Summary
Yeni iletişim kuralları burada yalıtmak ve insan türetilmiş microparticles karakterize açıklanmıştır ve fare nötrofiller. Bu protokoller ultrasantrifüj, Akış Sitometresi ve microparticle içeriği analiz etmek için immunoblotting teknikleri kullanmak ve çeşitli hücre tiplerinin hücresel işlevde türetilen microparticles rolü çalışma için kullanılabilir.
Abstract
Polimorfonükleer nötrofil kaynaklı microparticles (PMN)-MPs) lipid bilayer, çapı 50-1000 nm arasında değişen boyutlarıyla küresel microvesicles vardır. MPs bir yeni gelişen, hücre hücre iletişim ve sinyal makine önemli parçası vardır. Büyüklükleri ve serbest bırakılmaları doğası nedeniyle, yakın zamana kadar MP varlığını gözden oldu. Ancak, gelişmiş teknoloji ve analitik yöntemleri ile sağlık ve hastalık kendi işlevleriyle şimdi ortaya çıkıyor. Burada sunulan protokolleri Akış Sitometresi ve immunoblotting tarafından izole edip PMN-MPs karakterize hedefleniyor. Ayrıca, çeşitli uygulama örnekleri verilmiştir. Bu protokoller MP yalıtım için hızlı, ucuz ve pahalı setleri kullanılması gerekli değildir. Ayrıca, onlar bir membran özel floresan boya kullanarak görselleştirme ve analiz için Akış Sitometresi tarafından yalıtım aşağıdaki gibi MP yayın önce kaynak hücrelerinin önceden etiketleme MPs etiketleme için izin. Bu yöntemi ancak, saflık PMNs ve MPs ve gelişmiş analitik araçları ihtiyacını da dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Bir high-end Akış Sitometresi güvenilir MPs analiz ve yanlış pozitif okuma gürültü veya otomatik Floresans nedeniyle en aza indirmek için gereklidir. Açıklanan protokoller yalıtmak ve MP Biyogenez tanımlamak için kullanılan ve onların işaretleri ve kompozisyon farklı uyarıcı koşullar altında varyasyon karakterize. Boyutu heterojenite membran parçacıklar exosomes karşı içeriğini farklı olup olmadığı ve olup doku homeostazı içinde farklı rolleri yerine getirmek araştırmak için yararlanılabilir. Son olarak, aşağıdaki yalıtım ve karakterizasyonu MPs, hücresel yanıt işlevlerine ve çeşitli hastalık modelleri (dahil olmak üzere, inflamatuar barsak hastalıkları veya akut akciğer yaralanma gibi PMN ilişkili enflamatuar bozuklukları) düzenlemelidir.
Introduction
Çapı, 50-1000 nm arasında değişen bu yapıların biyolojik bilgi taşıdığını ortaya çıkan veri önerdiği gibi son zamanlarda, "microparticles/microvesicles" hücre sitozol ve plazma zarı'büyük bilimsel ilgi haline gelmiştir ve hücresel iletişim kurallı olmayan bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bağışıklık hücre MPs kaynaklı ve özellikle bu polimorfonükleer nötrofiller (PMNs) tarafından üretilen PMNs önemli rolü ana savunma1,2, inflamatuar yanıt3ve yara iyileşmesi verilen büyük ilgi vardır 4. çoğu intriguingly konularda, şimdiye kadar çok sayıda rapor pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar PMN-MPs5bir potansiyel içerik-, hastalık, türler- ve MPs organ özgü rolü düşündüren, işlevlerinin göstermiştir.
Bu iletişimde açıklanan protokoller MPs işlevi sağlığı ve hastalıkları eğitim için düşük maliyetli, yenilikçi ve uyarlanabilir bir yöntem sağlar. Onlar birçok model organizmalar, organları ve stimülasyon koşullara tabidir. Onlar çeşitli MPs tanımlanması için izin ve gelecekte pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar işlevlerini gidermek için kullanılan. Örneğin, açıklanan işte PMN-MPs işlevi epitel yara iyileşme vitro ve içinde vivoçalışma. Kemik iliği türevi PMNs yukarıda açıklanan yöntem6bazı değişikliklerle adapte fare yalıtım için sunulan protokolü.
Ayrıca, bu çalışmada açıklanan protokollere algılama ve PMN-MPs üzerinde iki tamamlayıcı yöntemler tarafından bulunabilir belirli işaretleri karakterizasyonu için izin ver: Western blot ve Akış Sitometresi. İmmunoblotting standart protokolleri5 kullanarak MPs, kolay ve güvenilir, ancak, şimdi daha fazla MPs analiz için izin duyarlılık Akış Sitometresi aletler ve geliştirilmiş gürültü sinyal oranı son gelişmeler bu yöntemi kullanarak bul. Bu çalışmada açıklanan protokoller son gelişmeler ve Santrifüjü hız ve zaman, örnek filtreleme ve donma/saklama koşulları7 ek değişiklikler de dahil olmak üzere özgün araştırma makaleleri gelen önerileri dahil , 8ve nasıl "arka plan gürültü" azaltmak, PMN-MPs algılama sınırını artırmak ve MPs farklı boyutlar arasında ayırımcılık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan iş kuzeybatı IACUC tarafından kabul edildi. Tüm deneyler uygun olarak ve tüm ilgili yasal ve kurumsal yönergeleri ile uyum içinde tamamlandı. Kan Bağış insan denekler için aydınlatılmış onam sunulan ve imzaladı; Ayrıca, bu çalışmanın tüm insan denekler insan refahı için kurumsal ve federal yönergelere uygun olarak tedavi edildi.
Not: Protokolü adımları aşağıdaki alt bölümleri altında listelenir: (i) fare kemik iliği hücre izolasyon; (ii) PMN yalıtım üzerinden fare kemik iliği; (iii) PMN insan kanı izolasyonu; (iv) MP izolasyon PMN Supernatants (tarafından ultrasantrifüj); (v) MPs Western Blot tarafından karakterizasyonu; (vi) MPs Akış Sitometresi tarafından karakterizasyonu; (VIII) çalışma yara iyileşmesi için izole MPs uygulanması
1. fare kemik iliği hücre izolasyon
-
Femur ve tibia fare arka bacaklara gelen diseksiyon
- Bir ötenazi kutusu (örneğin, bir boş 1 mL İpucu kutusunu) anesteziye inhalasyon için hazırlayın. % 100 isoflurane bir plastik kutu kapak iç bantlanmış bir Steril bez üzerine birkaç damla ekleyin. Yeni IACUC kurallar uyarınca hayvanlar değil isoflurane ile doğrudan temas, böylece yer bir ipucu tutucu isoflurane içeren gazlı bez ve fare arasında.
Not: Isoflurane güçlü bir inhalational anestezi ve aşırı dikkatli bir duman başlık içinde ele alınmalıdır. - Fareler IACUC öneri göre ötenazi. Bir fare kadar nefes kesildiği tarih vardır 1 – 5 dk 1.1.1. adımda açıklanan ötenazi kutusunun içine yerleştirir. Hayvanın ölüm servikal yerindençıkmasına gerçekleştirerek emin olun.
- Karın deri 0,17 X 0.1 mm cımbız paslanmaz çelik, 12 cm kavisli, kullanarak kaldırın ve üst ve alt ekstremitelerde arasında yarı yolda deriyi kesme. Alt ekstremite gibi fare vücudun en distal bölümüne buradan cilt soyma. 10 cm uzunluğunda, ile düz makas anatomi, kaslar arka legs--dan kaldırmak ve femur başı dokunmadan Kalça eklemi yerinden çıkar.
- Makas femur ve tibia kas incelemek ve uyluk kemiği tibia ayırmak için kullanın. Kemik iliği önemli miktarda içerdiğinden kemik uçları sağlam kalır emin olun.
- Tüm kalan eti kemik bir kağıt havlu içinde haddeleme tarafından kaldırın. Temiz kemikler Serum-Alerjik orta (SFM, Yani, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) serum veya antibiyotik olmadan) içeren bir Petri kabına yerleştirin.
- Kemikleri % 70 etanol ve sonra SFM durulayın.
- SFM 50 mL 50 mL konik tüp hazırlayın. SFM 10 mL 10 mL şırınga yük ve bir 25 ve 5/8 inç ölçer iğneye takın.
- Bir açılış için kemik iliği (kırmızımsı renk) görünene kadar kemikleri sonu makasla kırpın.
- Kemik iliği hücre yeni bir 50 mL tüp floş. Yaklaşık 3 mL/kemik SFM ile 26 ve 5/8 inç ölçer iğneyle bir 10 mL şırınga kullanın. Kızarma bittiğinde, tüp hücrelerde hücre toplamları kırmaya (kullanım 1 mL tek kullanımlık plastik ipuçları) pipetting tarafından resuspend.
- Bir ötenazi kutusu (örneğin, bir boş 1 mL İpucu kutusunu) anesteziye inhalasyon için hazırlayın. % 100 isoflurane bir plastik kutu kapak iç bantlanmış bir Steril bez üzerine birkaç damla ekleyin. Yeni IACUC kurallar uyarınca hayvanlar değil isoflurane ile doğrudan temas, böylece yer bir ipucu tutucu isoflurane içeren gazlı bez ve fare arasında.
2. fare kemik iliği izolasyonu PMN
-
Kırmızı hücre lizis
- 350 x g 4 ° C'de 8 min için de centrifuging tarafından toplanan kemik iliği cips
- Hücre Pelet %0,2 20 mL resuspend eritrosit kesir lyse NaCl yaklaşık 20-30 s. 30 fazla olamaz bu s PMN lizis neden olacaktır. %1,6 20 mL ekleyin NaCl osmolalite geri yüklemek için.
Not: Bu adım çok az PMN harekete geçirmek neden olabilir. - PBS ve santrifüj adım 2.1.1 yukarıda olduğu gibi 2 mL hücrelerle yıkayın. Süpernatant kaldırın.
- İzoleli PMNs yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından devam edin.
-
Yalıtım nötrofil yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından
- Sıcak polysucrose ve sodyum diatrizoate çözümleri, 1.119 g/mL ve 1.077 g / ( Tablo malzemelerigörmek) mL, oda sıcaklığında (RT) kullanmadan önce yoğunlukları ile.
- Polysucrose ve sodyum diatrizoate degradeler taze, yavaş yavaş 1.077 g/mL yoğunluğu çözüm 1.119 g/mL yoğunluğu çözüm 15 mL konik tüpler üzerinde 3 mL 3 mL katman tarafından hemen kemik iliği hücre uygulamadan önce hazırlayın.
Not: Degrade çözümde çok önceden hazırlanması katmanlar ve zavallı nötrofil saflık ve kurtarma karıştırma neden olur. - Kemik iliği hücre Pelet 1 mL buz gibi PBS resuspend ve polysucrose ve sodyum diatrizoate üzerine ortaya çıkan hücre süspansiyon yerleşimi degrade (yavaş yavaş, katmanları karıştırma önlemek için).
- Santrifüj 850 x g RT, fren, 25 ° c de 30 dk için. Reaktifleri RT kemik iliğinde mevcut diğer hücrelerden nötrofil etkili ayrılması için tutun. Etkili bir şekilde kurulmuş ve Santrifüjü adımdan sonra tutulan gradyan için izin vermek için yavaş yavaşlama, santrifüj ayarlayın.
- Görsel olarak PBS ve 1.077 g/mL yoğunluğu çözüm (üst katman) arabiriminin mononükleer hücre katmanında bulun. Bu tabaka ve yoğunluk çözüm geri kalanı PMN grup bozmadan kaldırın.
- Bir katmanın tamamına PMN ve bazı temel polysucrose ve sodyum diatrizoate 1.119 g/mL solüsyon kullanarak transfer pipet 15 mL tüpler içine toplamak.
Not: İzole PMNs saflığı tümüyle kaldırılmasını üst katman üzerinde bağlıdır. - Filtre uygulanmış PBS (0,1 µm gözenek boyutu filtre ile filtre) ve 4 ° C'de 5 min için 300 x g, santrifüj tüpleri top
- Pelleted PMNs Santrifüjü koşullar olduğu gibi adım 2.2.7 kullanarak PBS 2 mL ile yıkayın.
- 1 mL süzülmüş PBS resuspend ve hemasitometre tarafından izole PMNs say.
Not: Bu yalıtım yöntem için elde edilen PMN saflık tutarlar için ~ 85-%90, gibi Akış Sitometresi tarafından değerlendirildi. Kesirler kirletici kalan öncelikle mononükleer lenfosit oluşur.
-
MP yayın ikna etmek için PMN stimülasyon
Not: PMNs N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-asetat (PMA) veya Interferon gama (IFNγ) de dahil olmak üzere çeşitli aktive koşul kullanma MPs serbest bırakmak için teşvik. Önemlisi, simülasyon önce PMNs buz üzerinde her zaman tutulmalıdır.- Pelet PMNs (300 x g, 5 dk, 4 ° C) ve resuspend 0,1 µm Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) çözüm, seçim teşvik edici Ajan içeren filtre. En iyi uyarılması için 20-30 dk 15 mL tüpler 37 ° C'de 10 milyon PMNs başına 100 µL stimülasyon çözüm kullanın.
Not: Aktivatörleri aşağıdaki konsantrasyonları başarıyla önceki çalışmalarda kullanılmıştır: fMLF (0.5-1 µM insan ve fare PMNs için 2-5 µM), PMA (200 nM) ve IFNγ (100 ng/mL). Önceden etiketli MPs sürümü isterseniz, unstimulated PMNs kuluçkaya (1-5 10 x6) N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC ile ( Tablo malzemelerigörmek) (100 µL HBSS, 15 dk, 37 ° C de 1 µM). Adımları 2.3.1-2.3.3 ile devam edin. - 850 x g 4 ° C'de 5 min için de PMNs kaldırmak ve boş hücre supernatants yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için aktarmak için spin aşağı.
- Boş hücre supernatants MP izolasyonu için 4.2 adıma geçer.
- Pelet PMNs (300 x g, 5 dk, 4 ° C) ve resuspend 0,1 µm Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) çözüm, seçim teşvik edici Ajan içeren filtre. En iyi uyarılması için 20-30 dk 15 mL tüpler 37 ° C'de 10 milyon PMNs başına 100 µL stimülasyon çözüm kullanın.
3. insan kanı PMN izolasyon
-
Sağlıklı gönüllüler kurumsal IRB esaslarına göre kan çıkarılması için recruit.
- Kan sağlıklı gönüllü önkol ( Tablo malzemelerigörmek) ticari olarak mevcut 5 mL sodyum sitrat içeren tüpler-içine toplamak.
- 5 mL dextran ve sodyum diatrizoate çözeltisi pipet (1.113 g/mL, yoğunluğu bkz: Malzemeler tablo) steril 15 mL tüpler ve yavaş yavaş katman 5 mL taze izole insan periferik kan üstüne de içine.
- Tüpler için düşük ivme ile de RT (25 ° C) g x 400 ve fren yok 50 dk santrifüj kapasitesi.
- Santrifüjü sonunda, plazma ve mononükleer hücreler (üst katman) steril plastik emme pipet kullanarak kaldırın.
- Alt tabaka (PMNs) yeni bir steril 50 mL konik tüp içine aktarın.
- % 0.45 eşit bir birim eklemek NaCl PMNs (mix iyi ve yavaşça tüp döndürerek) için.
- Vasıl 400 x g 25 ° C'de 10 dakika santrifüj
-
Kırmızı hücre lizis
- 45 için pelleted hücrelere 10 mL buz gibi steril su ekle s ardından buz gibi steril %1.8 tarafından 10 mL NaCl osmolalite geri yüklemek için.
Not: PMN yalıtım için aşağıdaki adımların tümünü buza PMN etkinleştirme ve ürün, erken MP önlemek için yapılmalıdır. Lizis adım küçük ama önemli değil PMN harekete geçirmek içinde sonuçlanır, ancak, bu işlev deneyleri için saf bir PMN nüfus yalıtmak için esastır. - Hücreler için 250 x g yumuşak yavaşlama ile 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi.
- 3.2.1 ve 3.2.2 adımları yineleyin.
- PMNs kalsiyum ve magnezyum buz gibi HBSS 5 ml resuspend. Saymak toplam canlı hücreleri (hemasitometre ve 1:2 seyreltme boyama canlılık kullanın, Malzemeler tablobakınız) stimülasyon önce.
Not: İzole PMNs stimülasyon veya diğer deneyler 2s tecrit içinde işlevsel ve hücresel değişiklikler ve hücre ölümü önlemek için kullanılmalıdır.
- 45 için pelleted hücrelere 10 mL buz gibi steril su ekle s ardından buz gibi steril %1.8 tarafından 10 mL NaCl osmolalite geri yüklemek için.
4. MP aktif PMN Supernatants izolasyonu
Not: Benzer bir iletişim kuralı üzerinden fare ve insan PMNs MPs yalıtım için kullanılır.
- Pelet PMNs (300 x g, 5 dk, 4 ° C) ve resuspend 0,1 µm olarak filtre HBSS çözüm, seçim teşvik edici Ajan içeren (Örnek 1 µM fMLF için bkz: Not: 2.3.1). En iyi uyarılması için 20-30 dk 15 mL tüpler 37 ° C'de 10 milyon PMNs başına 100 µL stimülasyon çözüm kullanın.
- Aşağıdaki stimülasyon, 600 x g 4 ° C'de 5 min için de harekete geçirmek PMNs aşağı spin ve boş hücre supernatants yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer.
- PMN temizlenmiş süpernatant 13.000 x g, 10 min, hücre artıkları kaldırmak ve temizlenen süpernatant yeni bir ultracentrifuge tüp içine aktarmak için 4 ° C, santrifüj kapasitesi.
- Santrifüj 4 ° C'de 100.000 x g, 1 h için Supernatants MP depolama önce kaldırın. Gerektiğinde, mağaza MPs deneyler kullanımda kadar ultracentrifuge tüpler-80 ° C'de mühürlü parafin içinde pelleted.
5. Western Blot tarafından PMN-MPs incelenmesi
- % 1 SDS arabellek ekleyin (50-200 µL ile 100 mM Tris pH: 7,4) için MPs (adımından 4.4), transfer yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için cips ve 5 min için lysed MPs kaynatın.
Not: MPs ve lizis arabellek birim sayısı ayarlanabilir ve faiz her protein için en iyi duruma getirilmiş. -
PMN-MPs eşit miktarda % 10 β-mercapto-etanol içeren arabellek yükleme lane başına yük.
Not: bizim yöntemi ile uyarılan PMNs aynı numaradan izole edildi MPs yükleyin.- SDS-sayfa tarafından lysates % 10 polyacrylamide jel üzerinde ayrı (50-100 V 1-1.5 h için kullanılır) ve açıklanan9olarak nitroselüloz membran üzerine toplam protein transfer.
- % 0.05 ara-20 Tris arabelleğe alınmış serum %5 yağsız süt ile 1 h için membranlar engellemek ve uygun bir birincil ikincil HRP Birleşik antikorlar tarafından takip (gecede 4 ° C'de), ile kuluçkaya.
- Bantları membran ve ışık geçirmez kaset (1 / 24 h) içinde bir röntgen filmi maruz chemoluminescence çözüm ekleyerek görselleştirin.
6. PMN-MPs Akış Sitometresi tarafından incelenmesi
-
Antikor boyama için antikorlar uygun şekilde arabellekte FACS (0.1 mm EDTA, % 0,1 sodyum azid PBS) oranında seyreltin. Resuspend pelleted PMN-MPs (1-3 x 10 elde edilen6 PMNs/koşul) 100 µL antikor çözümde.
- Annexin V için boyama eğer pelleted PMN-MPs FITC Birleşik Annexin v 5 µL içeren Annexin V arabellekte resuspend. Antikorlar ile birlikte boyama, istenen antikorlar (için bir örnek bakın Malzemeler tablo) doğrudan Annexin V ekleyin. Floresan lipid boya, N-(2-aminoethyl) maleimide ekleyin (bkz. Tablo malzemeler), 100 µL 1 µM konsantrasyon FACS tampon etiket ve MPs tanımlamak için.
- Çözüm için en az 20 dk 4 ° C'de boyama içinde MPs kuluçkaya
- MPs yıkama ultrasantrifüj tarafından (100.000 x g, 4 ° C'de 1 h); süpernatant atmak.
- FACS arabellekte resuspend ve artan duyarlılık için yükseltilmiş elektronik birimi ile donatılmış bir belirlenen Akış Sitometresi örnekleri çalıştırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
7. yara iyileşmesi de PMN işlevi çalışmaya izole PMN MPs uygulamalarda
-
Vivo İdaresi PMN-MPs kolon yaralar
- Fareler ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (5 mg/kg) karışımı bir mayi enjeksiyonu ile anestezi. Anestezi pedal refleks (firma ayak tutam) onaylamak ve gerektiği gibi ayarlayın.
- Onun mide ve 28 cm biyopsi forceps ve yüksek çözünürlüklü bir fotoğraf makinesi ile donatılmış bir endoskop kullanma üzerine fareyi getirin (küçük hayvan kullanmak için veteriner endoskop gibi Malzemeleri tablogörmek), 3-5 yüzeysel yaralar sırt tarafındaki oluşturmak iki nokta üst üste. Yaralama tamamlanmasından sonra yeniden elde etmek kadar ısı kontrollü (37 ° C) mindere dönüş fareler için bir kafes yerleştirilir.
- Fareler (aynı derecede içinde adım 7.1.1) anestezi. Bir endoskop yaralama verdirdiler yaralar 24 saat (gün 1) sonrası görüntüleri elde etmek için kullanmak. Fareler gibi adım 7.1.2 kurtarmak izin.
- (24 saat sonrası yaralama) aynı zamanda fare PMN-MPs 2 x 106 PMNs mikroenjeksiyon kolonoskopi-esaslı sistem (kullanım 29 G iğne)9kullanan her yara site içine HBSS + doğrudan 100 µL içinde türetilen yönetmek. Üç gün sonra (4 gün sonrası yaralama) fareler (aynı derecede içinde adım 7.1.1) anestezi ve bir endoskop yaraların iyileşme görüntüleri yeniden almak için kullanın. Fareler gibi adım 7.1.2 kurtarmak izin.
- Tercih edilen görüntü analiz yazılımı kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), anahat görünür yara bölgeleri elde edilen görüntülerde, alan aynı gün 1 ve 4 sonrası yaralama yara ve yara kapatma yüzdesini hesaplamak ölçü birimi.
-
Vitro yara iyileşmesi insan epitel hücreleri
- Count Caco-2 BBe veya T84, insan bağırsak epitel hücreleri tarafından hemasitometre ve tohum 5 x 105 hücreleri/kuyuda 24-şey kültür plakaları. Standart kuluçka odası 37 ° C ve % 5 CO2hücrelerinde kuluçkaya. Caco-2 BBe veya T84 ulaşmak confluency 48 saat9. Epitel hücreleri kültür, DMEM ve DMEM-F12 (50: 50) ile ek olarak daha önce kullanmak için9açıklanan.
- Pipet ucu kullanarak monolayer mekanik kazı-kazan yaralar oluşturmak ve düşük emme daha önce4,9açıklandığı gibi. Hemen bir zaman kullanılmak üzere bir ters faz kontrast fark girişim mikroskop (5 X veya 10 X kullanmak hedefleri) kullanarak çizilmemesi sonra yara alanlarda görüntüleri elde 0 referans noktası =.
- (2-4 X 106 PMNs türetilmiş) MPs epitel hücre çizik-yaralı monolayers ekleyin ve bir ek 24 h (48 h, % 5 CO237 ° C'de sonrası yaralama) için kuluçkaya. Şu anda çizik-yaralar görüntülerini yeniden elde etmek.
- Tercih edilen görüntü analiz yazılımı kullanın (görmek Malzemeler tablot yara alanlarını ölçmek için) = 0 ve t = seçilen zaman noktalarda yara alanında fark belirlenerek 48 h. Calculate yara kapatma yüzdesi =.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsilcisi akış sitometrik analiz üzerinden insan izole edildi ve PMNs fare MPs şekil 1' de gösterilmiştir. PMN-MPs boyutu heterojen, buna karşılık insan MPs. Not için şekil 1A, B gösterildiği gibi bilinen boyutlu boncuk için değerlendirilebilir, fare ve insan milletvekilleri arasında boyutu heterojenite hiçbir önemli farklılıklar gözlenmiştir. Benzer şekilde, Akış Sitometresi ve floresan etiketleme kullanarak, protein/s fare veya insan kaynaklı izole milletvekilleri tarafından tercih ifade belirlenebilir. Örneğin, ifade Phosphatidyl serin (PhS) incelenebilir Annexin V boyama tarafından. Fare kemik iliği PMN-MPs şekil 1C, Diçinde gösterilir. Seçtiğiniz birkaç işaretleri ifade V Annexin ve CD11b insan MPs, Şekil 2A, Bboyama için gösterildiği gibi değerlendirilebilir. PMN-MPs Akış Sitometresi tarafından tespit etmek için başka bir Şekil 2' deCgösterildiği gibi stimülasyon önce taze izole PMNs leke yöntemidir. Örneğin, fMLF stimülasyon sonuçlarından yeşil MPs sürümündeki önce lipid marker N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC ile boyama PMN, bu kolayca akış tarafından tespit edilebilir. Not, N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC ile boyama sırasında daha önce etiket ve insan kan periferik10 ' dan elde edilen veya hayvanlar11, kullanım amaçları için etiketleme için diğer işaretleri içine enjekte MPs algılamak için kullanılmıştır vitro veya vivo içinde uygulama her araştırmacı tarafından tespit edilmelidir. Akış Sitometresi yanı sıra PMN-MPs proteinler ilgi için immunoblotting tarafından çözümlenebilir. Şekil 3, MPs birkaç bilinen aktivatörleri ile teşvik insan PMNs türetilen gösterildiği gibi anahtar inflamatuar ifade için muayene (matris metallopeptidaz 9 (MMP-9) ve myeloperoxidase (MPO)) ve anti-inflamatuar (Annexin A1) molekülleri. Temsilcisi immunoblots, IFNγ ile PMN stimülasyon gibi belirgin (50 ng/mL), PMA (200 nM), ve fMLF (1 µM) MMP-9 çeşitli düzeylerde ifade MPs içinde sonuçlandı. Ancak, aktin sitoiskeleti tarafından Latrunculin B (1 µM) önceden uyarılması ile fMLF (5 mikron) için tek pertürbasyon MPO PMN-MPs içinde bol varlığı yol açtı. Benzer şekilde, çeşitli düzeylerde A1 (hiçbir algılama için yüksek) Annexin açıklanan aktive koşulları aşağıdaki MPs tespit edildi. Bu sonuçlar PMN-MP kompozisyon uyarıcı bağlı olduğunu göstermektedir.
İzole PMN-MPs eğitim için kullanılabilir nasıl son olarak, şekil 4 gösterir şifa vitro ve in vivo kolon yaralanma yara. PMN-MPs çizik yaralı epitel monolayers nerede şifa edinme önceden belirlenmiş zaman noktalarda Imaging tarafından izlenebilir kültürde eklenebilir. MPs daha da biyopsi forceps ve endoskopik görüntüleme9tarafından oluşturulan, doğrudan kolon yara microinjected ve şifa üzerinde etkilerini tespit edilebilir. Yara iyileşmesi içinde in vitro ve in vivo analizi için verdirdiler yaralar görüntülerini hemen sonrası yaralama (ya da başka şekilde belirtildiği gibi) satın alınan ve önceden belirlenmiş zaman noktalarda iyileşme sürecinde sürekli. Piyasada bulunan görüntü analiz yazılımı kullanarak, değişiklikler yara alan (boyut) ölçülen ve yara kapatma oranını belirlemek için kullanılır. MPO ya da içeren PMN-MPs uygulanması epitel monolayers kültürlü veya vivo içinde kolon yaralara gecikmeli şifa9için önde gelen zararlı etkileri vardır.
Resim 1 . PMN-MP boyutu ve yüzey işaretleyicileri tarafından Akış Sitometresi Analizi. (A)Akış Sitometresi en iyi duruma getirilmiş (bkz. Tablo reçetesi) denetim boncuk bilinen boyutlarda ve dağılım değerlerini SSC ve FSC ortogonal temsilciliği gösterilir. Boncuk b'de gösterildiği bir PMN-MP örnek ile göreli boyutu karşılaştırması almak için kullanılır (B) insan PMN-MPs izole ve boncuk için tanımlanan koşullara kullanarak Akış Sitometresi tarafından incelendi. Heterojenite MP boyutlarda görülebilir. (C-D) Fare kemik iliği fMLF uyarılmış PMNs türetilmiş MPs Akış Sitometresi tarafından analiz edildi. Temsilcisi akış diyagramları günahı (C) veya Annexin V-(D) MPs. dikdörtgen alan gösterir Annexin V-pozitif MPs (FITC pozitif MPs) lekeli FITC göster. SSC: Yan dağılım; FSC: İleri dağılım; PhS: Phosphatidyl serin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . PMN-MP boyama ve Akış Sitometresi Analizi. (A)Unstained ve (B) Annexin V-FITC ve hCD11b-APC-lekeli MPs. kare alanı içine alan bir Annexin V/CD11b Çift Kişilik olumlu nüfusu PMN-MPs taze izole. (C) insan PMNs (1 x 106) ile floresan bir boya lekeli , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC ve fMLF ile uyarılmış. MPs hücre supernatants izole edildi ve Akış Sitometresi tarafından analiz. Dikdörtgen alan bir N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC olumlu MP nüfus (M-FITC, y ekseni etiket) içine alır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . PMN-MPs bileşimi uyarıcı bağlı. (A)insan PMNs ya IFNγ, TNFα, fMLF, PMA veya latranculin fMLF (LtB-fMLF) tarafından takip B kombinasyonu ile teşvik. MPs elde edilen hücre supernatants ultrasantrifüj tarafından izole edildi ve protein lysates % 1 SDS arabellekte hazırlanmıştır. Proteinler, nitroselüloz membran için transfer, % 10 polyacrylamide jel electrophoretically boyutunda ayrılmış ve bir MMP-9, MPO veya Annexin A1 birincil antikor tarafından uygun HRP Birleşik ikincil antikorlar takip için probed. (B) temsilcisi elektron mikroskobu insan PMN-MPs görüntülerini tasvir heterojenite boyutu. Bir eksozom < 100 nm boyutunda beyaz okla belirtilir. Ölçek çubuğu = 250 nm (sol ve sağ kapı aynası). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: İzole PMN-MPs epitel PMNs rolü eğitim kullanımı yaranın. (A)Caco-2 BBe insan bağırsak epitel hücreleri confluency, çizik yaralı ve tabi hemen sonrası yaralama eklenen 3 milyon PMNs türetilmiş MPs için kaplama. Temsilcisi resimleri (48 saat sonrası yaralama) yara kapatma denetimi (sol kapı aynası) ve epitel hücreleri (doğru panelleri) PMN-MP-tedavi göster. Ölçek çubuğu = 100 µm. (PMN-MPs kolon üzerindeki etkisini incelemek için,B) yara iyileşme vivo içindeizole PMN-MPs doğrudan bir endoskopi tabanlı mikroenjeksiyon sistemi kullanarak yara alan enjekte (24 h sonrası yaralama, kolon yaralanmış anahatları Kesikli çizgi ve enjeksiyon tarafından iğne sitesi beyaz bir okla gösterilir). Yara kapatma biçilen 3 gün sonra (4 gün sonrası yaralama) endoskopik görüntüleme tarafından yapıldı. Ölçek çubuğu 300 µm. (C) = 4 gün fareler sonrası yaralı euthanized ve kolon Mukozal yaralar makasla çıkarılan, optimum kesim sıcaklık (O.C.T) bileşik içinde gömülü ve sıvı azot ile dondurulmuş. Yaralar bölümlerini sekiz mikrometre veya DAPI (mavi) ve Ki67 (kırmızı), toplam ve Proliferasyona epitel hücreleri görselleştirmek E-cadherin (yeşil) ve nükleer leke DAPI (mavi) yeniden epithelialization (üst panelleri) düzeyini değerlendirmek için lekeli yara kenarına (alt panelleri). Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yalıtım ve MPs PMN kaynaklı karakterizasyonu için protokoller bu iletişimde açıklanmıştır. Birkaç anahtar kritik noktaları yordamı başarısı için dikkate alınması gerekir. İlk olarak, PMNs taze izole ve deneyler 2s tecrit içinde kendiliğinden harekete geçirmek ve degranulation önlemek için kullanılan gerekir. Tüm işleme PMNs sırasında yalıtım ve stimülasyon noktasına kadar harekete geçirmek ve erken MP yayın12önlemek için buza gerçekleştirilmelidir. İkinci olarak, Akış Sitometresi göre analiz MPs. üçte biri, peletleme ultrasantrifüj 1 saat veya daha fazla en üst düzeye çıkarır, araç düzgün floresan boncuk aracı tarafından belirtilen (Boncuk türü için belirli bir ayarlanır bir karışımı ile kalibre gerekir enstrüman) doğru MP boyutları tanımlamak için. FSC Boncuk boyutu ile ilgili bir parametre olarak kullanarak akış cytometers bir üretici önerir süre, örneğin, diğerleri SSC boncuk için optimize edilmiştir. Buna ek olarak, MP çözümleme için kullanılacak Akış Sitometresi ile yükseltilmiş elektronik en iyi arka plan gürültü MPs gidermek için donatılmış olmalıdır.
Doğru MPs boyutu parametreleri ek olarak tanımlamak için yukarıdaki yordamlarda da açıklandığı gibi boyama Floresans kullanımı önerilir. Ayrıca, tüm çözümler hazırlanması ve yalıtım sırasında toz parçacıklarının veya satın alma sırasında arka plan gürültü artıran diğer precipitates dahil en aza indirmek için 0,1 µm filtre sistemi aracılığıyla Akış Sitometresi tarafından filtre. Önemlisi, MPs depolama koşulları dikkate alınmalıdır. Küçük kanıt8ve kendi yayımlanmamış gözlemler, buz gibi MP membran rüptürü ve MP kırılma yol açar öneririz. Son olarak, değişen PMN harekete geçirmek ve zamanlama değiştirmek ve MP verim geliştirmek.
Bu yöntemin bazı sınırlamalar vardır. Kemik iliği PMNs fareden yalıtım genellikle saf (~ 85-%90) değil ve diğer bağışıklık hücreleri (öncelikle mononükleer lenfosit) tarafından akış sitometrik çözümlemesi tarafından belirlenen kirlenmiş durumda. Böylece, elde edilen yalıtır diğer bağışıklık hücreleri tarafından yayımlanan MPs az miktarda içerebilir. Alternatifleri mevcuttur ve PMNs yalıtım piyasada bulunan manyetik boncuklar tarafından içerir, ancak, bu uzun ve önemli ölçüde costlier bir prosedür olacaktır. Son olarak, boyutu parametreleri ek olarak, Floresan, etiketleme olmadan kesin farklılaşma MPs toz veya diğer çözünür veya hava parçacıkları örnek kontamine benzer boyutlarda zorlu ve hata eğilimli olduğunu.
Gelecekte, PMN-MPs belirli işaretleri ile etiketli sıralanması MP kompozisyon belirli uyarıcı koşulları veya hastalık modelleri altında aydınlatmak ve umut verici bir biçimde kullanmaya MPs için tanılama işaretleri ve potansiyel tedavi hedefleri tedavi etmek için izin yardımcı olacaktır inflamatuar hastalıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu iletişim ile ilgili her türlü hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Kuzeybatı Feinberg okul, tıp Akış Sitometresi çekirdek işleten Dr. Suchitra Swaminathan teknik yardım için sana şükrediyoruz. Finansman (NIH) DK101675 tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
