Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering og karakterisering av nøytrofile-avledet Microparticles for funksjonell studier

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Summary

Nye protokoller er beskrevet her for å isolere og karakterisere microparticles avledet fra menneskelige og mus nøytrofile. Disse protokollene benytte ultracentrifugation, flowcytometri og immunoblotting-teknikker for å analysere microparticle innhold, og de kan brukes til å studere rollen til microparticles fra ulike celletyper i cellulære funksjoner.

Abstract

Polymorfonukleære nøytrofile-avledet microparticles (PMN)-MPs) er lipid bilayer, sfærisk microvesicles med størrelser fra 50 – 1000 nm i diameter. MPs er en ny utvikling, viktig del av celle-til-celle kommunikasjon og signalnettverk maskiner. På grunn av sin størrelse og natur deres utgivelse, inntil nylig ble MP eksistens oversett. Men med forbedret teknologi og analytiske metoder fremstår funksjoner i helse og sykdom nå. Protokollene som presenteres her er rettet mot isolere og karakterisere PMN-MPs av flowcytometri og immunoblotting. Dessuten er flere implementering eksempler gitt. Disse protokollene MP isolering er rask, rimelig, og krever ikke bruk av dyre kits. Videre tillate de merkingen av MPs etter isolasjon, samt pre merking av kildecellene før MP utgivelsen med en membran-spesifikke fluorescerende farge for visualisering og analyse av flowcytometri. Disse metodene, har imidlertid flere begrensninger inkludert renhet av PMNs og MPs og behovet for avansert analytisk instrumentering. En high-end flyt-cytometer er nødvendig å pålitelig analysere MPs og minimere falske positive leser på grunn av støy eller auto-fluorescens. Beskrevet protokollene kan brukes til å isolere og definere MP biogenesis og karakterisere deres markører og variasjon i komposisjon under ulike stimulerende forhold. Størrelse heterogenitet kan utnyttes for å undersøke om innholdet av membran partikler versus exosomes er forskjellige, og om de oppfyller ulike roller i vev homeostase. Til slutt, følgende isolering og karakterisering av MPs, funksjoner i mobilnettet svar og ulike sykdom modeller (inkludert, PMN-assosiert inflammatoriske lidelser, som inflammatorisk tarm sykdommer eller akutt lungen skade) kan utforskes.

Introduction

Nylig, "microparticles/microvesicles" som stammer fra cellen stoffer eller plasma membranen har blitt av stor vitenskapelig interesse, som nye data tyder på at disse strukturene, fra 50-1000 nm i diameter, kan bære biologiske informasjon og tjene som en ikke-kanoniske metode for mobil kommunikasjon. Immun celle-avledet MPs og spesielt de som produseres av polymorfonukleære nøytrofile (PMNs) er av stor interesse gitt PMNs viktig rollen som vert forsvar1,2, inflammatorisk svar3og sårhelende 4. intriguingly, hittil, mange rapporter har vist både pro-inflammatoriske og anti-inflammatorisk funksjoner PMN-MPs5, antyder en potensiell sammenheng, sykdom, arter- og organ-spesifikke rollen MPs.

Beskrevet protokoller i denne kommunikasjonen gir en kostnadseffektiv, nyskapende og praktisk metode for å studere funksjonen MPS i helse og sykdom. De gjelder for mange modell organismer, organer og stimulering betingelser. De tillater identifikasjon av flere typer MPs og kan brukes i fremtiden å ta deres pro-inflammatoriske og anti-inflammatorisk funksjoner. Som et eksempel, beskrevet slik studere funksjonen PMN-MPS i epithelial sår helbredelse i vitro og i vivo. Presentert protokollen for isolering av musen Ben margtransplantasjon-avledet PMNs ble tilpasset noen endringer fra en tidligere beskrevet metode6.

Videre beskrevet i denne studien-protokoller brukes av karakteristikk av spesifikke indikatorer som kan bli funnet på PMN-MPs av to utfyllende metoder: Western blot og flow cytometri. Vi finner at immunoblotting MPS bruker standard protokoller5 er enkel og pålitelig, men nylige fremskritt innen følsomhet flyt cytometri instrumenter og forbedret støy til signal ratio nå tillater for videre analyse av MPs benytter denne metoden. Beskrevet protokollene i denne studien innlemme siste fremskritt og anbefalinger fra opprinnelige forskningsartikler, inkludert modifikasjoner på sentrifugering fart og tid, tillegg av prøven filtrering og frysing/lagring forhold7 , 8og hvordan redusere "bakgrunnsstøy", forbedre gjenkjenning grensen PMN-MPS og skille mellom forskjellige størrelser av MPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeid ble godkjent av den nordvestlige IACUC. Alle eksperimentene ble avsluttet i samsvar og overholdelse av alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer. For menneskelig fag donere blod, ble en informert samtykke presentert og signert; i tillegg ble alle menneskelige fag i denne studien behandlet de institusjonelle og føderale retningslinjer for menneskelig velferd.

Merk: Punktene protokollen er oppført under avsnittene nedenfor: (i) musen benmarg celle isolasjon; (ii) PMN isolasjon fra Murine benmarg; (iii) PMN isolasjon fra menneskeblod; (iv) MP isolasjon fra PMN Supernatants (ved Ultracentrifugation); (v) karakteristikk av MPs av Western Blotting; (vi) karakteristikk av MPs av flowcytometri; (viii) program isolert MPS til studien sår helbredelse

1. musen benmarg cellen aisolering

  1. Disseksjon av femur og tibia fra musen bakbena
    1. Forberede en euthanasia boks (f.eks, en tomt 1 mL Verktøytips-boksen) for innhalering bedøvelse. Legg noen dråper av 100% isoflurane på en steril klut teipet til innsiden av plasteske lokk. Som nye IACUC retningslinjer, dyr ikke komme i direkte kontakt med isoflurane, dermed plassere en spissen holder mellom musen og gasbind som inneholder isoflurane.
      Merk: Isoflurane er en kraftig inhalasjon-anestesimiddel bedøvelse og bør behandles med ekstrem forsiktighet i avtrekksvifte.
    2. Euthanize mus som IACUC anbefaling. Plass musen inne boksen euthanasia beskrevet i trinn 1.1.1 for 1-5 minutter til det har sluttet å puste. Sikre dyrets død ved å utføre en cervical forvridning.
    3. Løft abdominal huden med rustfritt stål, 12 cm buet, 0,17 X 0,1 mm pinsett og kutt huden mellom øvre og Nedre ekstremiteter. Skrelle huden herfra til mest distale delen av musen kroppen, inkludert Nedre ekstremiteter. Med 10 cm lang, rett dissekere saks, fjerne musklene fra bakbena og dislocate hofteleddet røres femur hodet.
    4. Bruk saks å dissekere musklene femur og tibia atskilt femur fra tibia. Kontroller at endene av bein forblir intakt som de inneholder betydelige mengder benmarg.
    5. Fjern alle gjenværende kjøtt ved å rulle bein i et papirhåndkle. Plass ren bein i en Petriskål inneholder Serum-Free Medium (SFM, i.e.Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) uten serum- eller antibiotika).
    6. Skyll bein 70% etanol og deretter SFM.
    7. Forberede 50 mL av SFM i et 50 mL konisk rør. Last 10 mL SFM 10 mL sprøyter til og knytte den til en 25 og 5/8 tommers gauge nål.
    8. Trim slutten av bein med saks før en åpning til benmargen (rødlig farge) vises.
    9. Tømme benmarg cellene i en ny 50 mL tube. Bruk en 10 mL sprøyte med en 26 og 5/8 tommers gauge nål med ca 3 mL/Ben av SFM. Når ferdig rødme, resuspend cellene i røret av pipettering (bruk disponibel 1 mL plast tips) å bryte celle aggregat.

2. PMN isolasjon fra Murine benmarg

  1. Red cell lysis
    1. Pellets samlet benmargen av sentrifugering 350 x g i 8 min på 4 ° C.
    2. Resuspend celle pellet i 20 mL 0,2% NaCl for ca 20-30 s å lyse røde blodlegemer brøken. Ikke overstige 30 s som dette vil resultere i PMN lysis. Legge til 20 mL 1,6% NaCl gjenopprette osmolality.
      Merk: Dette trinnet kan føre til lite PMN aktivisering.
    3. Vask cellene med 2 mL PBS og sentrifuger som i trinn 2.1.1 ovenfor. Fjerne nedbryting.
    4. Fortsett å skille PMNs med tetthet gradert sentrifugering.
  2. Isolering av nøytrofile av tetthet gradert sentrifugering
    1. Varme polysucrose og natrium diatrizoate løsninger med tettheter av 1.119 g/mL og 1.077 g/mL (se Tabell for materiale), til romtemperatur (RT) før bruk.
    2. Forberede polysucrose og natrium diatrizoate graderinger friske, umiddelbart før benmarg cellen ved sakte lagdeling 3 mL 1.077 g/mL tetthet løsningen over 3 mL 1.119 g/mL tetthet løsningen i 15 mL konisk rør.
      Merk: Tilberedning av gradient langt i forveien vil resultere i blanding av lag og dårlig nøytrofile renhet og utvinning.
    3. Resuspend bein margtransplantasjon celle pellet i 1 mL av iskalde PBS og overlegg resulterende celle suspensjon på polysucrose og natrium diatrizoate gradient (langsomt, å unngå blanding av lagene).
    4. Sentrifuger i 30 min 850 x g ved 25 ° C på RT, uten brems. Hold reagensene på RT for effektiv separasjon av nøytrofile fra andre celler i beinet margtransplantasjon. Angi sentrifuge på treg retardasjon slik at forløpningen effektivt dannet og vedlikeholdes etter sentrifugering trinn.
    5. Synlig finne et mononukleære celle lag på grensesnittet på PBS og 1.077 g/mL tetthet løsning (øverste lag). Fjern dette laget og resten av tetthet løsningen uten å forstyrre PMN bandet.
    6. Samle et helt PMN-lag og noen av de underliggende polysucrose og natrium diatrizoate 1.119 g/mL løsning i 15 mL rør med en overføring pipette.
      Merk: Renheten av de isolerte PMNs vil avhenge av en fullstendig fjerning av øvre laget.
    7. Topp rør med filtrerte PBS (filtrert gjennom filtere 0,1 µm pore størrelse) og sentrifuge 300 x g for 5 min, på 4 ° C.
    8. Vask de pelleted PMNs med 2 mL PBS sentrifugering betingelser som i trinn 2.2.7.
    9. Resuspend i 1 mL av filtrerte PBS og teller de isolerte PMNs av hemocytometer.
      Merk: For denne isolasjon metoden, den resulterende PMN-renheten utgjør ~ 85-90%, som ble vurdert av flowcytometri. De resterende forurensende fraksjoner består hovedsakelig av mononukleære lymfocytter.
  3. PMN stimulering å indusere MP utgivelsen
    Merk: PMNs kan stimulere for å løslate MPs ulike aktivering betingelser, inkludert N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) eller Interferon-gamma (IFNγ). Viktigere, før simulering, bør PMNs holdes på is til alle tider.
    1. Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) og resuspend i 0,1 µm filtrert Hanks balansert Salt løsning (HBSS) løsning, som inneholder den stimulerende agenten for valg. For optimal stimulering, bruk 100 µL stimulering løsning per 10 millioner PMNs i 20-30 minutter på 37 ° C i 15 mL rør.
      Merk: Følgende konsentrasjonen av aktivator ble brukt i tidligere arbeidet: fMLF (0,5-1 µM for mennesker og 2-5 µM for mus PMNs), PMA (200 nM), og IFNγ (100 ng/mL). Hvis utgivelsen av forhåndsinnstilte merket MPs, ruge unstimulated PMNs (1-5 x 106) med N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (se Tabell for materiale) (1 µM i 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Fortsett med trinn 2.3.1-2.3.3.
    2. Nedspinning 850 x g i 5 min på 4 ° C, Fjern PMNs og overføre celle-gratis supernatants til nye 1,5 mL microcentrifuge rør.
    3. MP isolert fra cellen uten supernatants, fortsette til trinn 4.2.

3. PMN isolasjon fra Human Blood

  1. Rekruttere friske frivillige for blod utvinning etter institusjonelle IRB retningslinjer.
    1. Samle blod fra underarmen av sunn frivillig i kommersielt tilgjengelig 5 mL natriumsitrat inneholder rør (se Tabell for materiale).
    2. Pipetter 5 mL av dekstran og natrium diatrizoate løsning (tetthet av 1.113 g/mL, se Tabellen for materiale) i sterilt 15 mL rør og sakte lag 5 mL av fersk isolert menneskelige perifert blod oppå den.
    3. Sentrifuge rør for 50 min på 400 x g ved RT (25 ° C) med lav akselerasjon og ikke brems.
    4. På slutten av sentrifugering, fjerne plasma og mononukleære celler (øverste lag) bruker en steril plast sugekraft pipette.
    5. Overfør det nederste laget (PMNs) til en ny sterilt 50 mL konisk tube.
    6. Legge til en lik mengde 0.45% NaCl til PMNs (mix godt og forsiktig ved å rotere røret).
    7. Sentrifuge for 10 min på 400 x g ved 25 ° C.
  2. Red cell lysis
    1. Legge til 10 mL iskald, sterilt vann i pelleted celler for 45 s etterfulgt av 10 mL av iskalde sterilt 1,8% NaCl gjenopprette osmolality.
      Merk: Alle følgende PMN isolering skal utføres på is å unngå PMN aktivisering og tidlig MP utgivelse. Lysis trinnet selv resulterer i mindre, men ikke signifikant PMN aktivisering, men det er avgjørende for å isolere en ren PMN befolkningen for funksjonell analyser.
    2. Sentrifuge celler for 10 min 250 x g på 4 ° C med myk retardasjon.
    3. Gjenta trinn 3.2.1 og 3.2.2.
    4. Resuspend PMNs i 5 mL av iskalde HBSS uten kalsium og magnesium. Telle totalt levende celler (bruk hemocytometer og levedyktighet flekker på 1:2 fortynning, se Tabellen for materiale) før stimulering.
      Merk: Isolert PMNs bør brukes for stimulering eller andre eksperimenter innen 2 t isolasjon for å unngå funksjonelle og mobilnettet og celledød.

4. MP isolasjon fra aktivert PMN Supernatants

Merk: En lignende protokoll brukes for isolering av MPs fra murine og menneskelig PMNs.

  1. Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) og resuspend i 0,1 µm filtrert HBSS løsning, som inneholder den stimulerende agenten valgfrihet (for eksempel 1 µM fMLF, se merknad: 2.3.1). For optimal stimulering bruke 100 µL stimulering løsning per 10 millioner PMNs i 20-30 minutter på 37 ° C i 15 mL rør.
  2. Følgende stimulering, Nedspinning aktivert PMNs 600 x g i 5 min på 4 ° C og overføre celle-gratis supernatants til nye 1.5-mL microcentrifuge rør.
  3. Sentrifuge nedbryting PMN-merket på 13,000 x g, 10 min, 4 ° C fjerne celle rusk og overføre ryddet nedbryting til en ny ultracentrifuge tube.
  4. Sentrifuger 1t 100.000 x g, på 4 ° C. Fjern supernatants før MP. Nødvendig pelleted butikken MPs i parafin forseglet ultracentrifuge rør ved-80 ° C før bruk i eksperimenter.

5. eksamen PMN-MPS av vestlige Blotting

  1. Legge til 1% SDS buffer (50-200 µL med 100 mM Tris pH: 7.4) til MPs pellets (fra trinn 4.4), overføring til nye 1,5 mL microcentrifuge rør og kok lysed MPs i 5 min.
    Merk: Antall MPs og lyse buffer volumet må justeres og optimalisert for hver protein av interesse.
  2. Laste lik mengde PMN-MPs per kjørefelt i lasting bufferen som inneholder 10% β-mercapto-etanol.
    Merk: Med vår metode vi laster MPs som ble isolert fra samme antall stimulert PMNs.
    1. Skille lysates SDS-side på 10% polyakrylamid gel (bruker 50-100 V 1-1,5 h) og overføre totalt proteiner til nitrocellulose membraner som beskrevet9.
  3. Blokkere membraner 1t med 5% ikke-fett melk i 0,05% Tween-20 Tris-bufret saltvann og ruge det med en passende primære (overnatting på 4 ° C), etterfulgt av sekundær HRP-konjugerte antistoffer.
  4. Visualisere feltene ved å legge chemoluminescence løsning til membran og eksponering for en X-ray film inne en lystette kassett (1-24 h).

6. eksamen PMN-MPS av flowcytometri

  1. For antistoff flekker, fortynne antistoffer riktig i FACS buffer (PBS med 0,1 mM EDTA, 0,1% Natriumazid). Resuspend pelleted PMN-MPs (avledet fra 1-3 x 106 PMNs/tilstand) i 100 µL antistoff løsning.
    1. Hvis flekker Annexin v, resuspend pelleted PMN-MPs Annexin V buffer inneholder 5 µL FITC-konjugerte Annexin v. Hvis co flekker med antistoffer, legge ønsket antistoffer (for en eksempel se Tabellen for materiale) direkte til Annexin V-løsning. Legge til fluorescerende lipid fargestoff, N-(2-aminoethyl) maleimide (se Tabell for materiale), på 1 µM konsentrasjon i 100 µL FACS bufferen etiketten og identifisere MPs.
  2. Inkuber MPs i flekker løsning for minst 20 min på 4 ° C.
  3. Vask MPs av ultracentrifugation (1 h på 100.000 x g, på 4 ° C); Kast nedbryting.
  4. Resuspend i FACS buffer og kjøre prøver på en angitt flyt cytometer utstyrt med en oppgradert elektronisk enhet for økt følsomhet (se Tabell for materiale).

7. programmer for isolert PMN-MPs å studere PMN-funksjonen i sårheling

  1. I vivo administrasjonen PMN-MPS å colonic sår
    1. Bedøve mus ved en intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin (100 mg/kg) og xylazine (5 mg/kg). Bekreft anestesi pedal refleks (fast tå knip) og justere etter behov.
    2. Plasser musen på magen sin-28 cm biopsi tang og et endoskop utstyrt med med en høy oppløsning kameraet (som en veterinær endoskop for liten dyr bruk, se Tabellen for materiale), generere 3-5 overfladisk sår langs dorsal side av den kolon. Ved ferdigstillelse av såret, retur mus til en bur plassert på en temperaturkontrollert (37 ° C) mat til utvinnes.
    3. Bedøve mus (som trinn 7.1.1). Bruk et endoskop for å skaffe bilder av påført sår 24 timer (dag 1) etter såret. La mus gjenopprette som i trinn 7.1.2.
    4. På samme tid (24 timer etter såret), administrere murine PMN-MPs fra 2 x 106 PMNs i 100 µL av HBSS + direkte til hver såret området bruker en kolonoskopi-baserte microinjection system (bruk en 29 G nål)9. Tre dager senere (dag 4 etter såret) bedøve mus (som trinn 7.1.1) og bruker et endoskop å hente bilder av healing sår på nytt. La mus gjenopprette som i trinn 7.1.2.
    5. Bruke foretrakk image analyseprogramvare (se Tabell for materiale), disposisjon synlig sår regioner i ervervet bilder, måle området av samme sår på dager 1 og 4 etter såret, og beregning av såret nedleggelse.
  2. Human epithelial celler i vitro sårheling
    1. Antall Caco-2 BBe eller T84, menneskelige tarmen epitelceller av hemocytometer og seed 5 x 105 celler/godt i 24-brønnen plater. Inkuber cellene i en standard inkubasjon kammer på 37 ° C og 5% CO2. Caco-2 BBe eller T84 nå confluency innen 48 timer9. Kultur epitelceller, bruker DMEM og DMEM-F12 (50/50) med kosttilskudd som tidligere beskrevet9.
    2. Generere mekanisk scratch sår i monolayer bruker en pipette tips og lav sug som beskrevet tidligere4,9. Hente bilder av såret umiddelbart etter riper med en invertert kontrast differensial forstyrrelser mikroskopet (bruk 5 X eller 10 X mål), som skal brukes som en tid = 0 referansepunkt.
    3. Legg til MPs (avledet fra 2-4 X 106 PMNs) riper-såret epithelial celle monolayers, og Inkuber en ekstra 24 h (48 timer etter såret, på 37 ° C med 5% CO2). På dette tidspunktet å innhente bilder av scratch-sår.
    4. Bruk foretrukket image analyseprogramvare (se Tabell for materiale) å måle såret områder ved t = 0 og t = 48 h. beregne prosentandelen av såret nedleggelse ved å fastsette forskjellen i såret området valgte punktene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representant flyt cytometric analyse av MPs som ble isolert fra menneskelige og mus PMNs er vist i figur 1. Størrelse heterogenitet PMN-MPS kan vurderes sammenligning til kjente størrelse perler som vist i figur 1A, B for menneskelig MPs. notat, ble ingen betydelige forskjeller i størrelse heterogenitet observert mellom mus og menneskelige MPs. På samme måte kan bruker flowcytometri og fluorescens merking, uttrykk for protein/s for isolert MPs musen eller menneskelige opprinnelse bestemmes. For eksempel uttrykk for Phosphatidyl serine (PhS) kan undersøkes av Annexin V flekker. Murine benmarg PMN-MPs er vist i figur 1C, D. Uttrykk for flere valg kan også vurderes som vist for Annexin V og CD11b flekker av menneskelig MPs, figur 2A, B. En annen metoden å oppdage PMN-MPs av flowcytometri er stain fersk-isolert PMNs før stimulering som vist i figur 2C. For eksempel PMN farging med lipid markøren N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC før fMLF stimulering resulterer i utgivelsen av grønne MPs, som kan være lett oppdaget av flyt. Av notatet, mens farging med N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC har tidligere blitt brukt til å merke og oppdage MPs som ble innhentet fra eksterne menneskeblod10 eller injisert i dyr11, bruk av andre markører for merking formål for i vitro eller vivo programmet bør fastsettes av hver etterforsker. I tillegg til flowcytometri, kan PMN-MPs analyseres av immunoblotting for proteiner av interesse. Som vist i Figur 3, MPs avledet fra menneskelige PMNs som var stimulert med flere kjente aktivator, ble undersøkt for uttrykket av nøkkelen inflammatorisk (matrise metallopeptidase 9 (MMP-9) og myeloperoxidase (MPO)) og anti-inflammatorisk (Annexin A1) molekyler. Tydelig fra representant immunoblots, PMN stimulering med IFNγ (50 ng/mL), PMA (200 nM), og fMLF (1 µM) MPs uttrykke varierende grad av MMP-9. Bare forstyrrelsene i utgangen cytoskeleton av Latrunculin B (1 µM) før stimulering med fMLF (5 µM) førte til rikelig tilstedeværelsen av MPO i PMN-MPs. Tilsvarende ble varierende grad av Annexin A1 (høy til ingen gjenkjenning) oppdaget på MPs etter beskrevet aktivering betingelsene. Disse resultatene tyder på at PMN-MP sammensetning er stimulans-avhengige.

Til slutt, Figur 4 viser hvordan isolert PMN-MPs kan brukes til å studere sår helbredelse i vitro og vivo colonic skade. PMN-MPs kan legges til bunnen-såret epithelial monolayers i kulturer, hvor healing kan overvåkes av imaging kjøp på bestemt tidspunkt. MPs kan videre bli microinjected direkte i colonic sår, som ble generert av biopsi tang og endoskopisk tenkelig9, og deres effekt på helbredelse kan vurderes. For både i vitro og i vivo analyse av sårheling, bilder av påført sår er ervervet umiddelbart innlegg såret (eller annet som angitt) og kontinuerlig gjennom helbredelsesprosessen på bestemt tidspunkt. Bruke kommersielt tilgjengelige analyseprogramvare, endringer i såret området (størrelse) måles og brukes til å bestemme såret nedleggelse hastigheten. Anvendelse av PMN-MPs som inneholder MPO enten kultivert epitelial monolayers eller i vivo colonic sår har skadevirkninger, fører til forsinket helbredende9.

Figure 1
Figur 1 . Analyse av PMN-MP størrelse og overflate markører av flowcytometri. (A) Flow cytometer optimalisert kontroll perler (se Tabell for materiale) av kjente størrelser og scatter vises i SSC og FSC ortogonale representasjon. Perlene brukes til å få en relativ størrelse sammenligning med et PMN-MP eksempel vist i B. (B) Human PMN-MPs ble isolert og analysert av flowcytometri betingelser på perlene. Heterogenitet i MP størrelser kan sees. (C-D) MPs fra fMLF-stimulert murine benmarg PMNs ble analysert av flowcytometri. Representant flytdiagrammer Vis unstained kvinne (C) eller Annexin V-FITC-farget (D) MPs. rektangulære området viser Annexin V-positive MPs (FITC-positive MPs). SSC: Side Scatter; FSC: Fremover Scatter; PhS: Phosphatidyl serine. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . PMN-MP flekker og analyse av flowcytometri. (A) Unstained og (B) Annexin V-FITC - og hCD11b-APC-farget MPs. Square omslutter en Annexin V/CD11b dobbel positiv befolkning på PMN-MPs. (C) ferske isolert menneskelig PMNs (1 x 106) var farget med en fluorescerende farge , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC og stimuleres med fMLF. MPs ble isolert fra cellen supernatants og analysert av flowcytometri. Rektangulært område omslutter en N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC positive MP befolkning (M-FITC, y-akseetikett). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Sammensetningen av PMN-MPs er avhengig av stimulans. (A) Human PMNs ble stimulert med enten IFNγ, TNFα, fMLF, PMA, eller en kombinasjon av latranculin B etterfulgt av fMLF (LtB-fMLF). MPs ble isolert fra de resulterende celle supernatants av ultracentrifugation og protein lysates ble utarbeidet i 1% SDS buffer. Proteiner var atskilt med størrelsen electrophoretically i en 10% polyakrylamid gel, overført til en nitrocellulose membran og analysert for enten en MMP-9, MPO eller Annexin A1 primære antistoff etterfulgt av de aktuelle HRP-konjugerte sekundære antistoffene. (B) representant elektronmikroskop bilder av menneskelige PMN-MPs skildre størrelse heterogenitet. En exosome < 100 nm i størrelse angis av den hvite pil. Skala bar = 250 nm (venstre og høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Bruk av isolerte PMN-MPs i å studere rollen PMNs i epithelial sårtilheling. (A) Caco-2 BBe menneskelige tarmen epitelceller var belagt confluency, scratch-såret og utsettes for MPs fra 3 millioner PMNs, disse ble umiddelbart etter såret. Representant bilder viser såret nedleggelse (48 timer etter såret) i kontrollen (venstre panel) og PMN-MP-behandlet epitelceller (høyre panel). Skala bar = 100 µm. (B) å undersøke effekten av PMN-MPs på colonic sår helbredelse i vivo, isolerte PMN-MPs ble injisert direkte inn i såret området bruker en endoskopi-baserte microinjection system (24 timer etter såret, colonic såret er beskrevet av en stiplet linje og injeksjon vises p området av en hvit pil). Såret nedleggelse var vurdert 3 dager senere (4 dager etter såret) endoskopisk bildebehandling. Skala bar = 300 µm. (C) 4 dager etter såret mus var euthanized og colonic mucosal sår ble hentet med saks, innebygd i optimal kutte temperatur (O.C.T) sammensatte og frosset med flytende nitrogen. Åtte mikrometer deler av sår var farget for E-cadherin (grønn) og kjernefysiske flekken DAPI (blå) for å vurdere re epithelialization (øvre panel) eller DAPI (blå) og Ki67 (rød) å visualisere total og voksende epitelceller på såret kanten (nedre panel). Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokoller for isolering og karakterisering av PMN-avledet MPs er beskrevet i denne kommunikasjonen. Flere viktige kritiske punkter må tas i betraktning for suksessen til prosedyren. PMNs må først isolert frisk og brukes i eksperimenter innen 2 t isolasjon for å hindre spontan aktivisering og omfatter degranulering. Alle håndtering av PMNs under isolasjon og opp til punktet av stimulering må utføres på is for å hindre aktivering og tidlig MP utgivelsen12. Andre, ultracentrifugation 1 h eller mer maksimerer pelleting av MPs. tredje, for analyse av flowcytometri, apparatet må være riktig kalibrert med en blanding av instrumentet angitt fluorescerende perler (hvilken perler justeres til en bestemt instrument) riktig definere MP størrelser. For eksempel, mens produsent av flyt cytometers anbefaler bruk av FSC perler som størrelse-relaterte parameter, er andre optimalisert for SSC perler. I tillegg må flyt cytometer som skal brukes for MP analyse være utstyrt med oppgradert elektronikk beste løse MPs fra bakgrunnsstøyen.

Hvis du vil identifisere MPs i tillegg størrelse parametere, anbefales bruk av fluorescens flekker som beskrevet i prosedyren ovenfor. Videre, alle løsninger under forberedelse og isolasjon skal filtreres gjennom en 0,1 µm filtersystem å minimere inkludering av støvpartikler eller andre precipitates som vil øke bakgrunnsstøy under oppkjøpet av flowcytometri. Viktigere, bør lagringsforhold MPS vurderes. Lite bevis8og vår egen upubliserte observasjoner, foreslår at MP frysing fører til membran brudd og MP brekkasje. Endelig kan varierende PMN aktivisering forhold og timing endre og forbedre MP avkastning.

Det er noen begrensninger i denne metoden. Isolering av musen PMNs fra benmargen er vanligvis ikke ren (~ 85-90%) og er forurenset av andre immunceller (hovedsakelig mononukleære lymfocytter) som ble fastsatt flyt cytometric analyse. Dermed kan resulterende isolert inneholde små mengder MPs utgitt av andre immunceller. Alternativer er tilgjengelige, og inkluderer isolering av PMNs av kommersielt tilgjengelig magnetiske perler, men dette ville være en lengre og en betydelig dyrere prosedyre. Til slutt, uten fluorescens merking, i tillegg til størrelse parametere, definitiv differensiering av MPs fra støv eller andre løselig eller luftbårne partikler av lignende størrelser som kan forurense prøven er utfordrende og utsatt for feil.

I fremtiden, vil sortering PMN-MPS merket med spesifikke indikatorer hjelpe belyse MP komposisjon under bestemte stimulerende betingelser eller modeller av sykdom, og forhåpentligvis vil tillate bruk av MPs diagnostiske markører og potensielle terapeutiske mål å behandle inflammatoriske sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har noen interessekonflikt av noe slag knyttet til denne kommunikasjonen

Acknowledgments

Vi er takknemlige for teknisk assistanse av Dr. Suchitra Swaminathan som driver nordvest Feinberg skolen av medisin Flow cytometri kjernen. Midler ble gitt av (NIH) DK101675.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) Atlanta Biologics S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140
0.5 M EDTA Fisher BP2482
Sodium chloride Sigma S9888 Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof) Decon labs 2701
HBBS Corning 21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4% Sigma T8154 SIGMA Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane Abbot 50033
Anti-human CD11b-APC conjugated Biolegend 301350 Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL Invitrogen B10250 N-(2-aminoethyl) maleimide 
Annexin V Binding Buffer Biolegend 422201
Calibration Beads for Flow Cytometry BioCytex 7803
FITC Annexin V Biolegend 640906
Polymorphprep Axis-Shield PoC AS Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes Corning 430053
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B
Pasteur pipettes  BD Falcon 357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122
100 µm cell strainers Celltreat 229485
Vacutainer tubes BD 367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) BD (SORP)
Swinging bucket centrifuge ThermoFisher Scientific 75007210
Ultracentrifuge Beckman (L8-80 M)
Micro-centrifuge ThermoFisher Scientific  VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge ThermoFisher Scientific  75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm Storz 27071zj
Software
Image J National Institute of Health Open source 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
  2. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
  3. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  4. Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
  5. Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
  6. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
  7. Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
  8. Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
  9. Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
  10. Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
  11. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
  12. Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).

Tags

Immunologi problemet 133 nøytrofile microparticles microvesicles sårheling flowcytometri ultracentrifugation
Isolering og karakterisering av nøytrofile-avledet Microparticles for funksjonell studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finkielsztein, A., Mascarenhas, L.,… More

Finkielsztein, A., Mascarenhas, L., Butin-Israeli, V., Sumagin, R. Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e56949, doi:10.3791/56949 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter