Summary
Nya protokoll beskrivs här för att isolera och karakterisera mikropartiklar som härrör från människa och mus neutrofiler. Dessa protokoll utnyttja ultracentrifugering och flödescytometri immunoblotting tekniker för att analysera microparticle innehåll och de kan användas för att studera rollen av mikropartiklar som härrör från olika celltyper i cellulär funktion.
Abstract
Polymorfonukleära neutrofiler-derived mikropartiklar (PMN)-MPs) är lipid lipidens, sfäriska microvesicles med storlekar från 50-1000 nm i diameter. MPs är en nyligen utvecklas, en viktig del av cell-till-cell kommunikation och signalering maskiner. På grund av deras storlek och arten av deras frigivning, tills nyligen förbisågs MP existens. Dock med förbättrad teknik och analysmetoder deras funktion vid hälsa och sjukdom nu växer fram. De protokoll som presenteras här är att isolera och karakterisera PMN-MPs av flödescytometri och immunoblotting. Dessutom ges flera genomförandet exempel. Dessa protokoll för MP isolering är snabba, Billiga och kräver inte användning av dyra kit. Dessutom möjliggör de märkning av MPs efter isolering, samt före märkning av källcellerna före MP utgåvan, med ett membran-specifika fluorescerande färgämne för visualisering och analys av flödescytometri. Dessa metoder, men har flera begränsningar inklusive renhet PMNs och MPs och behovet av sofistikerade analysinstrument. En high-end flödescytometer behövs för att tillförlitligt analysera MPs och minimera falska positiva läsningar på grund av buller eller auto-fluorescens. Protokoll som beskrivs kan användas för att isolera och definiera MP biogenes och karakterisera deras markörer och variation i sammansättningen under olika stimulerande förhållanden. Storlek heterogenitet kan utnyttjas för att undersöka om innehållet i membran partiklar kontra exosomes är olika, och huruvida de uppfyller olika roller i vävnad homeostas. Slutligen kan följande isolering och karakterisering av MPs, deras funktion i cellulära svar och olika sjukdomsmodeller (inklusive, PMN-associerade inflammatoriska sjukdomar, såsom inflammatoriska tarmsjukdomar eller Akut lungskada) utforskas.
Introduction
Nyligen, ”mikropartiklar/microvesicles” med ursprung från cell cytosol eller plasmamembranet har blivit av stort vetenskapligt intresse, eftersom nya data tyder på att dessa strukturer, alltifrån 50-1000 nm i diameter, kan bära biologisk information och fungera som en icke-kanoniska metod för cellulär kommunikation. Immun cell-derived MPs och särskilt sådana som produceras av polymorfonukleära neutrofiler (PMNs) är av stort intresse med tanke på den viktiga rollen som PMNs i värd försvar1,2, inflammatoriskt svar3och sårläkning 4. spännande, hittills, talrika rapporter har visat både proinflammatoriska och antiinflammatoriska funktioner PMN-MPs5, vilket tyder på en potentiell kontext - sjukdom-, arter- och organ-specifika roll av MPs.
Beskrivna protokollen i detta meddelande ger en kostnadseffektiv, anpassningsbart och innovativ metod för att studera funktionen av MPs i hälsa och sjukdom. De är tillämpliga på många modellorganismer, organ och stimulering villkor. De möjliggör identifiering av flera typer av MPs och kan användas i framtiden att ta itu med deras proinflammatoriska och antiinflammatoriska funktioner. Som exempel beskrivs här är hur man studera funktionen av PMN-MPs i epitelial sår läka in vitro- och in vivo. Det presenteras protokollet för isolering av mus benmärg-derived PMNs anpassades med några ändringar från en tidigare beskrivna metod6.
Dessutom protokoll som beskrivs i denna studie kan för upptäckt och karakterisering av specifika markörer som kan hittas på PMN-MPs av två kompletterande metoder: Western blot och flödescytometri. Vi tycker att immunoblotting av MPs använder standardprotokoll5 är enkelt och pålitligt, dock senaste framsteg i känslighet flöde flödescytometri instrument, och förbättrat buller-till-signal-förhållande nu tillåter, för vidare analys av MPs med denna metod. Protokoll som beskrivs i denna studie införliva senaste framstegen och rekommendationer från ursprungliga forskningsartiklar, inklusive ändringar av centrifugeringsvarvtal och tid, tillägg av prov filtrering och frysning/lagring villkor7 , 8och hur man minska ”bakgrundsljud”, förbättra detektionsgränsen för PMN-MPs och diskriminera mellan olika storlekar av MPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbetet godkändes av den nordvästra IACUC. Alla experiment slutfördes i enlighet och alla relevanta rättsliga och institutionella riktlinjer följs. För människor att donera blod, ett informerat samtycke presenterades och signerad; Dessutom behandlades alla försökspersoner i denna studie i enlighet med de institutionella och federala riktlinjerna för mänsklig välfärd.
Obs: Protokollstegen listas under följande underavsnitt: (i) mus benmärgen Cell isolering; (ii) PMN isolering från murina benmärgen; (iii) PMN isolering från humanblod; (iv) MP isolering från PMN supernatanterna (av ultracentrifugering); (v) karakterisering av MPs av Western Blotting; (vi) karakterisering av MPs av flödescytometri; (viii) tillämpning av isolerade MPs till studien sår läkning
1. mus benmärgen Cell isolering
-
Dissektion av lårben och skenben från mus bakbenen
- Förbereda en dödshjälp låda (t.ex., en tom 1 mL tip box) för inandning av anestesi. Tillsätt några droppar 100% isofluran på en steril duk tejpade på insidan av en plastlåda locket. Enligt nya riktlinjer för IACUC, bör djur inte komma i direkt kontakt med isofluran, således förlägger en tip hållare mellan musen och gasväv som innehåller isofluran.
Obs: Isofluran är en kraftfull inhalational bedövningsmedel och ska hanteras med yttersta försiktighet inuti ett dragskåp. - Euthanize möss enligt IACUC rekommendation. Placera en mus inuti rutan dödshjälp som beskrivs i steg 1.1.1 för 1 – 5 min tills det har upphört att andas. Se till djurets död genom att utföra en cervikal dislokation.
- Lyft magen huden med hjälp av rostfritt stål, 12 cm böjda, 0.17 X 0,1 mm pincett och skära huden halvvägs mellan övre och nedre extremiteter. Peel huden från här till den mest distala delen av mus kroppen inklusive de nedre extremiteterna. Med 10 cm långa, raka dissekera saxen, bort musklerna från bakbenen och rubba höftleden lämnar lårbenet huvudet intakt.
- Använd sax för att dissekera musklerna från lårbenet och skenbenet och separata lårbenet från skenbenet. Kontrollera att ändarna på benen förbli intakt eftersom de innehåller betydande mängder av benmärgen.
- Ta bort alla återstående köttet genom rullande ben inuti en pappershandduk. Placera rena ben i en petriskål innehållande serumfritt Medium (SFM, dvsDulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) utan serum eller antibiotika).
- Skölj benen i 70% etanol och sedan i SFM.
- Förbereda SFM 50 mL i en 50 mL konisk tub. Fyll 10 mL av SFM i en 10 mL-spruta och bifoga det till en 25 och 5/8 tum gauge nål.
- Trimma slutet av ben med sax tills en öppning till benmärgen (rödaktig färg) är synlig.
- Spola benmärgscellerna in i en ny 50 mL tub. Använd en 10 mL spruta med en 26 och 5/8 tum gauge nål med ca 3 mL och ben av SFM. När du är klar spolning resuspendera cellerna i röret genom pipettering (Använd disponibel 1 mL plast tips) för att bryta cell aggregat.
- Förbereda en dödshjälp låda (t.ex., en tom 1 mL tip box) för inandning av anestesi. Tillsätt några droppar 100% isofluran på en steril duk tejpade på insidan av en plastlåda locket. Enligt nya riktlinjer för IACUC, bör djur inte komma i direkt kontakt med isofluran, således förlägger en tip hållare mellan musen och gasväv som innehåller isofluran.
2. PMN isolering från murina benmärg
-
Röd cell lysis
- Pellet insamlade benmärgen genom centrifugering vid 350 x g i 8 min vid 4 ° C.
- Återsuspendera cellpelleten i 20 mL 0,2% NaCl för cirka 20-30 s att lysera erytrocyt fraktionen. Inte överstiger 30 s eftersom detta kommer att resultera i PMN lysis. Tillsätt 20 mL av 1,6% NaCl att återställa osmolalitet.
Obs: Detta steg kan leda till mycket lite PMN aktivering. - Tvätta cellerna med 2 mL PBS och centrifugera som i steg 2.1.1 ovan. Ta bort supernatanten.
- Vidare till isolera PMNs genom täthet lutning centrifugering.
-
Isolering av neutrofiler genom täthet lutning centrifugering
- Varm polysucrose och natrium diatrizoate lösningar, med densiteter 1.119 g/mL och 1.077 g/mL (se Tabell för material) till rumstemperatur (RT) före användning.
- Förbered polysucrose och natrium diatrizoate övertoningar färska, omedelbart före benmärgen cell ansökan genom att långsamt skikta 3 mL av 1.077 g/mL lösning för densitet över 3 mL 1.119 g/mL densitet lösningen i 15 mL koniska rör.
Obs: Beredning av gradient för långt i förväg kommer att resultera i blandning av lager och dålig neutrofila renhet och återhämtning. - Återsuspendera pelleten benmärgen cell i 1 mL iskallt PBS och overlay resulterande cellsuspensionen ovanpå de polysucrose och natrium diatrizoate lutning (långsamt, att undvika att blanda lager).
- Centrifugera i 30 min på 850 x g vid 25 ° C på RT, utan broms. Hålla reagenserna RT för effektiv separation av neutrofilerna från andra celler som finns i benmärgen. Ställ in centrifugen vid långsam retardation för övertoningen effektivt bildas och underhållas efter centrifugeringssteget.
- Visuellt lokalisera en mononukleära cellager på gränssnittet för PBS och 1.077 g/mL densitet lösning (övre skiktet). Ta bort detta lager och resten av densitet lösningen utan att störa PMN bandet.
- Samla ett helt PMN-lager och några av de underliggande polysucrose och natrium diatrizoate 1.119 g/mL lösning i 15 mL rör med överföring pipett.
Obs: Renheten av de isolerade PMNs beror på ett fullständigt avskaffande av det övre lagret. - Topp rören med filtrerade PBS (filtreras genom ett 0.1 µm porstorlek storlek filter) och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta de pelleterat PMNs med 2 mL PBS med centrifugering villkor som i steg 2.2.7.
- Återsuspendera i 1 mL av filtrerade PBS och räkna de isolerade PMNs av hemocytometer.
Obs: Denna isolering metod, den resulterande PMN-renheten uppgår till ~ 85-90%, som bedömdes av flödescytometri. De återstående kontaminerande fraktioner består främst av mononukleära lymfocyter.
-
PMN stimulering att inducera MP release
Obs: PMNs kan stimuleras för att släppa MPs använder olika aktiverande villkor, inklusive N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-isopropylmyristat-13-acetat (PMA) eller Interferon gamma (IFNγ). Viktigt, innan simulering, bör PMNs hållas på isen hela tiden.- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) och återsuspendera i 0.1 µm filtreras Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) lösning, som innehåller det stimulerande medlet av val. För optimal stimulering, använda 100 µL stimulering lösning per 10 miljoner PMNs för 20-30 minuter vid 37 ° C i 15 mL rör.
Obs: Följande koncentrationer av aktivatorer användes framgångsrikt i vårt tidigare arbete: fMLF (0,5-1 µM för mänskliga och 2-5 µM för mus PMNs), PMA (200 nM), och IFNγ (100 ng/mL). Om utgivningen av pre märkt MPs önskas, inkubera ostimulerade PMNs (1-5 x 106) med N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (se Tabell för material) (1 µM i 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Fortsätt med steg 2.3.1-2.3.3. - Snurra ner på 850 x g under 5 minuter vid 4 ° C, ta bort PMNs och överföra cellfria supernatanterna till nya 1,5 mL mikrocentrifugrör.
- För MP isolering från cellfria supernatanterna, fortsätter du till steg 4,2.
- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) och återsuspendera i 0.1 µm filtreras Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) lösning, som innehåller det stimulerande medlet av val. För optimal stimulering, använda 100 µL stimulering lösning per 10 miljoner PMNs för 20-30 minuter vid 37 ° C i 15 mL rör.
3. PMN isolering från humanblod
-
Rekrytera friska frivilliga för blod extraktion enligt institutionella IRB riktlinjer.
- Samla in blod från underarmen av friska volontär i kommersiellt tillgängliga 5 mL natriumcitrat-innehållande rör (se Tabell för material).
- Pipettera 5 mL dextran och natrium diatrizoate lösning (densitet 1.113 g/ml, se Tabell för material) i steril 15 mL rör och långsamt lager 5 mL av nymalen isolerade mänskliga perifert blod ovanpå den.
- Centrifugera rören för 50 min 400 x g på RT (25 ° C) med låg acceleration och ingen broms.
- Vid slutet av centrifugeringen, ta bort plasma och mononukleära celler (övre skiktet) med sterila plast sug pipett.
- Över det nedersta lagret (PMNs) till en ny steril 50 mL koniska tub.
- Tillsätt en motsvarande volym av 0,45% NaCl till PMNs (mix väl och försiktigt genom att vrida röret).
- Centrifugera i 10 min vid 400 x g vid 25 ° C.
-
Röd cell lysis
- Tillsätt 10 mL av iskall, sterilt vatten till pelleterat celler för 45 s följt av 10 mL av iskall sterila 1,8% NaCl att återställa osmolalitet.
Obs: Alla följande steg för PMN isolering bör utföras på is för att undvika PMN aktivering och förtida MP release. Lys steget själv resulterar i mindre men inte betydande PMN aktivering, men det är viktigt för att isolera en ren PMN befolkning för funktionella analyser. - Centrifugera cellerna för 10 min på 250 x g vid 4 ° C med mjuk inbromsning.
- Upprepa steg 3.2.1 och 3.2.2.
- Återsuspendera PMNs i 5 mL iskallt HBSS utan kalcium eller magnesium. Räkna totala levande celler (Använd en hemocytometer och livskraft färgning vid spädning 1:2, se Tabell för material) innan stimulering.
Obs: Isolerade PMNs bör användas för stimulering eller andra experiment inom 2 h isolering för att undvika funktionella och cellulära förändringar och celldöd.
- Tillsätt 10 mL av iskall, sterilt vatten till pelleterat celler för 45 s följt av 10 mL av iskall sterila 1,8% NaCl att återställa osmolalitet.
4. MP isolering från aktiverade PMN supernatanterna
Obs: En liknande protokoll används för isolering av parlamentsledamöter från murina och mänskliga PMNs.
- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) och återsuspendera i 0.1 µm filtreras HBSS lösning, som innehåller det stimulerande medlet av val (för exempel 1 µM fMLF, se not: 2.3.1). För optimal stimulering använda 100 µL stimulering lösning per 10 miljoner PMNs för 20-30 minuter vid 37 ° C i 15 mL rör.
- Följande stimulering, snurra ner aktiveras PMNs vid 600 x g i 5 minuter vid 4 ° C och överföra cellfria supernatanterna till nya 1,5 mL mikrocentrifugrör.
- Centrifugera PMN-godkänt supernatanten vid 13 000 x g, 10 min, 4 ° C ta bort cellfragment och överför clearade supernatanten till en ny ultracentrifugen tub.
- Centrifugera i 1 h vid 100 000 x g, vid 4 ° C. Ta bort supernatanterna före MP lagring. Som behövs, pelleterat store MPs i paraffin förseglat ultracentrifugen rör vid-80 ° C fram till användning i experiment.
5. undersökning av PMN-MPs av Western Blotting
- Lägg till 1% SDS buffert (50-200 µL med 100 mM Tris pH: 7,4) till MPs pellet (från steg 4,4), överföring till nya 1,5 mL mikrocentrifugrör och koka lyserat MPs för 5 min.
Obs: Antalet parlamentsledamöter och lysis buffert volymen måste anpassas och optimeras för varje protein av intresse. -
Ladda lika mängder PMN-MPs per körfält i lastning buffert innehållande 10% β-mercapto-etanol.
Med vår metod vi Lägg MPs som isolerades från samma antal stimuleras PMNs.- Separera lysates av SDS-PAGE på 10% polyakrylamid gel (för 1-1,5 h använder 50-100 V) och överföra totala proteiner på nitrocellulosa membran som beskrivs9.
- Blockera membran för 1 h med 5% fettfri mjölk i 0,05% Tween-20 Tris-buffrad koksaltlösning och inkubera det med en lämplig primär (övernattning på 4 ° C), följt av sekundära HRP-konjugerade antikroppar.
- Visualisera banden genom att lägga till chemoluminescence lösning till membran och exponering för en röntgenfilm inuti en ljus-bevis kassett (1-24 h).
6. undersökning av PMN-MPs av flödescytometri
-
För antikropp färgning, späd antikroppar på lämpligt sätt i FACS buffert (PBS med 0,1 mM EDTA, 0,1% natriumazid). Återsuspendera pelleterat PMN-MPs (härrör från 1-3 x 106 PMNs/skick) i 100 µL antikropp lösning.
- Om färgning för Annexin V, Återsuspendera pelleterat PMN-MPs i Annexin V buffert innehållande 5 µL av FITC-konjugerad Annexin V. Om samtidig färgning med antikroppar, lägga till önskad antikropparna (för ett exempel se Tabell för material) direkt Annexin V lösningen. Lägg till fluorescerande lipid dye, N-(2-aminoethyl) maleimide (se Tabell för material), på 1 µM koncentration i 100 µL av FACS buffert att märka och identifiera MPs.
- Inkubera MPs i färgning lösning minst 20 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta MPs av ultracentrifugering (1 h vid 100 000 x g, vid 4 ° C). Kassera supernatanten.
- Återsuspendera i FACS buffert och kör exemplen på en utsedda flödescytometer utrustad med en uppgraderad elektronikenhet för ökad känslighet (se Tabell för material).
7. ansökningar för isolerade PMN-MPs att studera PMN funktion i sårläkning
-
In vivo administrering av PMN-MPs colonic sår
- Söva möss genom en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin (100 mg/kg) och xylazin (5 mg/kg). Bekräfta anestesi av pedal reflex (fast tå nypa) och justera om nödvändigt.
- Placera musen på magen och med 28 cm biopsi pincett och ett endoskop utrustad med en högupplöst kamera (såsom en veterinärmedicinska endoskop för liten användning av djur, se Tabell för material), generera 3-5 ytliga sår längs ryggsidan av den kolon. Efter avslutad såra placeras tillbaka möss till en bur på en temperatur-kontrollerad (37 ° C) matta tills återvinns.
- Söva möss (som i steg 7.1.1). Använd ett endoskop för att förvärva bilder av självförvållad sår 24 h (dag 1) efter såra. Låt möss återställa som i steg 7.1.2.
- Samtidigt (24 h efter såra), administrera murina PMN-MPs härrör från 2 x 106 PMNs i 100 µL av HBSS + direkt in varje sår webbplats med en koloskopi-baserat Mikroskop system (Använd en 29 G nål)9. Tre dagar senare (dag 4 efter såra) söva möss (som i steg 7.1.1) och använda ett endoskop för att återfå bilder av läka sår. Låt möss återställa som i steg 7.1.2.
- Med föredrog bild analys programvara (se Tabell för material), disposition synliga sår regioner i förvärvade bilder, mått området av samma sår på dag 1 och 4 efter såra och beräkna procentandelen av sårslutning.
-
Mänskliga epiteliala celler in vitro- sårläkning
- Räkna Caco-2 BBe eller T84, mänskliga tarmepitelceller av hemocytometer och utsäde 5 x 105 celler per brunn i 24-väl kultur plattor. Inkubera cellerna i en standard inkubation kammare vid 37 ° C och 5% CO2. Caco-2 BBe eller T84 nå konfluens inom 48 h9. Kultur epitelceller, Använd DMEM och DMEM-F12 (50: 50) med kosttillskott som tidigare beskrivs9.
- Generera mekanisk skrap sår i den enskiktslager med en pipettspetsen och låga sug som tidigare beskrivits4,9. Förvärva bilder av såret områden omedelbart efter repor med en inverterad differentiell störningar faskontrastmikroskop (5 X eller 10 X mål), skall användas som en tid = 0 referenspunkt.
- Lägga till MPs (härlett från 2-4 X 106 PMNs) kliade-sårade epitelial cell enskiktslager och inkubera i en ytterligare 24 h (48 h efter såra, vid 37 ° C med 5% CO2). Vid denna tid återförvärva bilder av scratch-såren.
- Använda föredrog bild analys programvara (se Tabell för material) för att mäta sårområden vid t = 0 och t = 48 h. beräkna procentandelen av sårslutning genom att fastställa skillnaden i sårområdet vid valda tidpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa flöde flödescytometrisk analys av MPs som isolerades från människa och mus PMNs visas i figur 1. Storlek heterogenitet PMN-MPs kan bedömas i jämförelse till kända stora pärlor som visas i figur 1A, B för mänskliga MPs. Obs, observerades inga signifikanta skillnader i storlek heterogenitet mellan mus och mänskliga MPs. På samma sätt kan med hjälp av flödescytometri och fluorescens märkning, uttryck av protein/s val av isolerade MPs av antingen musen eller mänskligt ursprung fastställas. Till exempel uttryck för fosfatidyl serine (PhS), kan undersökas av Annexin V färgning. Murina benmärgen PMN-MPs visas i figur 1C, D. Uttryck av flera markörer för val kan också bedömas som visas för Annexin V och CD11b färgning av mänskliga MPs, figur 2A, B. En annan metod att upptäcka PMN-MPs av flödescytometri är att färga nymalen-isolerade PMNs före stimulering som visas i figur 2C. Till exempel PMN färgning med lipid markören N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC före fMLF stimulering resulterar i utsläpp av gröna MPs, som kan lätt upptäckas av flöde. Notera, medan färgning med N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC har använts tidigare att märka och identifiera MPs som lämnades från perifert blod10 eller injiceras i djur11, användning av andra markörer för märkning ändamål för in vitro- eller in-vivo ansökan bör bestämmas av varje utredare. Utöver flödescytometri, kan PMN-MPs analyseras av immunoblotting för proteiner av intresse. Som visas i figur 3, MPs härrör från mänskliga PMNs som stimuleras med flera kända aktivatorer, undersöktes av uttryck för nyckel inflammatoriska (matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) och myeloperoxidas (MPO)) och anti-inflammatoriska (Annexin A1) molekyler. Som framgår av representativa immunoblots, PMN stimulering med IFNγ (50 ng/mL), PMA (200 nM), och fMLF (1 µM) resulterade i MPs uttrycker varierande nivåer av MMP-9. Dock bara störning av aktin cytoskelettet av Latrunculin B (1 µM) innan stimulering med fMLF (5 µM) ledde till riklig förekomst av MPO i PMN-MPs. Likaså upptäcktes varierande nivåer av Annexin A1 (hög att ingen upptäckt) på MPs efter beskrivs aktiverande villkoren. Dessa resultat tyder på att PMN-MP sammansättning är impulsberoende.
Slutligen, figur 4 visar hur isolerade PMN-MPs kan användas för att studera sår helande in vitro- och in-vivo i kolon skada. PMN-MPs kan läggas till scratch-sårade epitelial enskiktslager i kulturer, där healing kan övervakas av imaging förvärv vid förutbestämda tidpunkter. MPs kan vidare vara microinjected direkt i kolon sår, som genererades av biopsi pincett och endoskopisk imaging9, och deras effekt på läkning kan bedömas. För både in vitro och i vivo analys av sårläkning, bilder av självförvållad sår förvärvas omedelbart inlägget skadade (eller på annat sätt som anges) och kontinuerligt genom läkningsprocessen vid förutbestämda tidpunkter. Använda kommersiellt tillgängliga bild analysprogram, ändringar i sårområdet (storlek) mäts och används för att bestämma andelen såret stängning. Tillämpningen av PMN-MPs thatcontain MPO till antingen odlade epitelial enskiktslager eller i vivo colonic sår har skadliga effekter, vilket leder till fördröjd läkning9.
Figur 1 . Analys av PMN-MP storlek och yta markörer av flödescytometri. (A) flödescytometer optimerad kontroll pärlor (se Tabell för material) av kända storlekar och scatter värden visas i SSC och FSC ortogonala representation. Pärlorna används för att få en relativ Storleksjämförelse med en PMN-MP prov visas i B. (B) mänskliga PMN-MPs var isolerade och analyseras med flödescytometri med villkoren för pärlor. Heterogenitet i MP storlekar kan ses. (C–D) MPs härrör från fMLF-stimulerad murina benmärgen PMNs analyserades av flödescytometri. Representativa flödesdiagram Visa ofärgade (C) eller Annexin V-FITC-färgade (D) MPs. rektangulärt område visar Annexin V-positiv MPs (FITC-positiv MPs). SSC: Side Scatter; FSC: Framåt Scatter; PhS: Fosfatidyl serine. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . PMN-MP färgning och analys med flödescytometri. (A) Unstained och (B) Annexin V-FITC - och hCD11b-APC-färgade MPs. Square område omsluter en Annexin V/CD11b dubbel positiva befolkning av PMN-MPs. (C) nymalen isolerade mänskliga PMNs (1 x 106) var målat med ett fluorescerande färgämne , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC och stimuleras med fMLF. MPs isolerades från cell supernatanterna och analyseras med flödescytometri. Rektangulärt område omsluter en N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC positiva MP befolkning (M-FITC, y-etikett). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Sammansättningen av PMN-MPs är impulsberoende. (A) mänskliga PMNs stimuleras med antingen IFNγ, TNFα, fMLF, PMA eller en kombination av latranculin B följt av fMLF (LtB-fMLF). MPs isolerades från de resulterande cellen supernatanterna av ultracentrifugering och protein lysates utarbetades i 1% SDS buffert. Proteiner var åtskilda av storlek electrophoretically i en 10% polyakrylamidgel, överförs till ett nitrocellulosa membran och utforskad för antingen en MMP-9, MPO eller Annexin A1 primär antikropp följt av lämpliga HRP-konjugerad sekundära antikropparna. (B) representativa elektronmikroskopi bilder av mänskliga PMN-MPs skildra storlek heterogenitet. En exosome < 100 nm storlek indikeras av den vita pilen. Skalstapeln = 250 nm (vänster och höger paneler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Användning av isolerade PMN-MPs studera rollen som PMNs i epitelial sårläkning. (A) Caco-2 BBe mänskliga tarmepitelceller var klädd confluency, scratch-sårade och utsätts för MPs härrör från 3 miljoner PMNs, som tillfogades omedelbart efter såra. Representativa bilder Visa sårslutning (48 h efter såra) i kontroll (vänster paneler) och PMN-MP-behandlade epitelceller (rätt panelerna). Skalstapeln = 100 µm. (B) för att undersöka effekten av PMN-MPs på colonic wound healing i vivo, isolerade PMN-MPs skulle injiceras direkt i sårområdet med hjälp av en endoskopi-baserat Mikroskop system (på 24 h efter såra, colonic såret är beskrivs som en streckad linje och injektion nål webbplats visas med en vit pil). Sårslutning var bedömda 3 dagar senare (4 dagar efter såra) av endoskopisk imaging. Skalstapeln = 300 µm. (C) 4 dagar efter skadade möss var euthanized och colonic slemhinnor sår var extraheras med sax, inbäddade i optimal styckning temperatur (O.C.T) förening och frysta med flytande kväve. Åtta mikrometer sektioner av såren var målat för E-cadherin (grön) och nukleära fläcken DAPI (blå) för att bedöma nivån på återepitelisation (övre paneler), eller DAPI (blå) och Ki67 (röd) att visualisera de totala och prolifererande epitelcellerna vid såret kanten (lägre paneler). Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokoll för isolering och karakterisering av PMN-derived MPs beskrivs i detta meddelande. Flera viktiga kritiska punkter måste beaktas för att lyckas med förfarandet. Först måste PMNs vara isolerade färska och används i experiment inom 2 h isolering för att förhindra spontana aktivering och degranulering. All hantering av PMNs under isolering och fram till punkten av stimulering måste utföras på is för att förhindra aktivering och förtida MP release12. Andra, ultracentrifugering i 1 h eller mer maximerar den pelletering av MPs. tredje, för analys av flödescytometri, instrumentet måste vara korrekt kalibrerad med en blandning av instrumentet angiven fluorescerande pärlor (pärlor typ justeras till ett särskilt instrument) för att korrekt definiera MP storlekar. Till exempel, medan en tillverkare av flöde cytometers rekommenderar att du använder FSC pärlor som storleksrelaterade parameter, har andra optimerats för SSC pärlor. Dessutom förses den flödescytometer användas för MP analys med uppgraderad elektronik som bäst löser MPs från bakgrundsljud.
För att korrekt identifiera MPs förutom storlek parametrar, rekommenderas användning av fluorescens färgning som beskrivs i procedurerna ovan. Dessutom bör alla lösningar under förberedelse och isolering filtreras genom en 0.1 µm filtersystem att minimera införandet av dammpartiklar eller andra fällningar som kommer att öka bakgrund buller under förvärv av flödescytometri. Ännu viktigare, övervägas Förvaringsanvisningar för MPs. Lite bevis8, och våra egna opublicerade observationer, föreslå att MP frysning leder till membran bristning och MP går sönder. Slutligen, varierande PMN villkoren för aktivering och timing kan ändra och förbättra MP avkastning.
Det finns vissa begränsningar för denna metod. Isolering av mus PMNs från benmärg är normalt inte ren (~ 85 – 90%) och är förorenad av andra immunceller (primärt mononukleära lymfocyter) som bestämdes av flöde flödescytometrisk analys. Således, de resulterande isolat kan innehålla små mängder av MPs släpptes av andra immunceller. Alternativ är tillgängliga och har isolering av PMNs av kommersiellt tillgängliga magnetiska pärlor, men detta skulle vara ett längre och ett betydligt dyrare förfarande. Slutligen, utan fluorescens märkning, förutom storlek parametrar, slutgiltiga differentiering av parlamentsledamöter från damm eller andra vattenlösliga eller luftburna partiklar av liknande storlek som kan förorena provet är utmanande och tidskrävande.
I framtiden, hjälper sortering av PMN-MPs märkt med specifika markörer belysa MP sammansättning under specifika villkor som stimulerande eller modeller av sjukdom, och förhoppningsvis möjliggöra användning av MPs som diagnostiska markörer och potentiella terapeutiska mål att behandla inflammatoriska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt av något slag som relaterade till detta meddelande
Acknowledgments
Vi är tacksamma för tekniskt bistånd av Dr Suchitra Swaminathan som driver nordvästra Feinberg skola av medicin Flow flödescytometri kärnan. Finansieringen tillhandahölls av (NIH) DK101675.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
