafgaand aan MP release, met behulp van een membraan-specifieke fluorescente kleurstof voor visualisatie en analyse door stroom cytometry. Deze methoden hebben echter verschillende beperkingen, met inbegrip van de zuiverheid van PMNs en MPs en de behoefte aan geavanceerde analytische instrumentatie. Een high-end stroom cytometer is nodig om op een betrouwbare manier analyseren van MPs en valse positieve leest als gevolg van lawaai of auto-fluorescentie te minimaliseren. De beschreven protocollen kunnen worden gebruikt om te isoleren en definiëren van MP biogenese en karakteriseren van hun markeringen en variatie in samenstelling onder verschillende stimulerende omstandigheden. Grootte heterogeniteit kan worden benut om te onderzoeken of de inhoud van membraan deeltjes versus exosomes is anders, en of ze voldoen aan de verschillende rollen in weefsel homeostase. Tot slot de volgende isolatie en karakterisatie van MPs, hun functie in cellulaire reacties en verschillende modellen van de ziekte (met inbegrip van, PMN-geassocieerde inflammatoire aandoeningen, zoals inflammatoire darmziekten of Acute Lung Injury) kunnen worden onderzocht.
Introduction
Onlangs, "microdeeltjes/microvesicles" uit de cel cytosol of plasmamembraan geworden van wetenschappelijke belangstelling, zoals opkomende gegevens suggereren dat deze structuren, variërend van 50-1000 nm in diameter, biologische informatie kunnen dragen en dienen als een niet-canonieke manier van mobiele communicatie. Immuun cel-afgeleide MPs en met name degenen geproduceerd door polymorfonucleaire neutrofielen (PMNs) zijn van groot belang, gezien de belangrijke rol van PMNs in host defense1,2, inflammatoire reacties3en wond-genezing 4. intrigerend, tot dusver talrijke rapporten is gebleken zowel pro-inflammatoire en anti-inflammatoire functies van PMN-MPs5, hetgeen wijst op een mogelijke kader-, ziekte-, soort- en orgel-specifieke rol van MPs.
Beschreven protocollen in deze mededeling bieden een kosteneffectieve, innovatieve en flexibele methode om te studeren van de functie van MPs in gezondheid en ziekte. Zij zijn van toepassing op vele modelorganismen, organen en stimulatie voorwaarden. Zij toestaan voor de identificatie van verschillende soorten MPs en in de toekomst inspelen op hun pro-inflammatoire en anti-inflammatoire functies kunnen worden gebruikt. Beschreven als voorbeeld, hier is hoe te het bestuderen van de functie van PMN-MPs in epitheliale wond genezing in vitro en in vivo. Het gepresenteerde protocol voor isolatie van muis beenmerg-afgeleide PMNs is aangepast met enkele wijzigingen van een eerder beschreven methode6.
Bovendien protocollen die in deze studie worden beschreven voor de detectie en karakterisatie van specifieke markers die worden op PMN-MPs door twee complementaire methoden gevonden kunnen toestaan: Western blot en stroom cytometry. Wij vinden dat immunoblotting van MPs met standaardprotocollen5 is eenvoudig en betrouwbaar, echter, recente vooruitgang in de gevoeligheid van stroom cytometry instrumenten en betere ruis-signaalverhouding nu toestaan voor verdere analyse van MPs met behulp van deze methode. De beschreven protocollen in deze studie nemen recente vooruitgang en aanbevelingen van het oorspronkelijke onderzoek voorwerpen, met inbegrip van wijzigingen te centrifugeren snelheid en tijd, de toevoeging van monster filteren en bevriezing/opslag voorwaarden7 , 8, en hoe te verminderen de "achtergrondgeluid", de detectiegrens van PMN-MPs te verbeteren, en onderscheid maken tussen verschillende maten van MPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de noordwestelijke IACUC. Alle experimenten werden voltooid in overeenstemming en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren. Voor proefpersonen doneren van bloed, werd een geïnformeerde toestemming gepresenteerd en ondertekend; Daarnaast werden alle proefpersonen in deze studie behandeld overeenkomstig de richtsnoeren van het institutionele en federale voor menselijk welzijn.
Opmerking: De stappen van het protocol worden vermeld onder de volgende subsecties: (i) muis beenmerg cel isolatie; (ii) PMN isolatie van lymfkliertest beenmerg; (iii) PMN isolatie uit menselijk bloed; (iv) MP isolatie van PMN supernatant (door ultracentrifugatie); (v) karakterisering van parlementsleden door het westelijke bevlekken; (vi) karakterisatie van MPs door Stroom Cytometry; (viii) toepassing van geïsoleerde MPs studie wond genezing
1. muis beenmerg cel isolatie
-
Dissectie van het bovenbeen en onderbeen van de achterpoten zijn muis
- Een euthanasie-vak (bijvoorbeeld, een lege 1 mL tip box) voorbereiden door inhalatie van de verdoving. Voeg een paar druppels van 100% Isofluraan op een steriele doek geplakt is aan de binnenkant van een plastic doos deksel. Volgens nieuwe richtlijnen van de IACUC, moeten de dieren niet in direct contact komen met Isofluraan, dus plaats de houder van een tip tussen de muis en het gaas met het Isofluraan.
Opmerking: Isofluraan is een krachtige respiratoire verdovingsmiddel en moet worden behandeld met extreme voorzichtigheid in een zuurkast. - Euthanaseren muizen per IACUC aanbeveling. Plaats een muis in de doos van de euthanasie beschreven in stap 1.1.1 voor 1 – 5 min, totdat het is ademhaling. Waarborgen van het dier dood door het uitvoeren van een cervicale dislocatie.
- Til de buikhuid met behulp van roestvrij staal, 12 cm gebogen, 0,17 X 0,1 mm pincet en snijd de huid halverwege tussen de bovenste en onderste extremiteiten. Schil de huid vanaf hier naar de meest distale gedeelte van het lichaam van de muis met inbegrip van de onderste ledematen. Met 10 cm lange, rechte ontrafeling van schaar, verwijderen van de spieren van de achterpoten en ontreddering van het heupgewricht en het dijbeen hoofd intact.
- Gebruik schaar om te ontleden de spieren van het dijbeen en het scheenbeen en het dijbeen scheiden van het scheenbeen. Zorg ervoor dat de uiteinden van de botten intact blijven zoals ze grote hoeveelheden van het beenmerg bevatten.
- Verwijder alle overige vlees door het walsen van de botten in een papieren handdoek. Plaats de schone botten in een petrischaal met serumvrij Medium (SFM, dat wil zeggen, de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) zonder serum of antibiotica).
- Spoel de botten in 70% ethanol en vervolgens in SFM.
- Bereiden SFM in een conische tube van 50 mL 50 mL. 10 mL SFM in een 10 mL spuit laden en deze koppelen aan een 25 en 5/8 inch gauge naald.
- Trim het einde van de botten met een schaar, totdat een opening naar het beenmerg (roodachtige kleur) zichtbaar is.
- Spoel de cellen van het beenmerg in een nieuwe tube van 50 mL. Gebruik een 10 mL spuit met een naald gauge 26 en 5/8 inch met ongeveer 3 mL/been van SFM. Wanneer u klaar bent blozen, resuspendeer de cellen in de buis door pipetteren (gebruik wegwerp 1 mL kunststof tips) te breken cel aggregaten.
- Een euthanasie-vak (bijvoorbeeld, een lege 1 mL tip box) voorbereiden door inhalatie van de verdoving. Voeg een paar druppels van 100% Isofluraan op een steriele doek geplakt is aan de binnenkant van een plastic doos deksel. Volgens nieuwe richtlijnen van de IACUC, moeten de dieren niet in direct contact komen met Isofluraan, dus plaats de houder van een tip tussen de muis en het gaas met het Isofluraan.
2. PMN isolatie uit lymfkliertest beenmerg
-
Lysis van de cel van de Red
- De verzamelde beenmerg pellet door centrifugatie bij 350 x g gedurende 8 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet cel in 20 mL 0,2% NaCl voor ongeveer 20-30 s Lyse de erytrocyt breuk. Niet meer dan 30 s als dit zal resulteren in PMN lysis. Voeg 20 mL van 1,6% NaCl om te herstellen van de osmolaliteit.
Opmerking: Deze stap kan leiden tot weinig PMN activering. - Wassen van de cellen met 2 mL PBS en centrifuge zoals in stap 2.1.1 hierboven. Verwijder het supernatant.
- Isolerende PMNs voortzetten door dichtheid kleurovergang centrifugeren.
-
Isolatie van neutrofielen door dichtheid kleurovergang centrifugeren
- Warme polysucrose en natrium diatrizoate oplossingen, met dichtheid van 1.119 g/mL en 1.077 g/mL (Zie Tabel of Materials), tot kamertemperatuur (RT) vóór gebruik.
- Polysucrose en natrium diatrizoate verlopen vers, onmiddellijk voorafgaand aan het beenmerg cel toepassing door langzaam gelaagdheid 3 mL van de 1.077 g/mL dichtheid oplossing meer dan 3 mL van de oplossing van de dichtheid 1.119 g/mL in 15 mL conische buisjes voorbereiden.
Opmerking: Voorbereiding van de kleurovergang oplossing te ver van tevoren zal resulteren in het mengen van de lagen en de arme neutrofiele zuiverheid en het herstel. - Resuspendeer de beenmerg cel pellet in 1 mL ijskoud PBS en de resulterende celsuspensie op de top van de polysucrose en natrium diatrizoate overlay kleurovergang (langzaam, om te voorkomen dat het mengen van de lagen).
- Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 850 x g bij 25 ° C bij RT, zonder rem. Houd de reagentia op RT voor effectieve scheiding van de neutrofielen andere cellen in het beenmerg aanwezig. De centrifuge vastgesteldop traag vertraging te voorzien van het verloop moet efficiënt worden gevormd en worden gehandhaafd na het centrifugeren stap.
- Visueel zoeken een mononucleaire cellaag op het raakvlak van PBS en 1.077 g/mL dichtheid oplossing (bovenste laag). Verwijder deze laag en de rest van de dichtheid oplossing zonder verstoring van de PMN-band.
- Een volledige PMN-laag en een aantal van de onderliggende polysucrose en natrium diatrizoate 1.119 g/mL oplossing in 15 mL tubes met behulp van een precisiepipet overdracht verzamelen.
Opmerking: De zuiverheid van de geïsoleerde PMNs zal afhangen van een volledige verwijdering van de bovenste laag. - Top van de buizen met gefilterde PBS (gefilterd door een 0.1 µm filter voor de grootte van de poriën) en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
- Wassen van de Ingehuld PMNs met 2 mL PBS met behulp van de centrifugeeromstandigheden zoals in stap 2.2.7.
- Resuspendeer in 1 mL gefilterde PBS en tellen van de geïsoleerde PMNs door hemocytometer.
Opmerking: Voor deze methode van de isolatie, de resulterende PMN zuiverheid bedraagt ~ 85-90%, zoals werd beoordeeld door stroom cytometry. De resterende verontreiniging van breuken bestaat voornamelijk uit mononucleaire lymfocyten.
-
PMN stimulatie voor het opwekken van MP versie
Opmerking: PMNs kan worden gestimuleerd om vrij van MPs met behulp van verschillende activerend voorwaarden, met inbegrip van N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) of Interferon gamma (IFNγ). Nog belangrijker is, voorafgaand aan de simulatie, moeten PMNs worden gehouden op het ijs te allen tijde.- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) en resuspendeer in 0.1 µm gefilterd Henks evenwichtige oplossing (HBSS) zoutoplossing, die bevatten de stimulerende agent van keuze. Voor optimale stimulatie, 100 µL stimulatie oplossing per 10 miljoen PMNs voor 20-30 min bij 37 ° C in 15 mL buizen te gebruiken.
Opmerking: De volgende concentraties van stoffen werden met succes gebruikt in onze vorige werk: fMLF (0,5-1 µM voor mens en 2-5 µM voor muis PMNs), PMA (200 nM), en IFNγ (100 ng/mL). Indien de vrijlating van vooraf gelabelde MPs is gewenst, incubeer ongestimuleerde PMNs (1-5 x 106) met N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (Zie Tabel van materialen) (1 µM in 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Ga verder met de stappen 2.3.1-2.3.3. - Spin down bij 850 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, PMNs verwijderen en overbrengen van cel-vrije supernatant naar nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen.
- Voor de isolatie van de MP van cel-vrije supernatant, ga verder met stap 4.2.
- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) en resuspendeer in 0.1 µm gefilterd Henks evenwichtige oplossing (HBSS) zoutoplossing, die bevatten de stimulerende agent van keuze. Voor optimale stimulatie, 100 µL stimulatie oplossing per 10 miljoen PMNs voor 20-30 min bij 37 ° C in 15 mL buizen te gebruiken.
3. PMN isolatie uit menselijk bloed
-
Gezonde vrijwilligers voor bloed extractie volgens de richtlijnen van de institutionele IRB werven.
- Het verzamelen van bloed van de onderarm van de gezonde vrijwilliger in verkrijgbare 5 mL Natriumcitraat-bevattende buizen (Zie Tabel van materialen).
- Pipetteer 5 mL dextran en natrium diatrizoate-oplossing (dichtheid van 1.113 g/mL, Zie Tabel van materialen) in steriele 15 mL tubes en langzaam laag 5 mL vers geïsoleerde perifere bloed op de top van het.
- Centrifugeer de buizen voor 50 min op 400 x g bij RT (25 ° C) met een lage versnelling en geen rem.
- Aan het einde van het centrifugeren, door de plasma en mononucleaire cellen (bovenste laag) met behulp van een steriele kunststof zuig pipet te verwijderen.
- Breng de onderlaag (PMNs) in een nieuwe steriele 50 mL conische buis.
- Voeg een gelijk volume van 0,45% NaCl aan PMNs (mix goed en voorzichtig door de draaiing van de buis).
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 400 x g bij 25 ° C.
-
Lysis van de cel van de Red
- Voeg vervolgens 10 mL ijskoud, steriel water naar Ingehuld cellen voor 45 s gevolgd door 10 mL ijskoud steriele 1,8% NaCl om te herstellen van de osmolaliteit.
Opmerking: Alle volgende stappen voor PMN isolatie moeten worden uitgevoerd op ijs PMN activering en voortijdige MP versie te voorkomen. De lysis stap zelf resulteert in kleine, maar niet significant PMN-activering, het is echter essentieel voor het isoleren van een zuivere PMN bevolking voor functionele testen. - Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 250 x g bij 4 ° C met zachte vertraging.
- Herhaal stap 3.2.1 en 3.2.2.
- Resuspendeer PMNs in 5 mL ijskoud HBSS zonder calcium of magnesium. Totaal aantal levende cellen tellen (gebruik van een hemocytometer en levensvatbaarheid kleuring bij verdunning 1:2, Zie Tabel of Materials) voor stimulatie.
Opmerking: Geïsoleerde PMNs moeten worden gebruikt voor stimulatie of andere experimenten binnen 2 uur van isolatie functionele en cellulaire veranderingen en celdood te voorkomen.
- Voeg vervolgens 10 mL ijskoud, steriel water naar Ingehuld cellen voor 45 s gevolgd door 10 mL ijskoud steriele 1,8% NaCl om te herstellen van de osmolaliteit.
4. MP isolatie van geactiveerde PMN supernatant
Opmerking: Een soortgelijke protocol wordt gebruikt voor de isolatie van parlementsleden uit lymfkliertest en menselijke PMNs.
- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) en resuspendeer in 0.1 µm gefilterd HBSS oplossing, die bevatten de stimulerende agent van keuze (zie opmerking voor voorbeeld 1 µM fMLF,: 2.3.1). Gebruik 100 µL stimulatie oplossing per 10 miljoen PMNs voor 20-30 min bij 37 ° C in 15 mL tubes voor optimale stimulatie.
- Volgende stimulatie, spin down geactiveerde PMNs bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en supernatant cel-gratis transfer naar nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buizen.
- Centrifugeer het supernatant PMN-gewist bij 13.000 x g, 10 min, 4 ° C tot cel puin verwijderen en breng de gewiste bovendrijvende substantie in een nieuwe ultracentrifuge buis.
- Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 x g, bij 4 ° C. Verwijder supernatant voordat MP opbergt. Zo nodig, winkel Ingehuld MPs in paraffine verzegeld ultracentrifuge buizen bij-80 ° C tot gebruik in experimenten.
5. onderzoek van PMN-MPs door het westelijke bevlekken
- Toevoegen van 1% SDS buffer (50-200 µL met 100 mM Tris pH: 7.4) aan MPs pellet (uit stap 4.4), overdracht naar nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen en kook de lysed MPs gedurende 5 minuten.
Opmerking: Het aantal parlementsleden en het volume van lysis buffer moet worden aangepast en geoptimaliseerd voor elk eiwit van belang. -
Laden van gelijke hoeveelheden PMN-MPs per rijstrook bij het laden van de buffer met 10% β-mercapto-ethanol.
Opmerking: Met onze methode laden wij MPs die geïsoleerd uit hetzelfde aantal gestimuleerd PMNs werden.- Scheiden van de lysates door SDS-PAGE op 10% polyacrylamidegel (50-100 V gebruik voor 1-1,5 h) en totale eiwitten op nitrocellulose membranen overdragen als beschreven9.
- Blokkeren van membranen voor 1 h met 5% non-fat melk in een 0,05% Tween-20 Tris-gebufferde zoutoplossing en Incubeer het met een juiste primaire ('s nachts bij 4 ° C), gevolgd door secundaire HRP-geconjugeerde antilichamen.
- Visualiseer de bands door toe te voegen chemoluminescence oplossing naar de membraan en de blootstelling aan een X-ray film binnen een lichtdicht cassette (1-24 h).
6. onderzoek van PMN-MPs door Stroom Cytometry
-
Verdun voor antilichaam kleuring, antilichamen op de juiste wijze in FACS buffer (PBS met 0,1 mM EDTA, natriumazide 0,1%). Resuspendeer Ingehuld PMN-MPs (afgeleid van 1-3 x 106 PMNs/voorwaarde) in 100 µL antilichaam oplossing.
- Als de kleuring voor Annexine V, resuspendeer Ingehuld PMN-MPs in Annexine V buffer met 5 µL van FITC-geconjugeerd Annexine V. Als mede kleuring met antilichamen, de gewenste antilichamen (voor een voorbeeld Zie Tabel van materialen) rechtstreeks toevoegen aan de Annexine V-oplossing. Toevoegen van lipide-fluorescerende kleurstof, N-(2-aminoethyl) maleimide (Zie Tabel of Materials), bij 1 µM concentratie in 100 µL van FACS buffer etikettering en identificatie van MPs.
- Incubeer de parlementsleden in de kleurstofoplossing gedurende ten minste 20 minuten bij 4 ° C.
- Wassen van de parlementsleden door ultracentrifugatie (1 h bij 100.000 x g, bij 4 ° C); Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer in FACS buffer en draaien van de monsters op een aangewezen stroom cytometer uitgerust met een verbeterde electronische unit voor verhoogde gevoeligheid (Zie Tabel van materialen).
7. de aanvragen voor geïsoleerde PMN-MPs te bestuderen PMN functie in de wondgenezing
-
In vivo toediening PMN-MPs aan Colon wonden
- Anesthetize muizen door een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg). Verdoving door pedaal reflex (stevige teen snuifje) bevestigen en pas als dit nodig is.
- Plaats de muis op de maag en het gebruik van 28 cm biopsie pincet en een endoscoop die is uitgerust met een hoge resolutie camera (zoals een veterinaire endoscoop voor kleine dieren gebruik, Zie Tabel of Materials), genereren de oppervlakkige wonden 3-5 langs de dorsale zijde van de dubbele punt. Na voltooiing van de verwonding, terugkeer muizen voor een kooi geplaatst op de mat van een temperatuurgevoelig (37 ° C) totdat hersteld.
- Anesthetize muizen (zoals in stap 7.1.1). Gebruik een endoscoop te verwerven van de beelden van de toegebrachte wonden 24u (dag 1) na verwonding. Laat de muizen herstellen zoals in stap 7.1.2.
- Beheren op hetzelfde moment (24u na verwonding), lymfkliertest PMN-MPs afgeleid van 2 x 106 PMNs in 100 µL van HBSS + direct in elke wond-site met behulp van een colonoscopie gebaseerde microinjection systeem (gebruik een 29 G naald)9. Drie dagen later (dag 4 na verwonding) anesthetize muizen (zoals in stap 7.1.1) en met een endoscoop opnieuw ophalen van beelden van de genezing van wonden. Laat de muizen herstellen zoals in stap 7.1.2.
- Met behulp van de software van de analyse van de preferent spiegelbeeld (Zie Tabel of Materials), omtrek zichtbare wond regio's in verworven beelden, maatregel het gebied van dezelfde wond dagen 1 en 4 na verwonding en bereken het percentage van de sluiting van de wond.
-
Mens epitheliale cellen in vitro wondgenezing
- Graaf Caco-2 BBe of T84, menselijke intestinale epitheliale cellen door hemocytometer en zaad 5 x 10,5 cellen/well in 24-well cultuur platen. Incubeer de cellen in een ruimte van de standaard incubatie bij 37 ° C en 5% CO2. CaCO-2 BBe of T84 bereiken confluentie binnen 48 h9. Cultuur van epitheliale cellen, DMEM en DMEM-F12 (50:50) gebruiken met supplementen zoals eerder beschreven9.
- Genereren van mechanische kras wonden in de enkelgelaagde met behulp van een pipet tip en lage zuigkracht4,9zoals hiervoor is beschreven. Verwerven van beelden van wond gebieden onmiddellijk na het krassen met een omgekeerde fase contrast differentiële interferentie Microscoop (gebruik 5 X of 10 X doelstellingen), worden gebruikt als een tijd = 0 referentiepunt.
- MPs (afgeleid van 2-4 X 106 PMNs) toevoegen aan krassen-gewond epitheliale cel monolayers en incubeer gedurende een aanvullende 24 h (48u na verwonden, bij 37 ° C met 5% CO2). Op dit moment opnieuw verwerven beelden van de kras-wonden.
- Gebruik de software van de analyse van de preferent spiegelbeeld (Zie Tabel of Materials) voor het meten van de wond gebieden op t = 0 en t = 48 h. Bereken het percentage van de wond sluiting door het verschil in de wond gebied op de geselecteerde tijd punten te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve flow cytometrische analyse van parlementsleden die werden geïsoleerd van menselijke en muis PMNs staan in Figuur 1. De heterogeniteit van de grootte van PMN-MPs kan worden beoordeeld door vergelijking aan bekende formaat kralen zoals afgebeeld in Figuur 1A, B voor menselijke MPs. notitie, werden geen significante verschillen in grootte heterogeniteit waargenomen tussen muis en menselijke MPs. Op dezelfde manier kan gebruikt stroom cytometry en labelen van de fluorescentie, uitdrukking van eiwit/s van keuze door geïsoleerde MPs muis of menselijke oorsprong worden bepaald. Bijvoorbeeld, de uitdrukking van fosfatidyl serine (PhS) kan worden onderzocht door Annexine V kleuring. Lymfkliertest beenmerg PMN-MPs worden weergegeven in Figuur 1C, D. Expressie van verschillende merkers van keuze kan ook worden geëvalueerd zoals voor V Annexine en CD11b vlekken van menselijke MPs, Figuur 2A, B. Een andere methode PMN-MPs worden opgespoord door stroom cytometry is vlek vers-geïsoleerde PMNs voorafgaand aan stimulatie, zoals weergegeven in Figuur 2C. Bijvoorbeeld PMN kleuring met de lipide-markering N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC vóór fMLF stimulatie resultaten in de release van groene MPs, die kan worden gemakkelijk gedetecteerd door stroom. Van de nota, terwijl de kleuring met N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC is eerder gebruikt label en opsporen van MPs die zijn verkregen uit perifere bloed10 of geïnjecteerd in dieren11, het gebruik van andere markeringen voor het labelen van doeleinden in vitro of in vivo toepassing moet worden bepaald door elke onderzoeker. Naast stroom cytometry, kunnen PMN-MPs door immunoblotting voor proteïnen van belang worden geanalyseerd. Zoals blijkt uit Figuur 3, MPs, afgeleid van menselijke PMNs die werden gestimuleerd met verschillende bekende activators, werden onderzocht voor de expressie van sleutel inflammatoire (matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) en myeloperoxidase (MPO)) en anti-inflammatoire (Annexine A1) moleculen. Zo blijkt uit representatief immunoblots, PMN stimulatie met IFNγ (50 ng/mL), PMA (200 nM), en fMLF (1 µM) resulteerde in MPs uiten van uiteenlopende niveaus van MMP-9. Echter enige verstoring van het cytoskelet van de actine door Latrunculin B (1 µM) voorafgaand aan stimulatie met fMLF (5 µM) geleid tot de overvloedige aanwezigheid van MPO in PMN-MPs. Verschillende niveaus van Annexine A1 (hoog naar geen detectie) werden ook aangetroffen op MPs volgend op de beschreven activerend voorwaarden. Deze resultaten suggereren dat PMN-MP samenstelling afhankelijk van de stimulus is.
Ten slotte, Figuur 4 toont hoe geïsoleerd PMN-MPs kunnen worden gebruikt om te studeren wond genezing in vitro en in vivo in Colon schade. PMN-MPs kunnen worden toegevoegd aan de epitheliale monolayers kras-gewond in culturen, waar de genezing kan worden gecontroleerd door imaging verwerving op vooraf bepaalde tijdstippen. MPs kunnen verder microinjected worden rechtstreeks in Colon wonden, die werden gegenereerd door biopsie pincet en Endoscopische imaging9, en hun effect op de genezing kan worden beoordeeld. Voor zowel in vitro als in vivo analyse van wondgenezing, beelden van toegebrachte wonden onmiddellijk na verwonding (of anderszins als opgegeven) worden verworven en continu via het genezingsproces op vooraf bepaalde tijdstippen. Met behulp van de software van de analyse van de commercieel beschikbare beeld, worden veranderingen in de wond gebied (grootte) gemeten en gebruikt om te bepalen van de wond sluiting tarief. Toepassing van PMN-MPs waarin MPO of gekweekte epitheliale monolayers en in vivo op Colon wonden heeft nadelige gevolgen, wat leidt tot vertraagde genezing9.
Figuur 1 . Analyse van PMN-MP grootte en oppervlakte markeringen door stroom cytometry. (A) Flow cytometer geoptimaliseerd controle kralen (Zie Tabel van materialen) van bekende grootte en scatter waarden worden weergegeven in de WS en FSC orthogonale vertegenwoordiging. De parels worden gebruikt om een vergelijking van de relatieve grootte met een steekproef van de PMN-MP in b zijn vermeld (B) menselijke PMN-MPs werden geïsoleerd en geanalyseerd door stroom cytometry voorwaarden beschreven voor de kralen gebruiken. De heterogeniteit in MP maten kan worden gezien. (C-D) MPs afgeleid uit fMLF-gestimuleerd lymfkliertest beenmerg die pmns werden geanalyseerd door stroom cytometry. Representatieve flow diagrammen tonen onbevlekt (C) of Annexine V-FITC gekleurd (D) MPs. rechthoekig gebied shows Annexin V-positieve MPs (FITC-positieve MPs). SSC: Kant Scatter; FSC: Voorwaartse Scatter; PhS: Fosfatidyl serine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . PMN-MP kleuring en analyse door stroom cytometry. (A) Unstained en (B) Annexin V-FITC - en hCD11b-APC-gekleurd MPs. Square gebied omsluit een Annexine V/CD11b dubbele positieve bevolking van PMN-MPs. (C) vers geïsoleerde menselijke PMNs (1 x 106) werden gekleurd met een fluorescente kleurstof , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC en gestimuleerd met fMLF. MPs werden geïsoleerd uit cel supernatant en geanalyseerd door stroom cytometry. Rechthoekig gebied omsluit een N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC-bevolking met positieve MP (M-FITC, label van de y-as). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Samenstelling van PMN-MPs is afhankelijk van de stimulus. (A) menselijke PMNs werden gestimuleerd met IFNγ, TNFα, fMLF, PMA, of een combinatie van latranculin B gevolgd door fMLF (LtB-fMLF). MPs werden geïsoleerd van de resulterende cel supernatant door ultracentrifugatie en eiwit lysates werden voorbereid in 1% SDS buffer. Eiwitten werden gescheiden door grootte electrophoretically in een 10%-polyacrylamidegel overgebracht naar een membraan van het nitrocellulose en peilden voor MMP-9, MPO, of A1 Annexine primair antilichaam, gevolgd door de juiste HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. (B) vertegenwoordiger elektronenmicroscopie beelden van menselijke PMN-MPs verbeelden grootte heterogeniteit. Een exosome < 100 nm in grootte wordt aangegeven door de witte pijl. Schaal bar = 250 nm (links en rechts panelen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Het gebruik van geïsoleerde PMN-MPs in het bestuderen van de rol van PMNs in epitheliale wondheling. (A) Caco-2 BBe menselijke intestinale epitheliale cellen werden verguld confluency, kras-gewond en onderworpen aan MPs afgeleid van 3 miljoen PMNs, die werden toegevoegd onmiddellijk na verwonding. Representatieve beelden tonen wond sluiting (48u na verwonding) in het besturingselement (links panelen) en PMN-MP-testgroep epitheliale cellen (juiste panelen). Schaal bar = 100 µm. (B) te onderzoeken van het effect van PMN-MPs op Colon wond genezing in vivo, geïsoleerde PMN-MPs waren geïnjecteerd rechtstreeks in het gebied van de wond met behulp van een systeem voor endoscopie gebaseerde microinjection (op 24 h na verwonding, het Colon wond is aangegeven door een onderbroken lijn en de injectie naald site wordt weergegeven door een witte pijl). Sluiting van de wond was beoordeeld 3 dagen later (4 dagen na verwonding) door Endoscopische imaging. Schaal bar = 300 µm. (C) 4 dagen na verwonding muizen werden euthanized en Colon mucosal wonden waren gehaald met een schaar, ingebed in optimale snijden temperatuur (O.C.T) omheind en met vloeibare stikstof bevroren. Acht micrometer secties van de wonden waren gekleurd voor E-cadherine (groen) en de nucleaire vlek DAPI (blauw) te beoordelen van het niveau van de nieuwe epithelialization (bovenste panelen), of DAPI (blauw) en Ki67 (rood) te visualiseren de totale en delende epitheliale cellen op de rand van de wond (lagere panelen). Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protocollen voor de isolatie en de karakterisering van MPs PMN-afgeleid worden beschreven in deze mededeling. Verschillende belangrijke kritische punten moet worden in aanmerking genomen voor het succes van de procedure. PMNs moet eerst worden geïsoleerd vers en gebruikt in experimenten binnen 2 uur van isolatie om te voorkomen dat spontane activering en degranulatie. Alle behandeling van PMNs tijdens de isolatie en tot aan het punt van stimulatie moet worden uitgevoerd op het ijs om activering en voortijdige MP versie12te voorkomen. Ten tweede, ultracentrifugatie voor 1 uur of meer maximaliseert de pillering van MPs. derde, voor analyse door stroom cytometry, het instrument correct moet worden gekalibreerd met een mix van instrument opgegeven fluorescerende kralen (het type kralen is aangepast aan een bepaalde instrument) correct definiëren MP maten. Bijvoorbeeld, terwijl een fabrikant van flow cytometers raadt het gebruik van FSC kralen als parameter grootte-gerelateerde, zijn anderen geoptimaliseerd voor SSC kralen. Bovendien moet de cytometer van de stroom moet worden gebruikt voor analyse van de MP worden uitgerust met bijgewerkte elektronica te lossen beste parlementsleden van het achtergrond lawaai.
Om te identificeren correct MPs naast grootte parameters, wordt het gebruik van fluorescentie kleuring zoals beschreven in de bovenstaande procedures sterk aanbevolen. Bovendien, alle oplossingen bij de voorbereiding en de isolatie moeten worden gefilterd via een 0.1 µm filtersysteem tot een minimum beperken van opname van stofdeeltjes of andere precipitaten die de achtergrondgeluiden tijdens overname verhogen zal door stroom cytometry. Bovenal moeten opslagvoorwaardenvoor MPs worden beschouwd. Weinig bewijs8, en onze eigen niet-gepubliceerde opmerkingen, suggereren dat MP bevriezing tot membraan breuk en MP breuk leidt. Ten slotte, verschillende omstandigheden bij PMN activering en timing kunnen veranderen en verbeteren MP opbrengst.
Er zijn enkele beperkingen aan deze methode. Isolatie van muis PMNs uit beenmerg is meestal niet zuiver (~ 85 – 90%) en door andere immune cellen (voornamelijk mononucleaire lymfocyten) is besmet, zoals werd bepaald door flow cytometrische analyse. Dus, kunnen de resulterende isolaten kleine hoeveelheden MPs vrijgegeven door andere immune cellen bevatten. Alternatieven beschikbaar zijn en omvatten Isolatievan PMNs door verkrijgbare magnetische kralen, dit zou echter een langere en een aanzienlijk duurder procedure. Tot slot zonder fluorescentie etikettering, naast de grootte parameters, is definitieve differentiatie van parlementsleden uit stof of andere oplosbare of lucht deeltjes van vergelijkbare grootte die het monster kunnen besmetten uitdagend en foutgevoelig.
In de toekomst, zal sorteren van PMN-MPs aangeduid met specifieke markers helpen ophelderen MP samenstelling onder specifieke voorwaarden, stimulerend of modellen van ziekte, en hopelijk toestaan voor het gebruik van MPs als diagnostische markers en therapeutisch doelwit voor de behandeling van ontstekingsziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflict van belang van welke aard ook aan deze mededeling gerelateerde
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de technische bijstand van Dr. Suchitra Swaminathan die loopt van de noordwestelijke Feinberg School van geneeskunde Stroom Cytometry kern. Financiering werd verstrekt door (NIH) DK101675.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
