Summary
ونحن تصف الخطوات التي تمكن بسرعة في الموقع لأخذ العينات من جزء صغير من خلية مفردة بدقة عالية وغزو الحد الأدنى باستخدام المستندة إلى الشعرية الصغرى-أخذ العينات، تيسيرا لتوصيف المواد الكيميائية للقطة نشاط الأيضي في ويعيش الأجنة باستخدام خلية واحدة مبنية خصيصا التفريد الشعرية ومنصة الكتلي.
Abstract
التحديد الكمي للجزيئات الصغيرة في خلايا مفردة يثير إمكانيات جديدة لتحسين فهم العمليات الأساسية التي تقوم عليها التنمية الجنينية. لتمكين خلية واحدة التحقيقات اللازمة مباشرة في الأجنة الحية، نهج تحليلية جديدة، لا سيما تلك التي الحساسة وانتقائية، والكمية، وقوية وقابلة أن خلية مختلفة الأحجام. نقدم هنا، على بروتوكول يتيح تحليل الأيض في الخلايا المفردة في تطوير أجنة الضفدع المخالب جنوب أفريقيا (ليفيس النمو)، نموذج قوية في الخلية وعلم الأحياء التنموي بحرية في الموقع . ويستخدم هذا النهج ميكروبروبي شعرية لنضح جزء محدد من الخلايا المفردة التي تم تحديدها في الجنين، ترك الخلايا المجاورة سليمة للتحليل اللاحق. يتم تحليل محتوى الخلية التي تم جمعها بواسطة microscale شعرية التفريد اليكتروسبراي تاين (CE-ESI) واجهة بالإضافة إلى مطياف كتلة ذات الدقة عالية جنبا إلى جنب. وهذا النهج قابلة لأحجام مختلفة من الخلية ومتوافقة مع بنية ثلاثية الأبعاد معقدة للجنين النامي. وكمثال على ذلك، علينا أن نظهر أن ميكروبروبي خلية واحدة CE-ESI-MS يتيح الكشف عن تغاير خلية الأيض التي تتكشف كما يثير خلية السلف لاحفاد أثناء وضع الجنين. بجانب الخلية وعلم الأحياء التنموي، البروتوكولات تحليل الخلايا المفردة الموصوفة هنا قابلة لأخرى أحجام الخلية، أنواع الخلايا، أو نماذج حيوانية.
Introduction
ويتطلب فهم شامل للتنمية الجنينية توصيف جميع التغيرات الجزيئية التي تتكشف في كل خلية من الكائن الحي النامي. بينما الجيل التالي "التسلسل" مع التضخيم الجزيئية يمكن قياس أعماق من خلية واحدة ترانسكريبتوميس1 في تطوير نظم2،3، أقل بكثير المعروف عن مجموعة الجزيئات الصغيرة تنتج في الخلايا الجنينية واحد، بما في ذلك البروتينات، ولا سيما، والايضات (الكتلة الجزيئية < دا ~ 1,500). مع استجابة سريعة وديناميكية للأحداث الجوهرية والخارجية، ميتابولومي بمثابة واصف قوية للدولة الجزيئية في خلية. ولذلك، يثير ميتابولومي خلية واحدة، يمكن أن تتبع التنمية المكانية والزمانية لتغاير الخلية في الجنين المبكر وتحديد الجزيئات الجديدة للدراسات الفنية. ومع ذلك، دون تضخيم الجزيئية المتاحة لهذه الجزيئات، يطالب الكشف عن ميتابولومي حساسية استثنائية باستخدام الطيف الكتلي (مللي ثانية)، التي هي التكنولوجيا المفضلة لتحليل المستقلب.
خلية واحدة مرض التصلب العصبي المتعدد هو عبارة عن مجموعة من التكنولوجيات بحساسية كافية لقياس نواتج الأيض في الخلايا المفردة (انظر ملاحظات 4،،من56،،من78،9 ،10،11،،من1213،،من1415). أخذ العينات استنساخه من خلايا وكفاءة الاستخراج من نواتج الأيض ضرورية لنجاح الكشف عن نواتج الأيض في الخلايا المفردة. ومكن تشريح كامل الخلية من الخلايا التي تم تحديدها في الأجنة النمو توصيف الجزيئات الصغيرة والببتيدات16. نهوج أخرى تستخدم ميكروبيبيتيس لأخذ عينات الخلايا الحية الفردية تليها الكشف عن استخدام اليكتروسبراي التأين (ESI) مرض التصلب العصبي المتعدد. على سبيل المثال، تم قياس نواتج الأيض في المصنع أو في خلايا الثدييات خلية واحدة فيديو MS17وضغط التحقيق18، مسبار واحد19وقوة فلويديك المجهري20، بين التقنيات الأخرى21، 22،،من2324. بالإضافة إلى ذلك، يبسط إدماج فصل المواد الكيميائية قبل التأين في سير مرض التصلب العصبي المتعدد الخلايا المفردة كفاءة ميتابولومي، وبالتالي التخفيف من حدة التدخلات المحتملة خلال جيل أيون قبل الكشف. الأهم من ذلك، يوفر الفصل أيضا المعلومات الخاصة بمجمع للمساعدة في التعرف الجزيئي. وقد استخدمت التفريد الشعرية (CE) للكشف عن نواتج الأيض في تشريح واحدة25،26 أو ميكروسامبليد27الخلايا العصبية، التقاط جزيء صغير الاختلافات بين الخلايا العصبية تعمل. ونحن مؤخرا تتكيف CE الترادف ESI MS لتمكين تتبع مستوى الكشف عن مئات من نواتج الأيض في الخلايا الفردية التي تم تشريح من الأجنة في وقت مبكر من النمو لإيفيس16،28. هذه الدراسات كشفت عن اختلافات ايضية الدهشة بين الخلايا الجنينية في مرحلة مبكرة من التنمية، وأدت إلى اكتشاف نواتج الأيض مع سبق الآثار الإنمائية غير معروف16.
هنا نقدم بروتوكول تم تمكين الكشف عن نواتج الأيض في الخلايا المفردة في جنينا فقاريات حية باستخدام ميكروبروبي خلية واحدة CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد29،30مباشرة. نموذج الكائن المختار هو 8-إلى-32-الخلية X. laevis الجنين، على الرغم من أن هذا النهج ينطبق أيضا على المراحل اللاحقة للتنمية وأنواع أخرى من طراز الكائنات الحية. يستخدم هذا البروتوكول شحذ الشعيرات الدموية مع مراقبة متعدية الجنسيات المتعددة المحاور تحت التوجيه بنظام تصوير عالي الدقة لنضح جزء nL ~ 10 من الخلايا التي تم تحديدها في الموقع في الجنين النامي معقدة شكلياً. هذا ميكروبروبي قابلة لخلايا أصغر ويعمل في غضون ثوان، وسريعة بما فيه الكفاية لتتبع الأنساب الخلية في الجنين. بعد استخراج القطبية أو الجزيئات الصغيرة أبولار، مثل نواتج الأيض والببتيدات، من العينة التي تم جمعها في ~ 4-5 ميليلتر استخراج الحل، 10 ~ يتم تحليل nL استخراج الناتجة في منصة CE مبنية خصيصا بالواصلة إلى مطياف شامل دليل الاستدامة الاقتصادية. بناء وتشغيل النظام الأساسي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد يبني على البروتوكولات المذكورة في أماكن أخرى. 31 , 32 هي التي شيدت في واجهة CE ESI co-المحوري كما هو موضح في مكان آخر. 31 هو الإبقاء على هذا النظام الأساسي في نظام الرش مخروط النفاثة لتحقيق مستوى التتبع حساسية مع قدرة على القياس الكمي على مدى 4-5 ترتيب سجل-دينامية (النسبي28،29،30 أو المطلقة16). يوفر النظام الأساسي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد حد أدنى 60-أمول الكشف مع الانحراف المعياري النسبي بنسبة 8 في المائة (RSD) في كوانتيتيشن أكثر من مجموعة اختبار من 10 نانومتر إلى 1 ميكرومتر للجزيئات الصغيرة16، وكافية لتوصيف نواتج الأيض الذاتية في س. ليفيس الخلايا. خلايا ميكروبروبيد الاستمرار في تقسيم تقدم الجنين من خلال تطوير30، مما يسمح بتحليل حل زمنياً ومكانيا الأيض الخلوية. في الواقع، يمكن استخدامها خلية واحدة CE-أي إس أي-مللي ثانية البحث عن الاختلافات الأيضية بين الخلايا التي تشغل الظهرية البطني16،29،16من الحيوانات النباتية، والمحاور الإنمائية28 من اليسار واليمين، فضلا عن الخلايا أن تشكل نسب الأنسجة العصبية الظهرية الطالع من خلية السلف مشترك في X. laevis30. بالإضافة إلى الاستعلام عن الأيض الاختلافات بين الخلايا الجنينية الفردية في مختلف مراحل نمو الجنين X. laevis 30، ونحن نتوقع أن البروتوكولات المذكورة هنا تنطبق على مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية و ميكروسامبليد خلايا مفردة من مراحل مختلفة من التنمية الجنينية، فضلا عن أنواع أخرى من الخلايا والكائنات نموذج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ميكروبروبي ميكروسامبلينج بينما منصة مختلفة متوافقة مع عينات ضئيلة يمكن أن تستخدم لفصل و/أو توصيف الجزيئات الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة البروتوكولات المتصلة بالصيانة ومعالجة النمو ليفيس وافقت عليها لجنة الاستخدام في جامعة جورج واشنطن ورعاية الحيوان المؤسسية (IACUC لا. A311).
1-إعداد العينات الصكوك، ووسائط الإعلام، والمذيبات، وأخذ عينات من الأطباق
- إعداد 1 × الحل شتاينبرغ (SS) بإذابة الأملاح التالية في الماء عالي النقاوة (~18.2 MΩ.cm عند 25 درجة مئوية) في الترتيب التالي وتركيزات المشار إليها بعد معيار البروتوكول33: كلوريد الصوديوم (58.2 مم)، (كلوريد البوتاسيوم 0.67 ملم)، نترات الكالسيوم (0.34 mM) وسلفات المغنيزيوم (0.83 مم)، تريس-هيدروكلوريد (4.19 ملم)، وقاعدة تريس (0.66 ملم). جعل 0.5 x SS من شقين، و 0.1 x SS بعشرة إضعاف إضعاف، من 1 x SS استخدام ماء عالي النقاوة.
- إعداد أطباق أخذ العينات من الأولى مما يجعل نسبة 2% [اغروس] في 1 × سان اﻷوتوكﻻف عند 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة حل. وفي حين لا يزال السائل، معطف الجزء السفلي من أطباق بيتري 60 ملم مع الحل. مرة واحدة [اغروس] هلام تبريده وتوطد، لهب نهاية ماصة باستور ستة بوصة حتى تشكل كرة، وخفة تلمس نهاية ساخنة بصمة 5-10 آبار، ~ 1 مم العميق، إلى [اغروس].
ملاحظة: تستخدم هذه الآبار شل الأجنة أثناء أخذ العينات. - إعداد المستقلب استخراج المذيبات. خياط الخصائص الفيزيائية الكيميائية المذيب (مثلاً، الأقطاب ودرجة الحموضة) لفئات الجزيئات التي موضع اهتمام في الدراسة.
ملاحظة: على سبيل المثال، نستخدم الميثانول 40% والاسيتو الانيتريل 40% في المياه LC-مرض التصلب العصبي المتعدد-الصف كنهج اكتشاف لاستهداف والايضات القطبية أساسا، وعدد قليل من الأيض والببتيدات أبولار28. - جعل حلقات الشعر باستخدام الشعر نظيفة وماصة باستور كما هو موضح في مكان آخر من33 للطف نقل الأجنة في أطباق بتري مع الحد الأدنى من اضطراب.
- اختﻻق ميكروبيبيتيس نصيحة مدبب كما هو مبين في الشكل 1 ألف.
- أولاً، سحب الشعيرات الدموية البورسليكات (1,000/500 ميكرومتر قطرها الداخلي/الخارجي) في ساحبة المشتعلة-براون من نوع شعري مع الإعدادات التالية: الحرارة = 355؛ سحب 65، السرعة = = 80؛ الوقت = 150.
- بعد ذلك، توقف غيض ميكروبيبيتي سحبت باستخدام زوج من غرامة الملقط حادة للحصول على نصيحة شعرية القطر الخارجي من ~ 20 ميكرومتر. تنفيذ هذه الخطوة تحت ستيريوميكروسكوبي للمساعدة على الدقة وإمكانية تكرار نتائج.
ملاحظة: الشعيرات الدموية مع تلميح صغيرة عرضه لانسداد أثناء التطلع للزوجة السيتوبلازم. بينما يساعد الشعيرات الدموية مع تلميح أكبر بالتأكيد تجنب انسداد ونضح أكثر من المحتوى الخلوية، قد تطرح تحديات أثناء أخذ عينات خلايا أصغر كبيرة تحمل الشعيرات الدموية، وربما تلف الخلية لأخذ العينات اللاحقة. التعديل الدقيق للضغط والوقت تطلع قد تخفف جزئيا من هذه التحديات. أننا نجد ميكروبيبيتيس مع ~ 20 ميكرومتر القطر الخارجي مثالية للعمل المقدمة هنا.
2-ميكروسامبلينج واحد الخلايا واستخراج المستقلب
- الحصول على الأجنة (بيضة مخصبة) عن طريق المستحثة تروج التزاوج الطبيعي للكبار ليفيس النمو أو عن طريق الإخصاب في الأنابيب كما هو موضح في البروتوكولات في أماكن أخرى33،34.
ملاحظة: التزاوج الطبيعي يضمن أن مراحل النمو الجنيني هي متداخلة بينما الأجنة التي تم الحصول عليها عن طريق الإخصاب في الأنابيب أكثر موثوقية في العرض. ومع ذلك، يتطلب الإخصاب في الأنابيب التضحية الضفدع الذكور البالغين. - تعد طازجة 2% سيستين ديجيليينج الحل بإذابة 4 جم سيستين في 200 مل الماء عالي النقاوة و dropwise ضبط الحل على درجة الحموضة 8 استخدام حل هيدروكسيد الصوديوم N 10.
- إزالة المعاطف جيلي المحيطة الأجنة لأنها تبدأ تنشق إلى مرحلة 2-خلية على النحو التالي: اسمحوا الأجنة الراحة في الحل ديجيليينج لمدة 2 دقيقة، ثم بلطف دوامة لهم 2 دقيقة إضافية لمنع الأجنة من الانضمام إلى السطح لجمع الطبق.
- بلطف صب محتويات الطبق في كوب نظيف وصب بسرعة حل ديجيليينج من الكأس. فورا وتغطي البيض مع 0.1 x SS شطف المتبقية ديجيليينج الحل، بلطف دوامة، وصب ثم الحل. كرر هذه الخطوة أربع مرات دقة تغسل الأجنة.
ملاحظة: الحد من التعرض للأجنة في حل ديجيليينج إلى 4 دقيقة لضمان السلامة. بروتوكولات شاملة لإزالة المعاطف جيلي متوفرة في أي مكان آخر33. - نقل الأجنة ديجيليد إلى 1 x س في طبق بتري. لتقليل الازدحام داخل اللوحات، وضع الأجنة ~ 100 الواحدة 100 مم طبق33.
ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق التي تحتوي على الأجنة بين 14-18 درجة مئوية إلى إبطاء التنمية والحصول على الأجنة في مراحل تنموية متعاقبة من نفس الوالدين. يتم نشر المزيد من المبادئ التوجيهية في الاعتماد على درجة الحرارة للنمو والتنمية في إكسينباسي وفي أماكن أخرى33،35،،من3637. - فرز ناهضة الأجنة في المرحلة 2-خلية في صحن منفصل في التي تصبغ النمطية ثقة يمثل المحور الظهري البطني، مع الإشارة إلى خلية المنشأة مصير خرائط38،،من3940.
- تحديد الأجنة بشكل صحيح ناهضة بضمان أن تقسم ثلم الانقسام الأول، الذي ديماركس الطائرة ميدساجيتال، حزن (البطني) واستخفاف (الظهرية) مصطبغة القطب الحيوان أن النصفي صور معكوسة41.
- جبل ميكروبيبيتي ملفقة على ميكرومانيبولاتور المتعددة المحاور (يدوي أو التحكم عن بعد). الاتصال ميكروبيبيتي ميكروينجيكتور.
- استخدام ماصة نقل بلاستيك لنضح ~ 5 من 8 خلايا الأجنة ونقلها إلى طبق العينات المحتوية على 0.5 x SS.
ملاحظة: تحديد الخلايا استناداً إلى تصبغ والموقف في الجنين، مع الإشارة إلى خلية مصير خرائط38،،من3940.
ملاحظة: على سبيل المثال، نحن بشكل روتيني نضح ~ 10-15 وحدة التخزين nL من الخلية عن طريق تطبيق نبضات ~ 3-30 psi لشعري. هذا كله خطوة يدوم ~ 5 s لتطلع30.
- أحكام إغلاق القنينة لمنع التبخر ومكان القنينة مرة أخرى في دلو الجليد 4 درجات مئوية حتى اكتمال أخذ العينات. تجاهل ميكروبيبيتي المستخدمة في حاوية الأدوات الحادة لمنع خطر على مخاطر.
ملاحظة: لتحديد حجم محتوى الخلية يستنشق، حقن أسبيراتي في الزيوت المعدنية، حيث يحصل على شكل كروي. ويمكن قياس القطر من هذا المجال باستخدام مجهر. حساب حجم يستنشق: V = 4/3 π ص3، الخامس هو وحدة التخزين، حيث r هو نصف قطر الكرة.
3-قياس م-أي إس أي-MS
- إعداد المعايير والحلول ل CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد
- إعداد اﻻلكتروﻻيت الخلفية (بج) تتكون من 1% حمض الفورميك في المياه الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
- إعداد حل غمد تحتوي على الميثانول 50% في الصف LC-MS المياه و 0.1% حمض الفورميك.
- إعداد 50 نانومتر أستيل الحل في الحل غمد للتقييم اليومي لأداء نظام CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد.
- إعداد الحل كلوريد الصوديوم 150 مم ككتلة-المعايرة القياسية للنطاق المنخفض m/z في وضع أيون إيجابية. كتلة (m/z) دقة < ويوصي 10 أجزاء من المليون. اتبع إرشادات المورد مطياف الشامل القيام بهذه الخطوة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، المعايير الأخرى مع القيم المعروفة m/z يمكن استخدام كتلة معايرة المطياف الشامل.
- بناء منصة CE-ESI
- بناء منصة حقن CE قادرة على ترجمة الرأسي السريع من مرحلة عقد القنينة بج والعينة تحميل ميكروفيال. لتشييد وتشغيل النظام الأساسي، الرجوع إلى التفاصيل في المراجع31.
- تجميع واجهة CE-ESI (الشكل 1 ج) على النحو التالي. جبل باعث اليكتروسبراي معدنية (130/260 ميكرومتر الداخلي/الخارجي ~ 35 مم وقطرها الطول) إلى المنفذ 3 تي-اتحاد. تغذية شعري فصل CE (40/105 ميكرون الداخلي/الخارجي ~ 100 سم وقطرها الطول) عن طريق باعث اليكتروسبراي السماح لها نتا ~ 40-100 ميكرومتر خارج الحافة الباعث. العمل في إطار ستيريوميكروسكوبي للمساعدة في دقة.
- قم بتوصيل الشعرية الحل غمد (75/360 ميكرومتر الداخلي/الخارجي ~ 100 سم وقطرها الطول) المنفذ المتبقية لتوريد حل اليكتروسبراي. استخدام الأكمام المناسبة والإصبع-تشديد اتصالات لعملية خالية من تسرب واجهة CE-دليل الاستدامة الاقتصادية. الإشارة إلى البروتوكولات السابقة31،32 للحصول على تفاصيل في الجمعية العامة، وحل المشاكل لهذه الواجهة.
ملاحظة: يؤثر الأبعاد الشعرية نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S/N) ومدة الانفصال. على سبيل المثال، تيسير الشعيرات تحمل ضيقة وقصيرة سريعة نسخ فصل الألوان باستخدام أعلى فصل الفولتية42،43. بالإضافة إلى ذلك، استناداً إلى أنواع الجزيئات التي موضع اهتمام في دراسة، قد تكون مغلفة فصل الشعيرات الدموية للتقليل من تجنب التفاعلات غير المرغوب فيها شعري جزيء الجدار44.
- قم بتوصيل الشعرية الحل غمد (75/360 ميكرومتر الداخلي/الخارجي ~ 100 سم وقطرها الطول) المنفذ المتبقية لتوريد حل اليكتروسبراي. استخدام الأكمام المناسبة والإصبع-تشديد اتصالات لعملية خالية من تسرب واجهة CE-دليل الاستدامة الاقتصادية. الإشارة إلى البروتوكولات السابقة31،32 للحصول على تفاصيل في الجمعية العامة، وحل المشاكل لهذه الواجهة.
- باستخدام لوحة حامل، تحميل واجهة CE-دليل الاستدامة الاقتصادية إلى مرحلة ترجمة ثلاثة محاور وموقف نصيحة باعث اليكتروسبراي ~ 2 مم من الفوهة مطياف كتلة (الشكل 1 ج).
- لتنظيف مكونات الواجهة، الشطف بإمداد بجي عن طريق فصل CE الشعرية والحل غمد اليكتروسبراي عن طريق باعث اليكتروسبراي في 1 ميليلتر/دقيقة. استخدام المحاقن مضخات لتغذية المذيبات بمعدل ثابت.
- تدفق شعري فصل CE قبل كل قياس عن طريق توصيل حقنه نهاية مدخل الشعرية. استخدام المحاقن كبيرة بما يكفي للتقليل من إعادة الملء وفتيلة من خطوط الإمداد بالمذيبات.
ملاحظة: تجارب عادة استخدام المحاقن 1 مل الغاز محكم لتوريد المذيب غمد اليكتروسبراي وحقنه 500 ميليلتر لمسح شعري الانفصال.
- التحقق من صحة من منصة CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد وقياس نواتج الأيض
ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة لتأكيد حساسية تحليلية الصك CE-أي إس أي-مللي يوميا قبل تحليل مقتطفات خلية واحدة.
- بعد الشطف نقل فصل الشعرية ~ 5 دقيقة، لها مدخل إلى الحل بج يقع في قنينة الفولاذ المقاوم للصدأ.
- ضع طرف باعث اليكتروسبراي ~ 2 مم من الفوهة مطياف كتلة وغرامة في ضبط هذه المسافة باستخدام مرحلة ترجمة لتوليد اليكتروسبراي في نظام مخروط النفاثة مستقرة أثناء مراقبة الرش باستخدام ستيريوميكروسكوبي (انظر المراجع 31،45). رصد استقرار أيون المجموع الحالي (عرة) ~ 30-45 دقيقة لضمان تشغيل مستقر.
- تطبيق ~ 20 كيلوفولت إلى القنينة بجي بتكثف تدريجيا إمكانية ما يزيد على 15 ~ s، عادة توليد ~7.5 µA الحالي عبر الشعرية فصل استخدام حمض الفورميك 1% كما بجي. قبل كل قياس، وضمان استقرار النظام عن طريق رصد الشخصية عرة ~ 5-10 دقيقة، ومن ثم المجوعات انخفاض إمكانية الانفصال (CE) 0 الخامس (الأرض).
ملاحظة: لشبه أتمتة هذه العملية، ونحن استخدام برنامج مخصص مكتوب للتحكم عن بعد في إمدادات الطاقة عالية الجهد م31. إذا كان النظام الأساسي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد غير مستقرة، بعناية تقييم مصدر عدم الاستقرار عن طريق اختبار منهاج CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد أولاً في وضع دليل الاستدامة الاقتصادية فقط وثم في وضع التشغيل CE-دليل الاستدامة الاقتصادية الموصى بها في أماكن أخرى31. بإيجاز، لاختبار منهاج العمل في وضع دليل الاستدامة الاقتصادية فقط، إيقاف في CE عالية الجهد ورصد عرة ~ 30 دقيقة في نظام الرش مخروط النفاثة. إذا لزم الأمر، المضي قدما على النحو التالي لمعالجة الأخطاء: (ط) تفقد اتصالات للتسربات؛ (ثانيا) تنظيف باعث اليكتروسبراي مع الميثانول؛ والمياه، المياه والايزوبروبانول (ثالثا) الغاز إزالة المذيبات؛ (رابعا) تدفق الباعث ل ~ 25 دقيقة قبل إجراء الاختبار مرة أخرى. إذا كان النظام الأساسي CE-إيسي هو العثور على مستقر في وضع دليل الاستدامة الاقتصادية فقط ولكن يصبح غير مستقر خلال فصل CE، تفقد النظام الجول التدفئة و/أو التحليل الكهربائي: (ط) تدفق شعري الانفصال مع بجي ~ 25 دقيقة وكرر التجربة؛ (ثانيا) استخدام إمكانات فصل أقل للحفاظ على استجابة المقاومها خطية (أي، CE الخطي الحالية مقابل منحنى الجهد الفاصل)؛ (ثالثا) تفقد الشعرية CE للأضرار المحتملة، مثل الشقوق، واستبدالها شعري إذا لزم الأمر. - تحليل ~ 6 nL العينة على النحو التالي:
- "الماصة؛" 1 ميليلتر من الحل القياسية أستيل إلى القنينة الحقن.
- نقل الشعرية الانفصال من القنينة بجي إلى القنينة الحقن.
- رفع مرحلة الحقن CE 15 سم في 1s.
- عقد المرحلة مرتفعة 60 ثانية لحقن هيدروديناميكالي ~ 6 nL العينة إلى فصل الشعرية.
- وفي وقت لاحق، ترجمة مرحلة العودة إلى ابتداء من المستويات (تمشيا مع منفذ الشعرية).
- تحرك بلطف نهاية مدخل الشعرية إلى بجي.
- بعد ذلك مباشرة، تكثيف الجهد CE لبدء فصل الغرواني الكهربي.
- الحصول على البيانات MS ابدأ.
ملاحظة: قد اتسم أداء النظام باستخدام أي معيار من المعايير الكيميائية. يسلم CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد خلية واحدة أدنى حدود الكشف في ~ 10 نانومتر (أمول ~ 60) أستيل والحامض الأميني الميثيونين16. حجم حقن (Vاينج)، إلى الشعرية في هولندا، يعتمد على الفرق الارتفاع (H، سم) أثناء الحقن، الكثافة (ρ, سم ز-3) واللزوجة (η, كغ م-1ق-1) من بجي، الطول (L، m) ونصف قطرها (r, ميكرومتر) من CE الشعرية، ومدة الحقن (تياينج، s). يتم التعبير عن هذه العلاقة بالمعادلة التالية، حيث يتم ز (m s-2) تسارع الجاذبية:
- متى تم الكشف عن المعيار، التوقف عن الحصول على البيانات، وانخفاض تدريجي إلى 0 V الجهد الفاصل (الأرض)، ثم استرداد الباعث على 2 سم من الفوهة. تدفق شعري الانفصال لمدة 5 دقائق قبل تحليل استخراج الخلية.
- NL تدبير 10 من خلية واحدة استخراج بتكرار الخطوات 3.3.1-3.3.5 استخدام 90 s لحقن هيدروديناميكالي العينة.
ملاحظة: هو الهدف المتمثل في تجهيز البيانات لتحديد وتقدير حجم المركبات بين الخلايا المفردة. ينشئ البروتوكول CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد خلية واحدة قمم اليكتروفيروجرافيك ضيقة بعرض قاعدة نموذجية لبضع ثوان. عن طريق إجراء تحليل البيانات شبه يدوياً، فمن الممكن العثور على ميزات الجزيئية (قيم فريدة من نوعها m/z مع أوقات الهجرة فريدة من نوعها) باستخدام الخطوات التالية. يتم إظهار انفصال الممثل لتحديد نواتج الأيض التي تم تحديدها في الشكل 2 ألف.
- ملفات البيانات الخام معايرة الكتلة بعد الحصول على البيانات.
ملاحظة: نحن نستخدم إشارات من الصوديوم فورمات المجموعات التي يتم إنشاؤها أثناء فصل أيونات الصوديوم وفيرة من العينة، التي أصلاً موجودة في الخلايا أو المستخرجة من وسائط الثقافة الجنين. والهدف من هذه الخطوة تعزيز هوية المستقلب في خطوات لاحقة بكفالة دقة عالية كتلة (m/z)، ويفضل أن يكون < 5 نجمة داود الحمراء، أو < 10 أجزاء من المليون، بين m/z 50-1، 000. هنا، وظيفة معايرة اقتناء البيانات يجعل من الممكن عادة الحصول على دقة الشامل < 1 جمعية نجمة داود الحمراء، أو < 2 جزء في المليون ل m/z 50-500. - استخدام برنامج نصي لتجهيز، البحث عن السمات الجزيئية على نطاق جماعي تم الكشف عنها. متوسط الأطياف الشامل عبر كل ذروة لتحديد كتلة دقيقة، ويدون أوقات الهجرة المقابلة الخاصة بهم. للتعرف على نواتج الأيض منخفضة الكتلة في نطاق m/z 50-500، استخدم نافذة خطوة 500 جمعية نجمة داود الحمراء لرصد السمات الجزيئية مع S/N > 3.
- دمج الذروة المنطقة-تحت--المنحنى لكل ميزة الجزيئية يدوياً أو تلقائياً. وتستخدم قيم المجال الناتجة كمقياس لوفرة المستقلب.
- تحديد الخصائص الجزيئية للفائدة بثقة عالية على النحو التالي (انظر الشكل
- أولاً، مقارنة كتلة دقيقة من السمات الجزيئية ضد قاعدة المستقلب (مثلاً، ميتلين46 و47من همدب) بدقة 10 أجزاء من المليون للحصول على قائمة بالتطابقات الجماعية المفترضة.
- وبعد ذلك، تقييم هذه المباريات الجماعية بمقارنة الطيف الشامل جنبا إلى جنب على الحصول عليها من الخلية تقاس مقتطفات مع البيانات المتاحة في قواعد البيانات المستقلب أو الطيف الشامل جنبا إلى جنب للمادة الكيميائية المقابلة القياسية.
- وأخيراً، التحقق من صحة هذه التعيينات بمقارنة وقت الترحيل من السمات الجزيئية المسجلة في مقتطفات الخلية مع المعايير الكيميائية المتصلة بتحليلها من قبل نفس الصك CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد.
ملاحظة: لتعزيز الإنتاجية التجريبية، نحدد عادة فقط السمات الجزيئية مختلفة شكل يعتد به إحصائيا بين الظروف التجريبية أو أنواع الخلايا. تظهر تعريفات الممثل في الشكل 2. لتحديد نواتج الأيض مع درجة عالية من الدقة الشامل، نوصي خارجياً معايرة مطياف كتلة يوميا، إجراء تقويم في الوقت الحقيقي أثناء كل قياس استخدام معيار داخلية و/أو خارجياً الجماهيري معايرة كل قياس ينصح باقتناء البيانات بعد انتهاء الملف (مثلاً، لمجموعات فورمات الصوديوم هنا).
ملاحظة: في تجاربنا، استخدمت منصات البرمجيات على الإنترنت47 للقيام بكافة الخطوات لتحليل البيانات اللاحقة، بما في ذلك الخطوات التالية: أنا) تصفية السمات الجزيئية بالتواجد في 50 في المائة على الأقل من كل مجموعة العينات (مثلاً، الخلية نوع)؛ ثانيا) تطبيع البيانات؛ ثالثا) الإحصائية (مثل، تي-اختبار) وتحليل بيانات متعددة المتغيرات، مثل تحليل العنصر الرئيسي (PCA) وتحليل مجموعة هرمية (HCA). نحن نستخدم ف < 0.05 (الطالب t-اختبار) الاحتفال بدلالة إحصائية وتجليد-تغير ≥ 1.5 ملاحظة الأهمية البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمنا مؤخرا خلية واحدة ميكروبروبي CE أي إس أي-مللي ثانية لتوصيف نواتج الأيض في الخلايا الفردية التي تم تحديدها في تطوير بحرية النمو laevis الأجنة29،30. يمكن ميكروبروبي سريع (~ 5 ثانية/الخليوي)، في الموقع تطلع ~ 10 nL من خلية مفردة، وتطلعات متعددة من نفس الخلية، أو عدة خلايا مختلفة ضمن مراحل تطور الجنين يعيش (الشكل 1b) نفسه أو في وقت لاحق. يتم استخراج المحتوى الخلوية يستنشق استخدام مذيب مناسب ونواتج الأيض ثم تفصل والمتاين باستخدام واجهة CE ESI المواصفات والكشف عنها بواسطة السيدة Typically، النهج الذي تعطي إشارات المستقلب نونريدوندانت ~ 300 (بعد إزالة النظائر المشعة والكتلة الذري) من كل خلية. ويتمثل الفاصل لتحديد الجزيئات في الشكل 2a. حددنا إشارات مختلفة 70 بثقة عالية كالصغيرة والايضات القطبية، استناداً إلى وقت الترحيل واستخراج MS/MS تجزئة أنماط الخلية إشارات، مقارنة مع تلك من معيار أو من المكتبات الجماعية الطيفية جنبا إلى جنب. على سبيل المثال، يوضح الشكل 2b تحديد ثقة من الحامض الأميني على أساس المزيج من هذه القطع متعامد للمعلومات.
ميكروبروبي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد يسمح للتحديد الكمي الأيض الاختلافات بين الخلايا المفردة. وقد CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد التكرار كمية 8 تحديد مركز اللاجئ استناداً إلى مجالات الذروة تحت المنحنى في تحديد أيون اليكتروفيروجرامس16،30%. مع أخذ العينات ميكروبروبي، هو هذه التقنية إمكانية تكرار نتائج تحديد وضع اللاجئ 14%30، وكافية للاستعلام النشاط الأيضي الاختلافات بين الخلايا بدلالة إحصائية والبيولوجية. ويبين الشكل 3 على سبيل مثال، مكن أن ميكروب CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد في الموقع الصغير-أخذ العينات من الظهرية ثلاثة أنواع الخلايا (الشكل 3a). وعلاوة على ذلك، كشفت محكمة التحكيم الدائمة للبيانات الوصفية الكمية التغيرات الاستقلابية كخلية السلف التي تم تحديدها للجنين 8 خلايا (الخلية انظر D1R) مقسمة شكل استنساخ خلية في الخلية-16 (انظر D11R الخلية) والجنين (الخلايا D111R) 32-الخلية (الشكل 3b). تظهر الاتجاهات الممثل لتحديد نواتج الأيض في الشكل 3 جيم. والايضات مثل أستيل انخفض في وفرة مع انقسام الخلية، بينما ترولاميني وسر-الأرجنتين وأظهرت اتجاهات معاكسة في هذه الخلية أنواع. انخفض في وفرة من 8-إلى الجنين 16-خلية ترولاميني وثم أصبحت أثري في الجنين 32-الخلية، بينما يصور Ser-الأرجنتين اتجاه معاكس بزيادة للجنين 16-الخلية قبل التناقص في الجنين 32-الخلية. ارجينين لم تتغير إلى حد كبير في وفرة بين هذه المراحل الخلية. من المتوقع أن يلقي مزيدا من الضوء على العمليات الأساسية التي يرتكز عليها في مرحلة مبكرة من X. laevisهذه الاتجاهات.
الشكل 1: سير العمل التجريبي في الموقع ميكروبروبي الخلايا المفردة الشعرية التفريد (CE) الطيف الكتلي (مللي ثانية)- (أ) الملفقة ميكروبيبيتيس (أعلى) قبل و (أسفل) بعد ناهضة في التلميح إلى 20 ميكرومتر القطر الخارجي للاستخدام في ميكروسامبلينج. ميكروسامبليد (ب) تطوير خلايا تابع لتقسيم 8 خلايا الجنين إلى مرحلة 16 خلية، وافتتاح مرحلة الدراسات في فيفو . (ج) أخذت عينات الخلايا المفردة تتحدد باستخدام ميكروبروبي (µP) في 8-خلية الجنين ليفيس النمو (انظر V1R و D1R الخلايا)، والايضات خلية استخراجها وتحليلها باستخدام "مقياس" CE-السيدة أشرطة = 250 ميكرومتر (حلول الظلام/الرمادي)؛ 10 مم (أبيض). المفتاح: SP، مضخة الحقن. (الأرقام تكييفها مع الحصول على إذن من المراجع29،30). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ميكروبروبي خلية واحدة CE-مرض التصلب العصبي المتعدد يتيح تحديد ثقة من نواتج الأيض. (أ) ممثل اليكتروفيروجرام لتحديد نواتج الأيض التي تم تحديدها. (ب) تحديد الحامض الأميني استناداً إلى مقارنة وسائل دقيقة ووقت الهجرة، وتجزئة البيانات (التفكك الناجم عن الاصطدام) ضد المستقلب القياسية. المفتاح: 1، الحامض الأميني الميثيل؛ 2، هوموليسيني؛ سام، S-أدينوسيلميثيونيني؛ اورن، أورنيثيني؛ الشاي، إثيل؛ سيارة، كارنيتيني؛ أكتشو، أستيل؛ أككار، أسيتيلكارنيتيني؛ هبكس، هيبوكسانثيني؛ المدفع جريازيف، الجلوتاثيون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الفروق الأيضية الكمية بين الخلايا المفردة التي تشكل نسب الظهرية في X. laevis- (أ) الصور الضوئية للخلية السلف D1R 8 خلايا الجنين، وتوابعه والخلية D11R في الجنين 16-الخلية والخلية D111R في الجنين 32-الخلية. (ب) الرئيسية تحليل مكون (PCA) لنواتج الأيض كمياً في هذه الأنواع الثلاثة خلية الكشف عن ملامح ايضية مختلفة. كل نقطة بيانات تشير إلى خلية أخرى (انظر أرقام) التي تم قياس في replicates التقنية (نقطة اتصال). علامة الحذف الثقة 95%. (ج) تحليل التباين (ANOVA) وتحليل المميزة على الأقل أهمية الوظيفة المخصصة فيشر يكشف عن اتجاهات الأيضية المعقدة عبر مراحل الخلية. لقطع مربع، يعني مربعة وهو مربع الخطأ المعياري × 1 يعني (SEM) وهو الخط الطولي 1.5 × مفتاح sem.: *ف < 0.05؛ ns، لا يوجد فرق كبير. تغيير حجم أشرطة = 250 ميكرومتر. (الأرقام تكييفها مع إذن من المرجع30). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميكروبروبي CE-ESI-MS يمكن وصف مباشر من نواتج الأيض في الخلايا المفردة في لايف، بحرية وتطوير الأجنة. في صميم النهج هي المكونات الفرعية التقنية اثنين، هما في الموقع ميكروسامبلينج الشعرية وحساسية عالية CE-ESI-السيدة "بالمقارنة" بتشريح كامل الخلية، ميكروسامبلينج الشعرية في استفادة عملية سريعة (بضع ثوان مقابل 5 دقيقة والخلية بتشريح)، التوافق مع مورفولوجية ثلاثية الأبعاد المعقدة للأجنة، وقابلية للخلايا الصغيرة التي تشكل في مراحل لاحقة من التنمية. خلافا للتشريح، أخذ العينات ميكروبروبي يترك الخلايا الأخرى الموجودة في الجنين سليمة للتحليل اللاحق. الفضول، ميكروسامبليد الخلايا يمكن أن تستمر الفجوة، رفع إمكانية لدراسات طويلة الأجل لتمايز الخلايا. كما يتيح القدرة على التحكم في حجم تلميح ميكروبروبي ميكروبروبي CE أي إس أي-مللي ثانية لتكون بمثابة أداة متعددة الاستخدامات لدراسة دور الأيض في الخلايا والعمليات الإنمائية باستخدام الكائنات الحية الأخرى النموذجية، بما في ذلك الزرد والماوس. ولضمان مصداقية النتائج، من الأهمية بمكان أن الخلايا ذات الاهتمام تحديداً ودقة، واستمرار تحديد وأخذ عينات منها. معلمات التجريبية لتطلع (مثلاًوالأبعاد الشعرية والضغط والوقت) يمكن تكييفها للعينة المطلوب جزء من خلية. بالإضافة إلى ذلك، من المهم لشل الأجنة لزيادة الدقة في استهداف الخلية ذات الاهتمام، مما يقلل بدوره من الضرر للجنين. في هذا البروتوكول، قمنا بإنشاء الآبار داخل [اغروس] المغلفة أطباق بيتري شل الأجنة أثناء أخذ العينات. في تجربتنا، الشعيرات الدموية مع نصائح مشطوف ضمان الحد الأدنى من الضرر للخلية مقارنة بنصائح كليلة. كذلك ستمكن التحسينات في الإنتاجية لتحليل العينات والكيميائية توصيف أعدادا كبيرة من الخلايا، وبالتالي تمكين التحليل الإحصائي لتحديد نواتج الأيض الأهمية الأساسية للخلية والعمليات الإنمائية.
والغرض من CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد تمكين توصيف ميتابولومي في تتبع مستوى حساسية. CE يوفر مزايا مكملة للدراسات خلية واحدة أكثر تقنيات فصل شعبية أخرى، مثل نانو-تدفق السائل اللوني أو الفصل اللوني للغاز. CE يوفر كفاءة الفصل رائعة لمعالجة ميتابولومي المعقدة. الأبعاد المادية من CE متوافقة مع عينات محدودة الحجم التي تنتج من خلايا مفردة. بالإضافة إلى ذلك، توجد تقنيات مختلفة لتخصيب اليورانيوم في CE (مثلاً، تضخيم حقل نموذج التراص أو دينامية مفرق pH) بريكونسينتراتي العينة على العمود، ومن ثم تعزيز الكشف عن حساسية. دراسات ناجحة، ينبغي أن تتسم الصك CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد والتحقق من صحة يوميا. على سبيل المثال، نحن بحاجة S/N على الأقل 3 لامول 60 من أستيل القياسية (6 nL من 50 نانومتر معيار حقن) وإمكانية تكرار نتائج من < 5% تحديد وضع اللاجئ في الوقت الفاصل (الهجرة) و < 25% تحديد وضع اللاجئ في التقدير الكمي استناداً إلى ذروة المجال-تحت--المنحنى في اليكتروفيروجرامس أيون المحددة لهذا المعيار. الكشف المراعية للتتبع والقياس الكمي الحيوي يسهل قياس أنواع مختلفة من نواتج الأيض (والببتيدات) التي تغطي مجموعة واسعة من التركز في خلايا مفردة استخدام CE-ESI-MS6،،من1625 , 31-بينما نحن كشف روتيني ~ 300 مختلفة إيجابيا يحمل إشارات المستقلب، CE-مرض التصلب العصبي المتعدد أيضا متوافقة مع التأين السلبي وضع48، وبالتالي تعزيز عمق الجزء ميتابولومي خلية واحدة قابلة للاكتشاف.
على الرغم من أن X. laevis تقدم العديد من المزايا في إنشاء هذه التكنولوجيا لدراسة التنمية، ميكروبروبي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد قد تكون أيضا قابلة للتكيف لأنواع أخرى من طراز الكائنات الحية. في تصبغ النمو، وحجم الاختلافات بين الخلايا جنبا إلى جنب مع الخلية استنساخه بمصير خرائط49 يجعل من الممكن تحديد خلايا معينة مع مصائر النسيج المعروفة. هذا، بدوره، يفتح الباب أمام اكتشاف أو استهدفت التجارب الأيضية للخلية بأكملها الأنساب كخلايا تقوية البرامج التنموية المختلفة نحو التمايز. لإزالة الخلافات التي تنشأ بسبب دورات خلية متفاوتة، ينبغي السماح الأجنة لتقسيم كامل للمرحلة القادمة قبل أخذ العينات، كما هو موضح في مكان آخر من50. ميكروبروبي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد قابلة للتكيف للتلاعب الجنينية الكلاسيكية أو الأدوات الجزيئية (مثلاً، تدق الجينات خارج/لأسفل) لاختبار أهمية إنمائية من الجزيئات الصغيرة مع التقلبات الكبيرة بين تحديد الخلايا أو أنواع الخلايا . على سبيل المثال، مزيج جميع الخلايا المفردة مع تتبع مصير الخلية عن طريق التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء أدت إلى اكتشاف نواتج الأيض مع سبق الآثار الإنمائية غير معروف16.
خلية واحدة جميع الدراسات تدعو إلى الحرص على الاهتمام بالتفاصيل التحليلية، لا سيما في حالة التحديد الكمي؛ لدينا التكنولوجيا ليست استثناء. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تقيم بعناية كل خطوة سير العمل إعداد نموذج للتقليل من احتمال تدهور و/أو فقدان والايضات الذاتية أو تلوث للعينات. ينصح باستخدام المذيبات يشوه عالية النقاء (مثلاً، الصف LC/MS)، الأحماض أو القواعد، ودرجات الحرارة المنخفضة (~ 4 درجة مئوية) إخماد نشاط الإنزيمات والتخفيف من تجنب التغيرات الأيضية للعينات قبل التحليل الآلي6 , 51-حلول بسيطة العضوية على أساس الميثانول والاسيتو الانيتريل تسمح كفاءة الاستخراج من نواتج الأيض القطبية الصغيرة28. وبطبيعة الحال، تستفيد التجارب التي تستهدف فئات محددة من نواتج الأيض (مثلاً، مركبات أبولار، والدهون) الخياطة تشكيل المذيبات استخراج مسبقاً. على سبيل المثال، أظهرنا مؤخرا أن يحسن استخدام أنواع متعددة من استخراج المذيبات تغطية ميتابولومي خلية واحدة28. ويمكن تيسير التحديد الكمي لهذه المستقلبات بالمعايير الداخلية، مثل والايضات نظير مسماة، التي قد تكون ارتفعت إلى المقتطفات أثناء استخراج المستقلب. المعايير الداخلية أيضا مفيدة في ضمان الجودة للخطوات استخراج والقياس، وبالتالي تيسير تقييم إمكانية تكرار نتائج التقنية والنظام والانتعاش لتحليلها عينة. آخر، وندعو ليتطابق البيولوجية (خلايا مختلفة ويستنشق من أجنة مختلفة) مع كل خلية تم تحليلها في replicates التقنية (استخراج نفس قياس عدة مرات) لمساعدة قوة إحصائية وتفسير النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة منح GM114854 (إلى ب. ن.) ومنح CA211635 (إلى ب. ن.) وارنولد بيكمان مابل مؤسسة بيكمان الشباب المحقق (إلى ب. ن.)، جائزة أستاذ الشباب دوبون (إلى ب. ن.)، "الجمعية الأمريكية" للإعلام جائزة بحوث قياس الطيف الكتلي (إلى ب. ن.)، و "مؤسسة نادي" كوزموس زمالة (R.M.O. و E.P.P.). الآراء والاستنتاجات الواردة في هذا المنشور هي فقط تلك التي المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لمصادر التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 - 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
References
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
- Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
- Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
- Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
- Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
- Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
- Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
- Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
- Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
- Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
- Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
- Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
- Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
- Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
- Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
- Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
- Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
- Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
- James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
- Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
- Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
- Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
- Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
- Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
- Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
- Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
- Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
- Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).
