Summary
Aquí se describen nuevos protocolos para aislar y caracterizar micropartículas derivadas de humano y ratón neutrófilos. Estos protocolos utilizan técnicas immunoblotting para analizar contenido de micropartículas, ultracentrifugación y citometría de flujo, y pueden ser utilizados para estudiar el papel de micropartículas derivadas de diversos tipos celulares en función de las células.
Abstract
Micropartículas de derivados de neutrófilos polimorfonucleares (PMN)-MPs) son bicapa lipídica, microvesículas esféricas con tamaños que van desde 50-1.000 nm de diámetro. MPs son una nueva evolución, parte importante de comunicación célula a célula y la maquinaria de señalización. Debido a su tamaño y la naturaleza de su liberación, hasta hace poco existencia de MP fue pasado por alto. Sin embargo, con la mejor tecnología y métodos analíticos su función en la salud y la enfermedad ahora está emergiendo. Los protocolos aquí presentados están dirigidos a aislar y caracterizar PMN-MPs por immunoblotting y citometría de flujo. Por otra parte, se dan varios ejemplos de aplicación. Estos protocolos para el aislamiento de MP son rápidos y de bajo costo y no requieren el uso de equipos costosos. Además, permiten el etiquetado de diputados tras aislamiento, así como el etiquetado de células de origen antes de la liberación de MP, con un colorante fluorescente de membrana específicos para visualización y análisis por citometría de flujo. Estos métodos, sin embargo, tienen varias limitaciones, incluyendo la pureza de PMNs y parlamentarios y la necesidad de instrumentación analítica sofisticada. Un citómetro de flujo gama alta es necesario para analizar MPs y minimizar falsos positivo Lee debido a ruido o auto fluorescencia fiable. Los protocolos descritos pueden utilizarse para aislar y definir la biogénesis MP y caracterizan a sus marcadores y variación en la composición en diferentes condiciones de estimulación. Heterogeneidad de tamaño puede ser explotado para investigar si el contenido de partículas de membrana versus exosomas es diferente, y si cumplen diferentes funciones en la homeostasis del tejido. Por último, pueden explorarse la siguientes aislamiento y caracterización de MPs, su función en respuestas celulares y varios modelos de enfermedad (incluyendo, trastornos inflamatorios asociados de PMN, como enfermedades inflamatorias del intestino o la lesión pulmonar aguda).
Introduction
Recientemente, se han convertido en de gran interés científico, "micropartículas/microvesículas" origina en el citosol celular o membrana plasmática como datos emergentes sugieren que estas estructuras, que van desde 50-1.000 nm de diámetro, pueden llevar información biológica y servir como un método no-canónico de la comunicación celular. Inmune celula derivados de MPs y particularmente los producidos por los neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) son de gran interés dado el importante papel de PMNs en host defense1,2,3de las respuestas inflamatorias y cicatrización 4. sorprendentemente, hasta ahora, numerosos informes han demostrado funciones pro inflamatorias y antiinflamatorias de PMN-MPs5, sugiriendo un potencial contexto, enfermedad, especies-y papel de órgano-específica de MPs.
Los protocolos descritos en esta comunicación proporcionan un método rentable, innovadora y adaptable para estudiar la función del MPs en salud y enfermedad. Son aplicables a muchos organismos modelo, órganos y las condiciones de estimulación. Permiten la identificación de varios tipos de MPs y puede utilizarse en el futuro para atender sus funciones pro inflamatorias y antiinflamatorias. Por ejemplo, describe cómo estudiar la función de PMN-MPs en epitelial de la herida curativa en vitro y en vivo. El protocolo presentado para el aislamiento de ratón PMNs de médula ósea fue adaptado con modificaciones de un método previamente descrito6.
Además, protocolos descritos en este estudio permiten la detección y caracterización de marcadores específicos que se pueden encontrar en PMN-MPs por dos métodos complementarios: Western blot y citometría de flujo. Encontramos que el immunoblotting de MPs mediante protocolos estándar5 es fácil y confiable, sin embargo, recientes avances en la sensibilidad de los instrumentos de la citometría de flujo y mejor relación señal de ruido ahora permiten más análisis de MPs usando este método. Los protocolos descritos en este estudio incorporan avances recientes y las recomendaciones de artículos originales de investigación, incluyendo modificaciones en la velocidad de centrifugación y tiempo, la adición de muestra de filtrado y almacenamiento de congelación condiciones7 , 8y cómo reducir el "ruido de fondo", mejorar el límite de detección de PMN-MPs y discriminar entre diferentes tamaños de MPs.
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Protocol
Todos los trabajos de animales fue aprobado por el IACUC noroeste. Todos los experimentos fueron terminados en conformidad y cumplimiento con todas las directrices pertinentes del reguladoras e institucionales. Para donar sangre los sujetos humanos, consentimiento informado fue presentado y firmado; Además, todos los seres humanos en este estudio fueron tratados con arreglo a las directrices institucionales y federales para el bienestar humano.
Nota: Los pasos del Protocolo se enumeran en los apartados siguientes: (i) aislamiento de células de la médula ósea de ratón; (ii) aislamiento de PMN de la médula ósea murina; (iii) aislamiento de PMN de la sangre humana; (iv) MP aislamiento de PMN sobrenadantes (por ultracentrifugación); v caracterización de MPs por Western Blotting; (vi) caracterización de MPs por citometría de flujo; (viii) aplicación de diputados aislados a estudio de la herida curativo
1. aislamiento de células de médula ósea de ratón
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Disección del fémur y la tibia de las patas traseras del ratón
- Preparar una caja de eutanasia (p. ej., una caja de punta de vacío 1 mL) para la inhalación de la anestesia. Añadir unas gotas de 100% de isoflurano en un paño estéril con cinta en el interior de la tapa de una caja de plástico. Según las nuevas directrices IACUC, animales no debe venir en contacto directo con isoflurano, así lugar un sostenedor de la extremidad entre el ratón y la gasa con el isoflurano.
Nota: Isoflurano es un anestésico por inhalación de gran alcance y debe ser manejado con prudencia dentro de una campana de humos. - Eutanasia a ratones según recomendación de IACUC. Coloca un ratón dentro de la caja de la eutanasia que se describe en el paso 1.1.1 para 1 – 5 min hasta que ha dejado de respirar. Asegúrese de que la muerte del animal mediante la realización de una luxación cervical.
- Levantar la piel abdominal usando el acero inoxidable, 12 cm, curvada, pinzas de 0,17 mm X 0,1 mm y cortar la piel a medio camino entre las extremidades superiores e inferiores. Pelar la piel de aquí a la sección más distal del cuerpo del ratón, incluyendo las extremidades inferiores. Con 10 cm de largo, tijeras de disección recta, quitar los músculos de las piernas traseras y dislocar la articulación de la cadera dejando intacta la cabeza del fémur.
- Utilice tijeras para disecar los músculos del fémur y la tibia y separar el fémur a la tibia. Asegúrese de que los extremos de los huesos permanecen intactos, ya que contienen cantidades significativas de médula ósea.
- Quitar toda la carne restante haciendo rodar los huesos dentro de una toalla de papel. Coloque los huesos limpios en un plato Petri conteniendo medio sin suero (MFS, es decir, medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) sin suero ni antibióticos).
- Lave los huesos en etanol al 70% y luego en SFM.
- Preparar 50 mL de la OFS en un tubo cónico de 50 mL. Carga 10 mL de la OFS en una jeringa de 10 mL y fíjelo a una aguja de calibre 25 y 5/8 de pulgada.
- Corte el extremo de los huesos con tijeras hasta que aparezca una abertura a la médula ósea (color rojizo).
- Enjuague las células de médula ósea en un nuevo tubo de 50 mL. Utilice una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 26 y 5/8 de pulgada con aproximadamente 3 mL, hueso de la OFS. Terminado el lavado, suspender las células en el tubo mediante pipeteo (puntas de plástico desechables 1 mL uso) para romper los agregados de la célula.
- Preparar una caja de eutanasia (p. ej., una caja de punta de vacío 1 mL) para la inhalación de la anestesia. Añadir unas gotas de 100% de isoflurano en un paño estéril con cinta en el interior de la tapa de una caja de plástico. Según las nuevas directrices IACUC, animales no debe venir en contacto directo con isoflurano, así lugar un sostenedor de la extremidad entre el ratón y la gasa con el isoflurano.
2. PMN aislamiento de médula ósea murina
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Lisis de eritrocitos
- De la pelotilla de la médula ósea recogida por centrifugación a 350 x g por 8 min a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado de células en 20 mL de 0.2% NaCl para aproximadamente 20-30 s para lisar la fracción de eritrocitos. No exceder 30 s ya que esto dará lugar a la lisis de los PMN. Añadir 20 mL de 1.6% NaCl para restaurar la osmolalidad.
Nota: Este paso puede llevar a muy poca activación de PMN. - Lavar las células con 2 mL de PBS y centrifugue como en el paso 2.1.1 anterior. Eliminar el sobrenadante.
- Proceder a PMNs aíslan por centrifugación de gradiente de densidad.
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Aislamiento de los neutrófilos por centrifugación de gradiente de densidad
- Caliente polysucrose y sodio Diatrizoato soluciones, con densidades de 1,119 g/mL y 1,077 g/mL (véase Tabla de materiales), a temperatura ambiente (RT) antes de su uso.
- Preparar polysucrose y sodio Diatrizoato gradientes frescos, inmediatamente antes de la aplicación de células de médula ósea por capas lentamente 3 mL de la solución de densidad de 1,077 g/mL más 3 mL de la solución de densidad de 1,119 g/mL en tubos cónicos de 15 mL.
Nota: Preparación de la solución gradiente demasiado adelantado resultará en la mezcla de las capas y pobre pureza neutrófilo y recuperación. - Resuspender el precipitado de células de médula ósea en 1 mL de PBS helado y recubrimiento la suspensión resultante encima de la polysucrose y sodio Diatrizoato gradiente (lentamente, para evitar la mezcla de las capas).
- Centrifugar por 30 min a x 850 g a 25 ° C a temperatura ambiente, sin freno. Mantener los reactivos a temperatura ambiente para la separación eficaz de los neutrófilos de otras células presentes en la médula ósea. Establecer la centrifugadora en deceleración lenta para permitir que el degradado eficientemente ser formado y mantenido después del paso de centrifugación.
- Localizar visualmente una capa de células mononucleares en el interfaz de PBS y 1,077 g/mL densidad solución (capa superior). Retirar esta capa y el resto de la solución de densidad sin molestar a la banda PMN.
- Recoger una capa entera de PMN y algunos de los polysucrose subyacente y sodio Diatrizoato 1,119 g/mL de solución en tubos de 15 mL con una pipeta de transferencia.
Nota: La pureza de los PMNs aislados dependerá en un retiro completo de la capa superior. - Cubra los tubos con filtrado PBS (filtrado a través de un filtro de tamaño de poro de 0.1 μm) y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
- Lave los alimentos peletizados PMNs con 2 mL de PBS, usando condiciones de centrifugación como en el paso 2.2.7.
- Resuspender en 1 mL de PBS filtrada y contar los PMNs aislados por hemocitómetro.
Nota: Para este método de aislamiento, la pureza PMN resultante asciende a ~ 85-90%, según se evaluó por citometría de flujo. Los restantes contaminantes fracciones consisten principalmente de linfocitos mononucleares.
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Estimulación de PMN al inducir liberación de MP
Nota: PMNs pueden ser estimuladas para liberar MPs con diversas condiciones de activación, incluyendo N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF) y forbol 12-miristato-13-acetato (PMA), interferón gamma (IFNγ). Lo importante, antes de la simulación, PMNs deben mantenerse en hielo en todo momento.- PMNs de pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) y resuspender en 0.1 μm filtran sal balanceada (HBSS) solución de Hank, que contiene al agente estimulante de elección. Para la estimulación óptima, utilizar solución de estimulación de 100 μl por PMNs 10 millones para 20-30 min a 37 ° C en tubos de 15 mL.
Nota: Las siguientes concentraciones de activadores se utilizaron con éxito en nuestro trabajo anterior: fMLF (0.5-1 μm 2-5 μm de PMNs de ratón y humanos), PMA (200 nM) y el IFNγ (100 ng/mL). Si se desea la liberación de diputados previamente etiquetados, incubar PMNs sin estimular (1-5 x 106) con N-(2-aminoethyl) maleimida-FITC (véase Tabla de materiales) (1 μm 100 μl HBSS, 15 min, 37 º C). Proceder con pasos 2.3.1-2.3.3. - Desactivación a 850 x g durante 5 min a 4 ° C, quitar PMNs y transferir sobrenadantes libres de células a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Para el aislamiento de MP de sobrenadantes libres de células, continúe con el paso 4.2.
- PMNs de pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) y resuspender en 0.1 μm filtran sal balanceada (HBSS) solución de Hank, que contiene al agente estimulante de elección. Para la estimulación óptima, utilizar solución de estimulación de 100 μl por PMNs 10 millones para 20-30 min a 37 ° C en tubos de 15 mL.
3. aislamiento PMN de sangre humana
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Reclutar a voluntarios sanos para la extracción de sangre según las pautas de la IRB institucional.
- Recoger la sangre del antebrazo de un voluntario sano en tubos que contenían citrato de sodio 5 mL disponibles comercialmente (véase Tabla de materiales).
- Pipetear 5 mL de solución de dextrano y sodio Diatrizoato (densidad de 1,113 g/mL, ver Tabla de materiales) en tubos de 15 mL estéril y poco a poco la capa 5 mL de sangre periférica humana recién aislada en la parte superior.
- Centrifugar los tubos durante 50 min a 400 x g a temperatura ambiente (25 ° C) con una aceleración baja y sin freno.
- Al final de la centrifugación, eliminar el plasma y las células mononucleares (capa superior) con una pipeta de succión de plástico estéril.
- Transferir la capa inferior (PMNs) en un nuevo tubo cónico estéril 50 mL.
- Añadir un volumen igual de 0,45% NaCl a PMNs (mezclar bien y suavemente girando el tubo).
- Centrifugar 10 min a 400 x g a 25 ° C.
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Lisis de eritrocitos
- Añadir 10 mL de agua helada y estéril a las células de alimentos peletizadas para 45 s seguido de 10 mL de helado estéril 1,8% NaCl para restaurar la osmolalidad.
Nota: Los siguientes pasos para el aislamiento de PMN deben realizarse en hielo para evitar la activación de PMN y liberación prematura de MP. El paso de lisis se produce activación de PMN menor aunque no significativa, sin embargo, es esencial para aislar una población de PMN pura para ensayos funcionales. - Centrifugar las células durante 10 min a 250 x g a 4 ° C con la suave desaceleración.
- Repita los pasos 3.2.1 y 3.2.2.
- Resuspender PMNs en 5 mL de helado HBSS sin calcio ni magnesio. Cuenta total células vivas (utilizar un hemocitómetro y viabilidad de tinción en dilución 1:2, véase Tabla de materiales) antes de la estimulación.
Nota: PMNs aislados deben usarse para estimulación u otros experimentos dentro de 2 h de aislamiento para evitar cambios funcionales y celulares y muerte celular.
- Añadir 10 mL de agua helada y estéril a las células de alimentos peletizadas para 45 s seguido de 10 mL de helado estéril 1,8% NaCl para restaurar la osmolalidad.
4. MP aislamiento de PMN activados sobrenadantes
Nota: Un protocolo similar se utiliza para el aislamiento de MPs de PMNs humanos y murinos.
- PMNs de pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) y resuspender en 0.1 μm filtraron solución HBSS, que contiene el agente estimulante de elección (por ejemplo 1 μm fMLF, ver Nota: 2.3.1). Para la óptima estimulación use solución de estimulación de 100 μl por PMNs 10 millones para 20-30 min a 37 ° C en tubos de 15 mL.
- Después del estímulo, girar por PMN activado a 600 x g durante 5 min a 4 ° C y transferir sobrenadantes libres de células a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Centrifugar el sobrenadante despejó de PMN en 13.000 x g, 10 min, 4 ° C para eliminar restos celulares y transferir el sobrenadante despejado en un nuevo tubo de ultracentrífuga.
- Centrifugar por 1 h a 100.000 x g, a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante antes de su almacenamiento de MP. Según sea necesario, tienda peleteado MPs en parafina sellado tubos ultracentrífuga a-80 ° C hasta su uso en experimentos.
5. examen de PMN-MPs por Western Blot
- Añadir el tampón de SDS 1% (50-200 μL con 100 mM de Tris de pH: 7.4) a diputados de la pelotilla (del paso 4.4), transferencia a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y hervir los diputados sometidas a lisis por 5 min.
Nota: El número de diputados y el volumen de buffer de lisis debe ser ajustado y optimizado para cada proteína de interés. -
Cantidades iguales de PMN-MPs por carril en la carga de búfer que contiene β-mercapto-etanol al 10% de la carga.
Nota: Con nuestro método cargamos MPs que fueron aisladas del mismo número de PMNs estimulados.- Separar los lisados por SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% (usar 50-100 V por 1-1.5 h) y la transferencia de proteínas totales sobre membranas de nitrocelulosa como descrito9.
- Bloque de membranas de 1 h con leche descremada de 5% en solución salina tamponada con Tris de Tween 20 0,05% e incubar con un primario adecuado (durante la noche a 4 ° C), seguido de secundarios anticuerpos conjugado con HRP.
- Visualizar las bandas agregando solución de quimioluminescencia de la membrana y la exposición a una película de rayos x dentro de una cinta resistente a la luz (1-24 h).
6. examen de PMN-MPs por citometría de flujo
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Para la tinción de anticuerpo, diluido anticuerpos apropiadamente en tampón FACS (PBS con 0,1 mM de EDTA, 0.1% de azida sódica). Resuspender peleteado PMN-MPs (derivado de 1-3 x 106 PMNs/condición) en la solución de anticuerpo de 100 μl.
- Si la coloración de anexina V, resuspender pildoradas PMN-MPs en tampón de anexina V, que contiene 5 μl de conjugado FITC anexina V. Si Co coloración con los anticuerpos, agregar los anticuerpos deseados (para un ejemplo véase Tabla de materiales) directamente a la solución de anexina V. Agregar colorante de lípidos fluorescentes, N-(2-aminoethyl) maleimida (véase Tabla de materiales), en concentración de 1 μm en 100 μl de tampón FACS para etiquetar e identificar los MPs.
- Incubar el MPs en la coloración de la solución por al menos 20 min a 4 ° C.
- Lavar el MPs por ultracentrifugación (1 h a 100.000 x g, a 4 ° C); Deseche el sobrenadante.
- Resuspender en tampón FACS y ejecutar los ejemplos en un citómetro de flujo designado equipado con una unidad electrónica mejorada para una mayor sensibilidad (véase Tabla de materiales).
7. aplicaciones para PMN aislados-MPs estudiar la función PMN en la cicatrización de heridas
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In vivo la administración de PMN-MPs a las heridas de colon
- Anestesiar ratones por una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg). Anestesia para confirmar reflejo pedal (pellizco firme del dedo del pie) y ajustar según sea necesario.
- Coloque el ratón sobre su estómago y usando fórceps de la biopsia de 28 cm y un endoscopio equipado con una cámara de alta resolución (como un endoscopio veterinario para uso animal pequeño, véase Tabla de materiales), generan heridas superficiales 3-5 en la parte dorsal de la colon. Al terminar de herir, ratones vuelta a una jaula colocan en un tapete de control de temperatura (37 ° C) hasta que se recuperó.
- Anestesiar ratones (como en el paso 7.1.1). Utilizar un endoscopio para adquirir imágenes de heridas infligidas a 24 h (día 1) poste-herir. Que ratones recuperar como en el paso 7.1.2.
- Al mismo tiempo (24 h después herir), administrar murinos PMN-MPs derivadas de 2 x 106 PMNs en 100 μl de HBSS + directamente en cada sitio de la herida mediante una microinyección basada en colonoscopia sistema (uso una aguja 29 G)9. Tres días más tarde (día 4 posterior hiriendo) anestesiar ratones (como en el paso 7.1.1) y utiliza un endoscopio para adquirir imágenes de curación de heridas. Que ratones recuperar como en el paso 7.1.2.
- Utilizando el software de análisis de imagen recomendado: (véase Tabla de materiales), regiones de contorno visible herida en imágenes adquiridas, medir el área de la misma herida en los días 1 y 4 la herida y calcular el porcentaje de cierre de la herida.
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Las células de epiteliales humanos en vitro la cicatrización de heridas
- Cuenta de Caco-2 BBe o T84, células epiteliales intestinales humanas por hemocitómetro y semillas 5 x 105 células/pozo en placas de 24 pocillos cultura. Incubar las células en una cámara estándar de incubación a 37 ° C y 5% CO2. Caco-2 BBe o T84 alcanzan confluencia dentro de 48 h9. A las células epiteliales de la cultura, DMEM y DMEM-F12 (50: 50) con los suplementos anteriormente descrito9.
- Generar heridas de rasguño mecánicas en la monocapa utilizando una pipeta y baja succión como describió anteriormente4,9. Adquisición de imágenes de las áreas de la herida inmediatamente después de rasguño usando un microscopio de interferencia diferencial de contraste de fase invertida (objetivos de uso 5 X o 10 X), para ser utilizado como un tiempo = punto de referencia 0.
- Añadir MPs (derivados de 2-4 X 106 PMNs) a monocapas de células epiteliales rasguñado herido e incubar durante un adicional 24 h (48 h después hiriendo, a 37 ° C con 5% CO2). En este momento volver a adquirir imágenes de las heridas de rasguño.
- Utilizar software de análisis de imagen recomendado: (véase Tabla de materiales) para medir áreas de la herida en t = 0 y t = 48 h. calcular el porcentaje de cierre de la herida mediante la determinación de la diferencia en el área de la herida en los puntos de tiempo seleccionado.
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Representative Results
El análisis cytometric del flujo representativo de parlamentarios que fueron aislados de humano y ratón PMNs se muestran en la figura 1. La heterogeneidad de tamaño de PMN-MPs puede evaluarse en comparación a granos tamaño conocidos como se muestra en la figura 1A, B humana MPs. Nota, no observaron diferencias significativas en la heterogeneidad de tamaño fueron entre ratón y humanos MPs. De manera similar, usando citometría de flujo y de la fluorescencia de etiquetado, expresión de la proteína/s de elección de diputados aislados de ratón o de origen humano se puede determinar. Por ejemplo, expresión de la fosfatidil serina (PhS) puede ser examinada por la anexina V coloración. Médula ósea murina PMN-MPs se muestran en la figura 1C, D. Expresión de varios marcadores de elección también puede ser evaluada como se muestra para anexina V y CD11b tinción de MPs humanas, figura 2A, B. Otro método para detectar MPs PMN por citometría de flujo es manchar PMNs recién aislado antes de la estimulación, como se muestra en la figura 2C. Por ejemplo, PMN tinción con marcador lipídico N-(2-aminoethyl) maleimida-FITC antes fMLF resultados de estimulación en la liberación de los diputados verdes, puede ser detectado fácilmente por el flujo. De nota, mientras que la tinción con N-(2-aminoethyl) maleimida-FITC ya utilizados con anterioridad para marcar y detectar MPs que fueron obtenidas de sangre periférica humana10 o inyectados en animales11, el uso de otros marcadores de etiquetado con fines de en vitro o en vivo debe ser determinado por cada investigador. Además de citometría de flujo, PMN-MPs pueden analizarse por inmunotransferencia de proteínas de interés. Como se muestra en la figura 3, MPs derivados de PMNs humanos que fueron estimuladas con varios activadores conocidos, fueron examinados para la expresión de clave inflamatoria (curación de matriz 9 (MMP-9) y mieloperoxidasa (MPO)) y antiinflamatorio (anexina A1) moléculas. Como evidente de immunoblots representante, estimulación de PMN con IFNγ (50 ng/mL), PMA (200 nM), y diputados expresando diferentes niveles de MMP-9 fMLF (1 μm). Sin embargo, sólo perturbación del citoesqueleto de actina por antes (1 μm) Latrunculin B estimulación con fMLF (5 μm) condujo a la abundante presencia de MPO en PMN-MPs. Del mismo modo, diferentes niveles de anexina A1 (alto sin detección) fueron detectados en MPs siguiendo las condiciones de activación descritas. Estos resultados sugieren que la composición de PMN-MP es dependiente del estímulo.
Finalmente, figura 4 muestra cómo PMN aislados-MPs pueden ser usados para estudiar la herida curación in vitro e in vivo en lesión colónica. PMN-MPs pueden agregarse a monocapas epiteliales heridas de rasguño en las culturas, donde cura puede ser monitoreada por adquisición en momentos predeterminados de la proyección de imagen. MPs puede ser microinyectado más directamente en las heridas de colon, que se generaron por fórceps de la biopsia y la proyección de imagen endoscópica9, y evaluar su efecto sobre la cicatrización. Para el análisis tanto in vitro como in vivo de la cicatrización, se adquieren imágenes de heridas infligidas inmediatamente post herida (o no conforme) y continuamente mediante el proceso de curación en el tiempo determinado de puntos. Usando software de análisis de imagen disponibles en el mercado, cambios en el área de la herida (tamaño) se miden y se utiliza para determinar la tasa de cierre de la herida. Aplicación de PMN-MPs que contienen MPO ya sea cultivadas monocapas epiteliales o en vivo a las heridas de colon tiene efectos perjudiciales, conduce a la cicatrización tardía9.
Figura 1 . Análisis de tamaño de PMN-MP y marcadores de superficie por citometría de flujo. (A) citómetro de flujo optimizado cuentas de control (véase Tabla de materiales) de tamaños conocidos y dispersión valores se muestran en la representación ortogonal de SSC y el FSC. Los granos se utilizan para obtener una comparación del tamaño relativo con una muestra de PMN-MP se muestra en la B. (B) humanas PMN-MPs fueron aislados y analizados por citometría de flujo con las condiciones descritas para los granos. Se aprecia la heterogeneidad de tamaños de MP. (C–D) Diputados derivadas de PMNs estimulados fMLF murine de la médula fueron analizadas por citometría de flujo. Representación de diagramas de flujo muestran sin manchas (C) o anexina V-FITC manchado (D) MPs. área Rectangular muestra MPs de anexina V-positiva (FITC-positivo MPs). SSC: Dispersión de lado; FSC: Forward Scatter; PhS: Fosfatidilserina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . PMN-MP tinción y análisis por citometría de flujo. Área de Unstained (A) y (B) anexina V-FITC y hCD11b-APC-teñido MPs. Plaza encierra una población positiva doble de anexina V/CD11b de PMN-MPs. (C) recién aislado humanos PMNs (1 x 106) fueron teñidas con un colorante fluorescente , N-(2-aminoethyl) maleimida-FITC y estimulado con fMLF. MPs se aislaron de sobrenadantes de células y analizan por citometría de flujo. Área rectangular incluye una población positiva de MP N-(2-aminoethyl) maleimida-FITC (M-FITC, etiqueta del eje y). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Composición de PMN-MPs es dependiente del estímulo. PMNs humanos (A) fueron estimuladas con IFNγ, TNFα, fMLF, PMA o una combinación de latranculin B seguido por fMLF (LtB-fMLF). MPs se aislaron de los sobrenadantes de células resultante por ultracentrifugación y lisados de proteína se prepararon en tampon de SDS 1%. Las proteínas fueron separadas por tamaño electroforéticamente en un gel de poliacrilamida al 10% transferidas a una membrana de nitrocelulosa y sondeadas para MMP-9, MPO o Annexin A1 anticuerpo primario seguido por los anticuerpos secundarios HRP-conjugado apropiados. Representante microscopia electrónica (B) imágenes de MPs de PMN humanos muestran heterogeneidad de tamaño. Un exosomas < 100 nm de tamaño está indicado por la flecha blanca. Barra de escala = 250 nm (paneles izquierdos y derecho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El uso de PMN aislados-MPs en estudiar el papel de PMNs en epiteliales cicatrización. BBe de Caco-2 (A) las células epiteliales intestinales humanas fueron plateadas confluency, cero heridos y sometidos a diputados derivadas de PMNs 3 millones, que se sumaron inmediatamente las heridas. Imágenes representativas Mostrar cierre de herida (48 h post-heridas) en el control (paneles de la izquierda) y células epiteliales PMN-MP-tratados (paneles de la derecha). Barra de escala = 100 μm. (B) examinar el efecto de PMN-MPs en colon la herida curativa en vivo, PMN aislados-MPs fueron inyectadas directamente en el área de la herida mediante un sistema de microinyección basada en endoscopia (en 24 h, la herida, la herida de colon es se indica por una línea discontinua y la inyección sitio aguja muestra una flecha blanca). Encierro de la herida fue evaluados 3 días más tarde (4 días la herida) por proyección de imagen endoscópica. Barra de escala = 300 μm. (C) 4 días post-hiriendo a ratones fueron sacrificados y heridas mucosa colónicas obtuvieron con tijeras, incrustadas en el compuesto de corte óptimo temperatura (O.C.T) y congeladas con nitrógeno líquido. Las secciones micrómetro ocho de las heridas fueron manchadas para E-cadherina (verde) y la tinción nuclear DAPI (azul) evaluar el nivel de re-epithelialization (paneles superiores) y DAPI (azul) y Ki67 (rojo) visualizar las células epiteliales proliferantes y total en el borde de la herida (paneles inferiores). Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Protocolos para el aislamiento y caracterización de derivados de PMN MPs se describen en la presente comunicación. Varios puntos críticos claves deben tenerse en cuenta para el éxito del procedimiento. En primer lugar, PMNs deben aislados fresco y utilizadas en experimentos de dentro de 2 h de aislamiento para evitar la degranulación y la activación espontánea. Toda la gestión de PMNs durante el aislamiento y hasta el punto de estimulación se debe realizar en hielo para evitar la activación y prematuro MP release12. En segundo lugar, ultracentrifugación durante 1 h o más maximiza la granulación de MPs. tercero, para el análisis por citometría de flujo, el instrumento debe calibrarse correctamente con una mezcla de perlas fluorescentes especificadas por el instrumento (el tipo de cuentas se ajusta a un determinado instrumento) para definir correctamente los tamaños de MP. Por ejemplo, mientras que un fabricante de citómetros de flujo recomienda el uso de granos de FSC como un parámetro de tamaño, otros han sido optimizados para granos SSC. Además, el citómetro de flujo utilizado para el análisis de MP debe ser equipado con electrónica mejorada para mejor resolver MPs del ruido de fondo.
Para identificar correctamente los diputados además de parámetros de tamaño, se recomienda el uso de la fluorescencia de tinción como se describe en los procedimientos anteriores. Además, todas las soluciones durante la preparación y el aislamiento deben filtrarse a través de un sistema de filtro μm 0.1 para minimizar la inclusión de partículas de polvo o de otros precipitados que aumentarán el ruido de fondo durante la adquisición mediante citometría de flujo. Lo importante, se deben considerar las condiciones de almacenamiento de MPs. Poca evidencia8y nuestras propias observaciones no publicadas, sugieren que MP congelación conduce a la ruptura de la membrana y rotura de MP. Finalmente, diferentes condiciones de activación de PMN y el momento pueden cambiar y mejorar el rendimiento de MP.
Existen algunas limitaciones a este método. Aislamiento de ratón PMNs de médula ósea no suele ser puro (~ 85-90%) y es contaminado por otras células (principalmente mononucleares linfocitos) como fue determinada por análisis cytometric del flujo. Así, los aislados que pueden incluir pequeñas cantidades de diputados liberados por otras células inmunes. Las alternativas están disponibles e incluyen aislamiento de PMN por granos magnéticos disponibles comercialmente, sin embargo, esto sería un más largo y un procedimiento mucho más costoso. Finalmente, sin fluorescencia de etiquetado, además de parámetros de tamaño, diferenciación definitiva de MPs de polvo u otras partículas solubles o aerotransportadas de tamaños similares que puedan contaminar la muestra es difícil y propenso a errores.
En el futuro, clasificación de PMN-MPs con marcadores específicos ayudará a dilucidar la composición MP bajo condiciones de estimulación específicas o modelos de la enfermedad y que permitir el uso de MPs como marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas potenciales para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de interés de cualquier tipo relacionadas con esta comunicación
Acknowledgments
Estamos agradecidos por la asistencia técnica de Dr. Suchitra Swaminathan que dirige el núcleo de Northwestern Feinberg escuela de medicina citometría de flujo. La financiación fue proporcionada por DK101675 (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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