Summary
高精度、キャピラリーを用いたマイクロ サンプリングを使用して代謝活動のスナップショットの化学的特性を容易に最小の侵入の個々 のセルの小さな部分の高速の場サンプリングを有効にする手順を述べる。特注の単一セルのキャピラリー電気泳動と質量分析プラットフォームを用いた胚を住んでいます。
Abstract
単一細胞における小分子の定量化は、萌芽期の開発の根底にある基本的なプロセスを理解の新たな可能性を発生させます。異なるセルのサイズは、敏感な選択的、定量的、堅牢で、スケーラブルな特に有効にする単一セル調査で直接ライブ胚、分析の新しいアプローチが必要です。ここでは、自由に南アフリカ爪カエル (アフリカツメガエル)、細胞および進化の生物学の強力なモデルの胚の開発に単一細胞における代謝の場解析を可能にするプロトコルを提案する.このアプローチは、隣接する細胞そのままその後の分析のための胚の単一の識別されたセルからの定義された部分を吸引するキャピラリー マイクロ プローブを使用します。高解像度のタンデム質量分析計を結合マイクロ キャピラリー電気泳動エレクトロ スプレー イオン化 (ESI-CE) インターフェイスによって収集されたセルの内容が分析されます。このアプローチは様々 なセル サイズにスケーラブルな成長の胚の複雑な三次元構造と互換性があります。たとえば、そのマイクロ プローブによる単一細胞 MS-CE により繰り広げられる前駆細胞は胚の開発の間に子孫を生じ、代謝細胞の多様性の解明を紹介します。細胞・発生生物学、以外にもここで説明した単一細胞解析プロトコルは、他のセル サイズ、セル種類、または動物モデルに従う。
Introduction
萌芽期の開発の包括的な理解には、発展途上の生物のすべてのセルに展開するすべての分子変化の特性評価が必要です。単一細胞トランスクリプトーム1開発システム2,3, かなり少ないの深い測定がより小さい分子のスイートについて知られている分子の増幅による次世代シーケンスが可能タンパク質と、特に、代謝産物などを含む単一の胚細胞で生産される (分子量 < 〜 1,500 Da)。組み込みと外因性のイベントに速い動的応答、メタボロームをセルの分子状態の強力な記述子として提供しています。したがって、単一細胞メタボロームは初期胚における細胞多様性の空間的で、一時的な開発を追跡する、機能研究のための新しい分子を識別する可能性を発生させます。しかし、これらの分子の分子増幅せず、メタボロームの検出要求卓越した感度の代謝物質の分析のための選択技術である質量分析法 (MS) を使用します。
単一セルの MS は (参照してくださいレビュー 4,5,6,7,8,9 単一細胞における代謝物の測定に十分な感度と技術のコレクション ,,1011,12,13,14,15)。細胞の再現性の高いサンプリングと代謝産物の効率的な抽出成功した単一細胞における代謝物の検出に不可欠です。アフリカツメガエル胚から細胞を特定の細胞解離は、低分子化合物やペプチド16の特性を可能にしました。他のアプローチは、エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) MS を用いた検出続く個々 の生きているセルのサンプルをマイクロ ピペットを採用しています。たとえば、代謝物は流体力顕微鏡20、その他技術21、間、単一のプローブ19, 圧力プローブ18単一セル ビデオ MS17によって植物や哺乳類細胞で測定しました。 22,23,24。さらに、単一セルの MS ワークフローにイオン化する前に化学分離の定款は効率的にメタボローム、したがって検出前にイオン生成中に潜在的な干渉を軽減することを簡素化します。重要なは、分離はまた分子の同定を支援する化合物に固有の情報を提供します。キャピラリー電気泳動 (CE) は、単一切り裂かれた25,26または microsampled27ニューロン、ニューロン表現型の小分子の違いをキャプチャの代謝物を検出するために使用されています。我々 は最近、ESI タンデムアフリカツメガエル16,28の初期胚から切除した個々 の細胞における代謝物の何百ものトレース レベルの検出を有効にするには、MS に CE を適応しました。これらの研究は驚くべき代謝開発の初期段階に胚細胞の違いを明らかに、不明な発達影響16以前と代謝産物の発見につながった。
ここでは、直接マイクロ プローブによる単一細胞 CE ESI MS29,30を使用して生きている脊椎動物の胚の単一細胞における代謝物の検出を有効にするプロトコルを提供します。選択モデル有機体はセル 32 にまでの制限 8 X. laevis胚のアプローチが開発、その他各種モデル生物の後の段階に適用されるも。このプロトコルは、識別された細胞その場で形態学的に複雑な胚での ~ 10 nL 部分を吸引するのに高解像度イメージング システムによる多軸並進制御の指導の下でのシャープの毛細血管を使用します。このプローブは、小さいセルまで拡張可能、胚における細胞系譜を追跡するために十分な速さである数秒以内に、動作します。極の抽出や極冠小分子、代謝産物など 4 〜 5 で収集したサンプル由来のペプチドの後ハイフン ESI 質量分析計と特注の CE プラットフォームで得られた抽出液の nL を分析 ~ 10 μ L 抽出ソリューション。CE ESI MS プラットフォームの構築と運用は、他の場所で説明されているプロトコルに基づいています。31,32コーアクシャル CE esi は他の場所で説明されているように構築されます。31 4-5 ログ順ダイナミック レンジ (相対28,29,30 で定量化のための機能を備えたトレース レベルの感度を達成するためにコーン ジェット スプレー政権でこのプラットフォームを維持します。または絶対16)。CE ESI MS プラットフォームが 10 のテスト範囲で定量で 8% 相対標準偏差 (RSD) で検出下限 60 amol を提供しています小さな分子の16 X の内因性代謝物の特性を十分である 1 μ M に nM。学細胞。Microprobed 細胞は胚開発30、細胞代謝の時間的、空間的分解解析を可能にするにつれて分裂し続けます。確かに、単一セル MS-CE は代謝の違いの背腹軸16,29、動物植物16、および左右28発達軸だけでなく、セルを占有するセルを検索する使用ことができます。X. laevis30の共通前駆細胞から神経組織運命背側系統を形成します。ここで説明されているプロトコルは、生体分子の広範な配列に適用されることを期待してX. laevis胚30のさまざまな発達段階で個々 の萌芽期細胞の代謝の違いを照会するほか、単一細胞 microsampled 細胞やモデル生物の他の種類と同様に、萌芽期の開発のさまざまな段階から。さらに、分離や生体分子の特性の非常に小さいサンプルと互換性のある別のプラットフォームを使用できますが、特定のため、プローブが使用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
保守に関連するすべてのプロトコルとアフリカツメガエルの取り扱い機関動物ケアとジョージ ・ ワシントン大学で利用委員会によって承認された (IACUC ないです。A311)。
1. 機器、メディア、溶剤をサンプリングし、料理をサンプリングの準備
- 次の順序で純水 (~18.2 MΩ.cm 25 ° C で) 次の塩を溶解することによりスタインバーグのソリューション (SS) × 1 を準備し、標準に従って指定された濃度でプロトコル33: 塩化ナトリウム (58.2 mM)、塩化カリウム (0.67 mM)、硝酸カルシウム (0.34 mM)、硫酸マグネシウム (0.83 mM)、トリス塩酸 (4.19 mM)、トリス基地 (0.66 mM)。0.5 × 2 倍で SS と 0.1 x 1 の 10 倍の希釈で SS SS 超純水を使用して x。
- SS. オートクレーブ 120 ° C で × 1 で作る最初の 2% の agarose によって溶解するのに 20 分間サンプリング料理を準備します。静止液体中のソリューションと 60 mm ペトリ皿の底をコートします。Agarose のゲルが冷却されて固化後炎 6 インチ パスツール ピペットの最後のボールを形成し、軽く agarose に 5-10 井戸、〜 1 mm の深さをインプリントする温水の端に触れるまで。
注: これらの井戸は、サンプリング中に胚を固定する使用されます。 - 代謝物抽出溶媒を準備します。(例えば、極性および pH) 溶媒の物理化学的性質を分子研究に関心のあるクラスに調整します。
注: たとえば、我々 40% メタノールと使用 LC MS グレード水 40% アセトニ トリル発見アプローチとしてターゲットに主に代謝物といくつかの極冠代謝産物とペプチド28。 - きれいな髪とも優しく最小限の摂動をペトリ皿に胚を移動するための33のパスツール ピペットを使用して髪のループを作る。
- 図 1 aに示すように、テーパー チップ マイクロ ピペットを作製します。
- 最初に、次の設定で燃えるようなブラウン タイプのキャピラリー引き手でホウケイ酸毛細血管 (1,000/500 μ m 外径/内径) を引く: 熱 = 355;プル速度 65 を = = 80。時間 = 150。
- 次に、断絶するキャピラリー先端 〜 20 μ m の外径、精度と再現性を支援するために顕微鏡下でこの手順を取得する高級シャープな鉗子のペアを使用して引っ張られた micropipette の先端。
注: 先端に小さな毛細血管、細胞質の粘性の吸引時に目詰まりを起こし。大きなヒントと毛細血管は確かに目詰まりを避けるために、携帯電話コンテンツの吸引を助ける, 大口径毛細血管がより小さい細胞のサンプリング中に課題を提起、その後サンプリング用のセルを破損する可能性が。慎重に圧力と吸引の時間は部分的にこれらの課題を軽減するかもしれない。我々 はここで示した作業の理想的な 〜 20 μ m 外径用マイクロ ピペットを見つけます。
2. 特定の単一細胞と代謝物抽出
- アダルトアフリカツメガエルの性腺刺激ホルモンによる自然交配を通じて胚 (受精卵) を取得または体外受精の説明に従って経由でプロトコルの他の場所で33,34。
注: 自然交配により、体外受精によって得られた胚は供給でより信頼性の高い、胚の発育段階が時間をずらしています。ただし、体外受精は、大人の男性のカエルを犠牲にする必要があります。 - 新鮮なシステインの 4 g を 200 mL の純水に溶解して 2% システイン dejellying ソリューションを準備し、滴下 pH 8 10 N 水酸化ナトリウム溶液を使用するソリューションを調整します。
- 2 細胞期に劈開は次のように開始すると胚を囲むゼリー コートを脱ぐ: 胚は 2 分のための dejellying ソリューションの残りの部分し、胚がコレクションの表面に付着するを防ぐためにさらに 2 分のためにそれらを軽く旋回させる料理。
- 優しく料理内容をきれいなビーカーに注ぐし、すぐにビーカーから dejellying のソリューションをデカントします。0.1 x で卵をすぐにカバー残りを洗い流す SS dejellying ソリューション、ゆっくり旋回し、デカントのソリューション。胚を徹底的に洗浄する 4 回のこの手順を繰り返します。
注: は、胚の生存性を確保するため 4 分 dejellying ソリューションへの露出を制限します。ゼリーのコートを削除する包括的なプロトコルが別の場所で33。 - 1 にゼリーの胚を転送ペトリ皿で SS x。プレート内混雑を最小限に抑える、100 mm ディッシュ33あたり 100 〜 胚を配置します。
注意: 開発を遅くし、同じ両親から千鳥の発達段階で胚を取得 14-18 ° C の間の胚を含んでいる皿を格納できます。成長と発展の温度依存性についてはさらに、Xenbase と別の場所に公開33,35,36,37。 - 自信を持っているステレオタイプ的な色素沈着の別皿に 2 細胞期の胚を切断の並べ替えは、背腹軸、細胞運命地図38,39,40を参照してをマークします。
- 最初の胸の谷間の溝は、正中矢状面に境界を定めます、二等分する正しく切断胚を識別、暗く (腹側) と軽く動物極ピグメント (背側) 2 つの半分が鏡像41をされるようです。
- 多軸マイクロマニピュレーター (手動またはリモートで制御される) で作製したマイクロ ピペットをマウントします。マイクロ ピペットに接続します。
- 5 〜 8 細胞期胚を吸引し、0.5 を含むサンプリング皿に転送する転送プラスチック ピペットを使用して x の SS。
注: は、色素沈着と細胞運命地図38,39,40を参照しての胚の位置に基づいてセルを識別します。
注: たとえば、我々 定期的に吸引 10 〜 15-30 psi の ~ 3 パルスを毛細血管に適用することによりセルから nL ボリューム。この全体のステップの持続 〜 5 吸引30s。
- 蒸発を防止し、サンプリングが完了するまで 4 ° C の氷のバケツにバイアルを配置するバイアルをしっかりと閉じます。針刺しの危険性を防ぐために鋭利な容器に使用されるマイクロ ピペットを破棄します。
注: 吸気セルの内容のボリュームを決定するには、鉱物油、球形の形を得るところに、吸引を挿入します。この球の直径は、顕微鏡を使用して測定できます。吸気量を計算: V = 4/3 π r3、 Vはボリュームあり、 rは球の半径です。
3. CE ESI MS 測定
- MS-CE の標準とソリューションの準備
- LC MS グレード水の 1% ギ酸から成る背景電解質 (BGE) を準備します。
- LC MS グレード水と 0.1% ギ酸で 50% メタノールを格納する鞘ソリューションを準備します。
- 毎日 CE ESI MS システムの性能評価のためシース液 50 nM アセチルコリン ソリューションを準備します。
- ポジティブ イオン モードで低m/z範囲の質量校正用標準として 150 mM 塩化ナトリウム溶液を準備します。質量 (m/z) 精度 < 10 ppm をお勧めします。この手順を実行する質量分析計のベンダーの指示に従います。
注: また、知られているm/zの値とその他の標準使用できます質量 - 質量分析計を校正します。
- CE ESI プラットフォームの構築
- BGE バイアルと microvial を読み込むサンプルを保持してステージの急速な並進できる CE 射出プラットフォームを構築します。建設とプラットフォームの操作で、参照31の詳細を参照してください。
- CE ESI インターフェイス (図 1 c) をアセンブルするには、次。3 ポートの T 組合にエレクトロ金属エミッタ (130/260 μ m 内側/外側の直径と 〜 35 mm 長さ) をマウントします。40 ~ 100 を突出することができますエレクトロ スプレー エミッタを分離 CE キャピラリー (40/105 μ m 内側/外側の直径と 〜 100 cm 長さ) を送り、エミッタの先端を越えて μ m。精度を支援するために顕微鏡の下で働きます。
- シース ソリューション毛細血管 (75/360 μ m 内側/外側の直径と 〜 100 cm 長さ) をエレクトロ スプレー ソリューションを供給する残りのポートに接続します。適切なスリーブを使用して、CE の esi の漏れのない操作の接続を指締めます。以前プロトコル31,32アセンブリとこのインターフェイスのトラブルシューティングの詳細についてを参照してください。
注: 毛細管の寸法に影響を与える信号対雑音比 (S/N) と分離の期間。たとえば、管狭穴、短いは高い分離電圧42,43を使用して高速分離を促進します。さらに、研究で興味の分子の種類に応じて分離毛細血管は不要な分子毛細血管壁相互作用44の最小化/回避にコーティングする可能性があります。
- シース ソリューション毛細血管 (75/360 μ m 内側/外側の直径と 〜 100 cm 長さ) をエレクトロ スプレー ソリューションを供給する残りのポートに接続します。適切なスリーブを使用して、CE の esi の漏れのない操作の接続を指締めます。以前プロトコル31,32アセンブリとこのインターフェイスのトラブルシューティングの詳細についてを参照してください。
- プレート ホルダーを使用すると、3 軸翻訳舞台に esi CE をマウントし、エレクトロ スプレー エミッタ先端から質量分析計のオリフィス (図 1 c) 〜 2 mm を配置します。
- インターフェイスのきれいなコンポーネントに 1 μ L/分でエレクトロ スプレー エミッタを静電シース ソリューションとキャピラリーの CE 分離による BGE を指定してすすいでください。シリンジ ポンプを使用して、一定の速度で溶剤をフィードします。
- キャピラリーの入口側に注射器を接続して各測定前に CE 分離キャピラリをフラッシュします。補充と溶媒供給ラインのプライミングを最小限に十分に大きな注射器を使用します。
注: 実験通常エレクトロ スプレー鞘溶媒と分離キャピラリをフラッシュするのに 500 μ L のシリンジを供給するのに 1 mL ガスタイトな注射器を使用します。
- CE ESI MS プラットフォームおよび代謝物の測定の検証
注: この手順の目標は、単一セルの抽出物を分析する前に毎日 CE ESI 質量計測器の感度を確認します。
- 〜 5 分間分離キャピラリを洗浄した後ステンレス製バイアルにある BGE ソリューションにその入口を転送します。
- エレクトロ スプレー エミッタ先端質量分析計のオリフィスから ~ 2 mm 位置し、顕微鏡を使用してスプレーを監視しながら安定したコーン ジェット政権でエレクトロ スプレーを生成する翻訳段階を使用してこの距離を微調整 (参照31,45)。30 〜 45 の総イオン電流 (TIC) の安定性を監視分安定動作を確保します。
- 〜 20 の適用可能性以上 〜 15 徐々 に増強により BGE バイアルに kV s、通常、BGE として 1% ギ酸を用いた分離毛細血管全体 ~7.5 μ A の電流を生成します。各測定の前に、5 〜 10 分間チック プロファイルを監視することによってシステムの安定性を確保して step-wise (グラウンド) を 0 V (CE) の分離可能性を下ろしてください。
注: 半自動化するのにこのプロセスは、我々 ソフトウェアを使用カスタム書かれた CE 高電圧電源供給31をリモートで制御します。CE ESI MS プラットフォームが安定していない場合慎重に ESI 専用モードで CE ESI MS プラットフォームを最初にテストすることによって不安定性のソースを評価し、として CE ESI 運用モードをお勧めします他31。簡単に、ESI 専用モードでは、プラットフォームをテスト、CE の高電圧をオフにし、コーン ジェット スプレー政権で 30 分程度のチックを監視します。必要に応じて、手順に従ってアドレス エラー: 接続リークを検査 (i)(ii) 水、イソプロパノール、水、メタノール; とエレクトロ スプレー エミッタをきれい(iii) 解消ガス溶剤;(iv) 〜 25 分のエミッタを再びテストする前にフラッシュします。CE ESI プラットフォーム ESI 専用モードで安定しているがある CE 分離中が不安定になる場合は、ジュール熱や電気分解システムを検査: (i) BGE 〜 25 分の分離・毛管をフラッシュし、; 実験を繰り返す(ii) 線形オーミック応答 (すなわち、線形 CE 分離電圧曲線対現在); を維持するためにより低い分離電位を使用します。(iii) CE キャピラリを用いた亀裂などの潜在的な損傷を点検し、必要に応じて、毛細血管を交換しています。 - 〜 6 の分析通りサンプルの nL:
- 注射バイアルにアセチルコリン標準液 1 μ L をピペットします。
- BGE バイアルから注射バイアルに分離キャピラリを転送します。
- 1 秒で CE 射出ステージ 15 cm を持ち上げます。
- 60 のための上昇ステージを保持 s 〜 6 流体を注入するキャピラリー分離にサンプルの nL。
- その後、翻訳 (キャピラリー出口) に合わせてレベルを開始するバック ステージ。
- 優しく、BGE キャピラリー入口側に移動します。
- すぐ後に電気泳動分離を開始する CE 電圧を立ち上げます。
- 開始 MS データ集録。
注: システムの性能は、任意の化学の標準を使用して特徴付けることができます。単一セルの CE ESI MS 提供 ~ 10 で検出限界を下げるアセチルコリン、メチオニン、ヒスチジン、16nM (~ 60 amol)。注入量 (Vinj) nL、毛細血管に異なります (H、cm) の高さの違い注入、密度 (ρ、g cm-3) と粘度 (η、kg m-1の-1) の間に BGE、長さ (L, m) と CE の半径 (r, μ m) のキャピラリーと噴射時間 (tinjs)。この関係は、ここでg (m s-2) は重力加速度、次の数式で表されます。
- 標準が検出されると、データ集録を停止低い分離電圧 0 V を段階的 (グラウンド)、口から 2 cm にエミッタを取得します。細胞抽出液を分析する前に 5 分間分離キャピラリをフラッシュします。
- 単一セルのメジャー 10 nL 抽出手順 3.3.1-3.3.5 を繰り返すことによって 90 を使用して流体サンプルを注入する s。
注: データ処理の目的は、単一の細胞間の物質を定量化することです。単一セル--MS ESI プロトコルは、数秒の典型的な基本幅の狭い electropherographic のピークを生成します。それは分子機能 (固有の移行時間とユニークなm/z値) を見つけることは半手動でデータ分析を実行する次の手順を使用して。図 2 a選択識別された代謝産物の代表的な分離を示します。
- データ集録後の生データ ファイルの質量校正します。
注: 我々 はナトリウム ギ酸クラスターからサンプルから豊富なナトリウム イオンの分離中に生成されるネイティブで、細胞内に存在または胚の培養液から抽出された信号を使用します。このステップの目標できれば高質量 (m/z) 精度を確保することによって後の手順で代謝物同定を強化することです < 5 mDa または < m/z 50-1 000 の間の 10 ppm。ここでは、ポスト データ集録校正により日常的に質量精度を得ることが可能 < 1 mDa または < 2 m/z 50-500 ppm。 - 検出質量範囲にわたって分子機能を検索処理のスクリプトを使用します。正確な質量を決定する、対応する移行の時間を注意してくださいに各ピークの質量スペクトルの平均値します。M/z 50-500 の範囲で低質量代謝物の同定、「500 mDa 手順ウィンドウを使用して S/n の分子機能を監視 > 3。
- 手動でまたは自動的にピーク領域-下-の - の曲線各分子の機能を統合します。結果の領域の値は、代謝物の豊かさの指標として使用されます。
- (図を参照してください次のように精度の高い、興味の分子の機能を識別します。
- まず、10 ppm 精度の推定質量試合の一覧を取得する (例えば、Metlin46 、47検体) 代謝産物データベースに対して分子の機能の正確な質量を比較します。
- 次に、セルから得られるそのタンデム質量スペクトルを比較することによりこれらの大量の一致を評価標準対応する化学測定代謝産物データベースまたはタンデム質量スペクトルで利用可能なデータを抽出します。
- 最後に、同じ楽器の CE ESI MS で分析化学の関連の規格と細胞抽出物に記録された分子の機能の移行時間を比較することによってこれらの割り当てを検証します。
注: 実験的スループットを高めるためには、我々 通常識別実験条件や細胞の種類の間に有意差がある分子機能だけ。代表的な識別は、図 2のとおりです。質量精度の高い代謝物を識別するためをお勧めします毎日、質量分析計のキャリブレーションを行う外部内部標準を使用しておよび/または外部質量校正各測定毎に、測定中にリアルタイムの再キャリブレーションを実行します。ファイル ポスト データ集録 (例えば、ナトリウム ギ酸クラスターここ) をお勧めします。
注: 実験では、以降のデータ解析、次の手順のすべての手順を実行に使用されたオンライン ソフトウェア プラットフォーム47 : 私) 分子機能のフィルター処理 (例えばセル各サンプル セットの少なくとも 50% の発生と型)ii) データの正規化iii) 統計 (例えば, t-テスト)、主成分分析 (PCA) など階層的クラスター分析 (HCA) の多変量データ解析。Pを使用して、我々 < 0.05 (Student のt-テスト) 統計的有意性をマークし、フォールドの変更 ≥ 1.5 生物学的意義を注意してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
最近マイクロ プローブによる単一細胞を用いて自由にアフリカツメガエル胚29,30の開発に個々 の特定細胞代謝産物を特徴付ける CE ESI MS。マイクロ プローブにより、高速 (~ 5 sec/セル)、~ 10 の場で吸引個々 のセル、同じセルの複数の願望またはライブ胚 (図 1 b) の同じまたはそれ以降の段階でいくつかの異なる細胞から nL。適当な溶媒を使用して吸気の携帯電話コンテンツが抽出され、代謝物はそれから分かれている特注の CE esi を使用してイオン化しアプローチ (削除後 〜 300 非冗長代謝物の信号が得られますさん Typically によって検出されました。同位体ピークをクラスターと) 各セルから。分離は、図 2 aの分子の選択例示です。移行時間に基づく小型の極性代謝産物として信頼性の高さが 70 の異なる信号がわかりましたし、セルの MS/MS 分裂パターン抽出に比べて標準またはタンデム質量スペクトル ライブラリからの信号。たとえば、図 2 bはこれら直交情報の組み合わせによるヒスチジンの証明を示しています。
マイクロ プローブ CE ESI MS は、単一細胞の代謝の違いの定量化のためことができます。CE ESI MS 8 %rsd はに基づいて選択イオン エレクトロフェロ16,30で曲線下のピーク面積の再現性が定量的には。マイクロ プローブ サンプリングこの技術の再現性は 14% RSD30、クエリ統計学的および生物学的意義を細胞代謝活性違いに十分であります。例として、図 3はその微生物の CE ESI MS 対応の in situマイクロ サンプリング 3 背側の細胞の種類 (図 3 a) を示します。さらに、定量的なメタデータの PCA は 8 細胞胚の識別された前駆細胞として代謝の変化を発見 (を参照してください D1R セル) 16 セルの細胞クローンを形成する分割 (を参照してください D11R セル) と 32 細胞 (D111R 細胞) 胚 (図 3 b)。図 3 cに選択代謝産物の代表的な傾向が表示されます。Ser Arg を示したこれらの反対動向とトロラミンサリチルのセルのタイプに対し、細胞分裂、豊富にアセチルコリンなどの代謝産物が減少しました。トロラミンサリチルから 8-16 細胞胚に豊かさの減少し、Ser Arg 32 細胞胚に減少する前に 16 細胞胚を増やすことによって反対の傾向を描かれている間 32 細胞胚で豊かになった。アルギニンが豊富なこれらの細胞段階の間に大きく変化しません。これらの傾向は、 X. laevisの初期の発達段階の根底にある根本的なプロセスのより多くの光を当てる予定です。
図 1: 実験的ワークフローの in situマイクロ プローブによる単一細胞毛管電気泳動 (CE) 質量分析 (MS) です。(A) 特定の使用は、20 μ m の外周部に先端を切断後前にマイクロ ピペット (上) と (下) を作製しました。(B) Microsampled 8 細胞胚として分かれ続けた細胞が生体内での研究のための段階を開く、16 細胞期に開発。(C) 8 セルアフリカツメガエル胚 (「V1R と D1R 細胞) のマイクロ プローブ (マイコンインタ) を使用して識別単一細胞を採取、細胞代謝物抽出し、CE さんスケール バーを用いて = 250 μ m (ダークグレー/);10 mm (白)。キー: SP、シリンジ ポンプ。(図参照29,30から権限を持つ適応)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マイクロ プローブによる単一細胞 CE MS により、代謝産物の id を信頼します。選択識別された代謝物 (A) 代表一塩。正確な質量、移行時間、および断片化の比較に基づいてヒスチジン (B) 識別データ (衝突誘起解離) 標準的な代謝物に対して。キー: 1、メチル ヒスチジン;2、homolysine;サムは、s-アデノシルメチオニン;Orn、オルニチン。お茶、トリエチルアミン;車、カルニチン。アッコ、アセチルコリン;AcCar、acetylcarnitine。HPX、ヒポキサンチン;グルタチオン、グルタチオン。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: X. laevisで背側系統を形成する単一細胞の定量的代謝違い。(A) 8 細胞胚とその子孫、16 セル胚 D11R セルと 32 細胞胚 D111R セルの D1R 前駆細胞の光のイメージ。(B) 主要代謝物のこれらの 3 つの細胞型を異なる代謝プロファイルを暴くで定量化の主成分分析 (PCA)。各データ ポイントを示す別のセル (参照番号) には技術的なレプリケートします (接続ポイント) で測定しました。楕円は、95% の信頼度をマークします。(C) 変動 (ANOVA) の分析と事後フィッシャーの最下位の判別分析は、セルの段階で複雑な代謝の動向を明らかにします。ボックス プロットの正方形意味、ボックスは 1 × 標準誤差平均 (SEM)、ウィスカは 1.5 × SEM. キー: *p < 0.05;ns、有意差なし。スケール バー = 250 μ m です (図30参照権限を持つ適応。)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
マイクロ プローブ MS-CE は、ライブ、自由に開発の胚の単一細胞における代謝物の直接評価できます。アプローチの中心に 2 つの技術的なサブコンポーネント、すなわちその場で毛細管特定と高感度 CE ESI さんに比べて細胞解離、毛細管特定高速動作 (5 分対数秒という利点があります。/郭清による細胞)、胚、および開発の後の段階でより小さいセルにスケーラビリティの複雑な三次元形態との互換性。解離とは異なりマイクロ プローブ サンプリングはそのまま胚の他のセル以降の分析のため。興味深いことに, microsampled 細胞が分裂し続ける, 細胞分化.の長期的な研究の可能性を高めるプローブの先端のサイズを制御する機能は、プローブ細胞およびゼブラフィッシュ、マウスなど、他のモデル生物を用いた発達過程における代謝の役割を研究するための汎用性の高いツールとして CE ESI MS もできます。信頼できる結果を保証するために、興味のセルは、正確に、正確に、かつ一貫して識別にし、サンプリングが重要です。吸引 (例えば、毛細管の寸法、圧力、および時間) の実験的パラメーターは、セルの所望の部分をサンプルに合わせて調整できます。また、順番胚への損傷を最小にする興味の細胞の精度を高めるために胚を固定する重要です。このプロトコルでは、サンプリング中に胚を固定する agarose コーティング シャーレ内で井戸を作成しました。我々 の経験では、斜めのヒントと毛細血管は鈍のヒントと比較してセルに与えるダメージを最小限を確認します。さらに採取し, 化学分析のスループットの改善には、こうして細胞と発達過程の基礎となる重要な代謝物を識別するために統計分析を強化、細胞の大規模な集団の特性が有効になります。
CE ESI MS の目的は、トレース レベルの感度で、メタボロームの解析を有効にすることです。CE では、ナノ流動液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの他の人気のある分離技術を単一細胞研究の相補的な利点を提供しています。CE は、複雑なメタボロームに対処する絶妙な分離効率を提供します。CE の物理的なサイズは、単一セルから発生量限定のサンプルと互換性が。さらに、様々 な濃縮技法は、ce では (例えば、フィールド増幅サンプル スタックまたは動的 pH ジャンクション)] 列で、検出感度を高めるためのサンプルを preconcentrate に存在します。成功研究 CE ESI MS 楽器を特徴し、毎日検証する必要があります。たとえば、我々 はアセチルコリン標準の 60 amol の少なくとも 3 の S/N を必要とする (6 50 nM 標準注入の nL) と再現性 < 5% 分離 (移行) 時間の RSD と < 25% 定量化の RSD 曲線に基づくピーク領域-下-の - で標準の選択イオン エレクトロフェロ。トレースに敏感な検出と定量化のダイナミック代謝物 (ペプチド) の CE ESI MS6,16,25を使用して 1 つの細胞内濃度の広い範囲にまたがる多様なタイプの測定を容易にします。,31. 我々 は日常的に 〜 300 の異なる正荷電代謝物信号検出、CE MS もと互換性のある負イオン化モード48, 単一細胞メタボロームの検出部分の深さを高めてします。
しかしX. laevisは、この技術開発を研究するための作成にいくつかの利点を提供して、マイクロ プローブ CE ESI MS もありますモデル有機体の他のタイプに適応。アフリカツメガエル、色素沈着とサイズで再現可能な細胞運命マップ49と共にセルとの差によって作る知られている組織の運命を持つ特定のセルを識別することが可能。、これはターンでは、探索への扉を開きます。 または細胞分化に対する異なる発達プログラムを固めるよう全体の細胞系譜の代謝実験を対象と。さまざまな細胞周期により生じる違いを避けるためには、胚は、50を他の所で示されているように、サンプリングの前に次のステージに完全に分割するべき。マイクロ プローブ MS-CE はセルまたは細胞のタイプ間の重要な破綻と小分子の発達的意義をテストする古典的な発生学的操作や分子ツール (例えば、遺伝子ノック アウト/ダウン) に適応可能です。.たとえば、緑色蛍光タンパク質の発現を介して細胞運命のトラッキングと単一細胞メタボロミクスの組み合わせは、以前と代謝産物の発見に、不明な発達影響16を導いた。
単一細胞メタボロミクス研究を定量化; 特に、分析の詳細に細心の注意を呼び出す当社の技術も例外ではありません。理想的には、潜在的な低下および/または内因性代謝物やサンプルを汚染の損失を最小限に抑えるためサンプル調製ワークフローの各ステップを慎重に評価する必要があります。酵素の活性をクエンチし、機器分析6より前のサンプルに代謝の変化を軽減/回避する高純度変性溶剤 (例えば、LC/MS グレード)、酸または基盤、低温 (~ 4 ° C) の使用お勧めします,51。 メタノールやアセトニ トリルに基づく単純な有機溶液小さな代謝物28の効率的な抽出を許可します。もちろん、代謝物 (例えば極冠の化合物、脂質) の特定のクラスを対象とした実験の事前抽出溶媒の組成を仕立て恩恵します。たとえば、我々 は最近、複数種類抽出溶媒の使用が単一細胞メタボローム28の適用範囲を高めることを示した。これらの代謝物質の定量化は、代謝物抽出時に抽出液にスパイクが同位体ラベル付けされた代謝物などの内部基準で容易にできます。内部基準にも抽出と測定の手順は、こうして技術とシステムの再現性の評価とサンプル検体の回収を促進するための品質管理に有益です。最後に、我々 は生物技術的複製 (抽出と同じ複数回測定) で分析し各セルに (別のセルの異なる胚から吸気) をレプリケートするため提唱統計的検出力と結果の解釈を支援します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は (P.N.) に健康補助金 GM114854 の国家機関によってサポートされて、(P.N.) に CA211635、アーノルドとメイベル ベックマン財団ベックマン若い調査官 (P.N.) に付与 (P.N.) にデュポン若い教授賞大量のアメリカの社会分析研究賞 (P.N.) を (R.M.O. および E.P.P.) にコスモス クラブ財団奨学金。意見と結論この書において表明のだけは、著者の資金源の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 - 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
References
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
- Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
- Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
- Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
- Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
- Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
- Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
- Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
- Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
- Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
- Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
- Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
- Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
- Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
- Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
- Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
- Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
- Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
- James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
- Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
- Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
- Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
- Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
- Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
- Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
- Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
- Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
- Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).
