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Chemistry

लाइव मेंढक (Xenopus laevis) भ्रूण में एकल कोशिका Metabolomics के लिए Microprobe केशिका ट्रो मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Published: December 22, 2017 doi: 10.3791/56956
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Chemistry, George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology, George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, College Park

Summary

हम कदम है कि सीटू में तेजी से सक्षम करने के लिए उच्च परिशुद्धता और ंयूनतम आक्रमण के साथ एक व्यक्तिगत कोशिका के एक छोटे हिस्से का वर्णन केशिका-आधारित माइक्रो-नमूना, में चयापचय गतिविधि का एक स्नैपशॉट के रासायनिक लक्षण वर्णन की सुविधा के लिए एक कस्टम निर्मित एकल कोशिका केशिका ट्रो और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री मंच का उपयोग कर लाइव भ्रूण ।

Abstract

एकल कोशिकाओं में छोटे अणुओं के ठहराव बेहतर बुनियादी प्रक्रियाओं है कि भ्रूण विकास आबाद को समझने के लिए नई क्षमता उठाती है । जीवित भ्रूण में सीधे एकल सेल जांच को सक्षम करने के लिए, नए विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण की जरूरत है, विशेष रूप से उन है कि संवेदनशील हैं, चयनात्मक, मात्रात्मक, मजबूत, और अलग सेल आकार के लिए स्केलेबल । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक सेल में चयापचय के सीटू विश्लेषण में सक्षम बनाता है के लिए स्वतंत्र रूप से दक्षिण अफ्रीकी पंजा मेंढक (Xenopus laevis), कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली मॉडल के विकास के भ्रूण विकसित करता है । इस दृष्टिकोण एक केशिका microprobe का उपयोग करता है भ्रूण में एकल पहचान कोशिकाओं से एक परिभाषित भाग महाप्राण, पड़ोसी कोशिकाओं बाद विश्लेषण के लिए बरकरार छोड़ रहा है । एकत्र सेल सामग्री एक उच्च संकल्प मिलकर जन स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए युग्मित एक अतिसूक्ष्म केशिका ट्रो electrospray ionization (CE-ईएसआई) इंटरफेस द्वारा विश्लेषण किया जाता है । इस दृष्टिकोण विभिंन कोशिका आकार और जटिल तीन विकासशील भ्रूण के आयामी संरचना के साथ संगत को स्केलेबल है । एक उदाहरण के रूप में, हम प्रदर्शित करते है कि microprobe एकल-कक्ष CE-ईएसआई-MS सक्षम बनाता है elucidation चयापचय कोशिका विविधता कि एक जनक कोशिका के रूप में करेंगी भ्रूण के विकास के दौरान वंश को जन्म देता है । सेल और विकास जीवविज्ञानी के अलावा, एकल सेल विश्लेषण प्रोटोकॉल यहां वर्णित अंय सेल आकार, सेल प्रकार, या पशु मॉडल के लिए उत्तरदाई हैं ।

Introduction

भ्रूण के विकास की एक व्यापक समझ सभी आणविक परिवर्तन है कि विकासशील जीव के हर कोशिका में प्रकट होने के लक्षण वर्णन की आवश्यकता है । जबकि अगले-आणविक प्रवर्धन के साथ पीढ़ी अनुक्रमण प्रणाली2,3, काफी कम छोटे अणुओं के सुइट के बारे में जाना जाता है के विकास में एकल सेल transcriptomes1 के गहरे माप में सक्षम बनाता है प्रोटीन सहित एकल भ्रूण कोशिकाओं में उत्पादित, और, विशेष रूप से, चयापचयों (आणविक जन & #60; ~ १,५०० Da). आंतरिक और बाह्य घटनाओं के लिए एक तेजी से और गतिशील प्रतिक्रिया के साथ, metabolome एक सेल के आणविक राज्य के एक शक्तिशाली डिस्क्रिप्टर के रूप में कार्य करता है । एकल सेल metabolome, इसलिए, जल्दी भ्रूण में सेल विविधता के स्थानिक और लौकिक विकास को ट्रैक करने के लिए और कार्यात्मक अध्ययन के लिए नए अणुओं की पहचान करने की क्षमता को जंम देती है । हालांकि, इन अणुओं के लिए उपलब्ध आणविक प्रवर्धन के बिना, metabolome का पता लगाने असाधारण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), जो metabolite विश्लेषण के लिए पसंद की तकनीक है का उपयोग कर संवेदनशीलता की मांग ।

एकल सेल एमएस एक कोशिकाओं में चयापचयों को मापने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता के साथ प्रौद्योगिकियों का एक संग्रह है (समीक्षा देखें 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15) । कोशिकाओं और चयापचयों के कुशल निष्कर्षण के प्रतिलिपि नमूना एकल कोशिकाओं में चयापचयों का सफल पता लगाने के लिए आवश्यक हैं । पूरे सेल Xenopus भ्रूण से पहचान की कोशिकाओं के विच्छेदन छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स के लक्षण वर्णन16सक्षम है । electrospray ionization (ईएसआई) एमएस का उपयोग करके पता लगाने के बाद व्यक्तिगत जीवित कोशिकाओं नमूना करने के लिए अन्य दृष्टिकोण micropipettes रोजगार. उदाहरण के लिए, चयापचयों संयंत्र या एकल सेल वीडियो MS17, दबाव जांच18, एकल जांच19, और द्रव बल माइक्रोस्कोपी20, अंय तकनीकों के बीच21से स्तनधारी कोशिकाओं में मापा गया, 22,23,24। इसके अतिरिक्त, रासायनिक जुदाई के शामिल होने से पहले एकल सेल एमएस कार्यप्रवाह में ionization करने के लिए कुशलतापूर्वक metabolome को सरल, इस प्रकार आयन पीढ़ी के दौरान संभावित हस्तक्षेप को समाप्त करने से पहले का पता लगाने. महत्वपूर्ण बात, पृथक्करण भी यौगिक विशिष्ट जानकारी के लिए आणविक पहचान में सहायता प्रदान करता है । केशिका ट्रो (CE) एक विच्छेदित25,26 या microsampled27न्यूरॉन्स में चयापचयों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ंयूरॉन phenotypes के बीच छोटे-अणु मतभेदों पर कब्जा । हमने हाल ही में ईएसआई के लिए CE को अनुकूलित करने के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि Xenopus laevis16,28के प्रारंभिक भ्रूण से विच्छेदित किया गया में चयापचयों के सैकड़ों के ट्रेस स्तर का पता लगाने में सक्षम एमएस । ये अध्ययन भ्रूण कोशिकाओं के बीच विकास के एक प्रारंभिक चरण में आश्चर्य की बात चयापचय मतभेद का पता चला और पहले से अज्ञात विकास के प्रभावों के साथ चयापचयों की खोज के लिए नेतृत्व किया16.

यहां हम एक प्रोटोकॉल है कि एकल कोशिकाओं में सीधे एक जीवित हड्डीवाला microprobe एकल सेल CE-ईएसआई-MS29,30का उपयोग कर भ्रूण में चयापचयों का पता लगाने सक्षम प्रदान करते हैं । मॉडल जीव चुना 8 से ३२-सेल एक्स laevis भ्रूण है, हालांकि दृष्टिकोण भी विकास और मॉडल जीवों के अंय प्रकार के बाद के चरणों के लिए लागू है । इस प्रोटोकॉल एक उच्च संकल्प इमेजिंग प्रणाली द्वारा मार्गदर्शन के तहत बहु धुरी अनुवाद नियंत्रण के साथ तेज केशिकाओं का उपयोग करता है एक ~ 10 आकृति जटिल विकासशील भ्रूण में सीटू में कोशिकाओं के nL भाग महाप्राण । इस microprobe छोटे कोशिकाओं को स्केलेबल है और सेकंड के भीतर चल रही है, जो पर्याप्त तेजी से भ्रूण में सेल वंश ट्रैक है । ऐसे चयापचयों और पेप्टाइड्स के रूप में ध्रुवीय या apolar छोटे अणुओं, निकालने के बाद में एकत्र नमूना से ~ 4-5 µ l निष्कर्षण समाधान, एक ~ 10 nL के परिणामस्वरूप निकालने के एक कस्टम में विश्लेषण किया है CE मंच एक ईएसआई जन स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए बंटे । निर्माण और CE-ईएसआई-एमएस मंच के संचालन कहीं और वर्णित प्रोटोकॉल पर बनाता है । 31 , ३२ सह के सलए CE-ईएसआई इंटरफेस का निर्माण किया है के रूप में कहीं और वर्णित है । 31 इस मंच शंकु-जेट छिड़काव शासन में एक 4-5 लॉग-आदेश गतिशील रेंज पर ठहराव के लिए एक क्षमता के साथ ट्रेस स्तर संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए बनाए रखा है (सापेक्ष28,29,30 या निरपेक्ष16) । CE-ईएसआई-MS प्लेटफार्म एक ६०-अमोल के साथ पता लगाने की कम सीमा प्रदान करता है 8% सापेक्ष मानक विचलन (RSD) quantitation में 10 एनएम के लिए 1 µ m करने के लिए छोटे अणुओं16, जो एक्स में अंतर्जात चयापचयों की विशेषता के लिए पर्याप्त हैं . laevis कक्ष । Microprobed कोशिकाओं को भ्रूण के रूप में भाग30विकास के माध्यम से प्रगति जारी है, अस्थाई और स्थानिक सेलुलर चयापचय के विश्लेषण के लिए अनुमति दी । दरअसल, एकल-कक्ष CE-ईएसआई-MS कोशिकाओं है कि पृष्ठीय पर कब्जा के बीच चयापचय मतभेदों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-ventral16,29, पशु-वनस्पति16, और वाम अधिकार28 विकासात्मक कुल्हाड़ियों के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं कि तंत्रिका ऊतक फार्म एक्स laevis30में एक आम जनक सेल से पृष्ठीय वंश दुर्भाग्यशाली । X. laevis भ्रूण के विभिंन विकास चरणों में व्यक्तिगत भ्रूण कोशिकाओं के बीच चयापचय मतभेदों को क्वेरी के अलावा30, हम पूर्वानुमान है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल और अणुओं की एक व्यापक सरणी के लिए लागू कर रहे है एकल कोशिकाओं भ्रूण विकास के विभिंन चरणों के साथ ही कोशिकाओं और मॉडल जीवों के अंय प्रकार से microsampled । इसके अतिरिक्त, microprobe microsampling के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जबकि miniscule नमूनों के साथ संगत एक अलग मंच जुदाई और/या के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

Xenopus laevis के रखरखाव और हैंडलिंग से संबंधित सभी प्रोटोकॉल को जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (IACUC no. A311) ।

1. नमूना उपकरण, मीडिया, सॉल्वैंट्स, और नमूना व्यंजन की तैयारी

  1. निम्नलिखित क्रम में और एक मानक प्रोटोकॉल३३: सोडियम क्लोराइड (५८.२ मिमी), पोटेशियम क्लोराइड (१८.२ MΩ. cm 25 डिग्री सेल्सियस पर) में निंनलिखित साल्ट को भंग करके 1x स्टाइनबर्ग का समाधान (SS) तैयार कर रहा है । ०.६७ मिमी), कैल्शियम नाइट्रेट (०.३४ मिमी), मैग्नीशियम सल्फेट (०.८३ मिमी), Tris-हाइडरोक्लॉराइड (४.१९ मिमी), और Tris बेस (०.६६ मिमी). ultrapure पानी का उपयोग 1x एसएस के दस गुना कमजोर पड़ने से, दो गुना, और 0.1 x एसएस द्वारा 0.5 एक्स ss बनाओ ।
  2. भंग करने के लिए 20 मिनट के लिए १२० ° c पर 1x SS. आटोक्लेव में पहले 2% agarose बनाने के द्वारा नमूना व्यंजन तैयार करें । हालांकि अभी भी तरल, समाधान के साथ ६० mm पेट्री व्यंजन के नीचे कोट । एक बार agarose जेल ठंडा और जम गया है, लौ एक छह इंच पाश्चर पिपेट के अंत तक यह एक गेंद रूपों, और हल्के से गर्म अंत छूने के लिए 5-10 कुओं छाप, ~ 1 मिमी गहरी, agarose में ।
    नोट: इन कुओं में सैंपलिंग के दौरान भ्रूण को मैटीरियल का इस्तेमाल किया जाता है ।
  3. metabolite निष्कर्षण विलायक तैयार करें । दर्जी विलायक के भौतिक गुण (जैसे, ध्रुवीकरण और पीएच) अणुओं है कि अध्ययन में रुचि के है की कक्षाओं के लिए ।
    नोट: उदाहरण के लिए, हम मुख्य रूप से ध्रुवीय चयापचयों को लक्षित करने के लिए खोज के दृष्टिकोण के रूप में ४०% मेथनॉल और ४०% acetonitrile को LC-MS-ग्रेड पानी में उपयोग करते हैं, और कुछ apolar चयापचयों और पेप्टाइड्स28।
  4. बालों को साफ बालों के छोरों और एक पाश्चर पिपेट के रूप में३३ को धीरे से कम गड़बड़ी के साथ पेट्री व्यंजन में भ्रूण ले जाने के लिए कहीं और वर्णित के रूप में बनाओ ।
  5. गढ़े पतला-टिप micropipettes के रूप में चित्र 1aमें दिखाया गया है ।
    1. सबसे पहले, पुल borosilicate केशिकाओं (1000/500 µm बाहरी/भीतरी व्यास) एक ज्वलंत-ब्राउन-प्रकार केशिका खींचने में निंनलिखित सेटिंग्स के साथ: हीट = ३५५; खींचो = ६५, वेग = ८०; समय १५० = ।
    2. अगले, तोड़-खींच micropipette की नोक ठीक तेज संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए एक केशिका टिप के बाहरी व्यास प्राप्त ~ 20 µm. एक stereomicroscope के तहत इस कदम प्रदर्शन परिशुद्धता और reproducibility सहायता करने के लिए ।
      नोट: एक छोटी सी टिप के साथ केशिकाओं चिपचिपा कोशिका की आकांक्षा के दौरान कॉलेस्ट्रॉल के लिए प्रवण हैं । जबकि एक बड़ा टिप के साथ केशिकाओं निश्चित रूप से कॉलेस्ट्रॉल और सेलुलर सामग्री के अधिक महाप्राण से बचने में मदद, बड़े बोर केशिकाओं छोटे कोशिकाओं के नमूने के दौरान चुनौतियों का सामना कर सकते हैं और संभवतः बाद नमूना लेने के लिए सेल को नुकसान. दबाव और आकांक्षा के समय के सावधान समायोजन आंशिक रूप से इन चुनौतियों को कम कर सकते हैं । हम यहां प्रस्तुत काम के लिए ~ 20 µm बाहरी व्यास आदर्श के साथ micropipettes मिल ।

2. Microsampling एकल कोशिकाओं और Metabolite निष्कर्षण

  1. प्राप्त भ्रूण (निषेचित अंडे) के माध्यम से गोनॉडोट्रॉफिन-प्रेरित प्राकृतिक संभोग वयस्क Xenopus laevis या via इन विट्रो निषेचन के रूप में कहीं और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में३३,३४।
    नोट: प्राकृतिक संभोग सुनिश्चित करता है कि भ्रूण विकास के चरणों में अस्थिरता हो रही है, जबकि भ्रूण द्वारा प्राप्त इन विट्रो निषेचन में और अधिक आपूर्ति में विश्वसनीय हैं । हालांकि, इन विट्रो में निषेचन वयस्क पुरुष मेंढक त्याग की आवश्यकता है ।
  2. ताजा ultrapure पानी की २०० मिलीलीटर में cysteine के 4 जी भंग करके 2% cysteine के घोल को तैयार करने और dropwise 10 N सोडियम हीड्राकसीड समाधान का उपयोग कर 8 पीएच करने के लिए समाधान समायोजित करें ।
  3. के रूप में वे 2 में सट करने के लिए शुरू-सेल चरण के रूप में भ्रूण आसपास के जेली कोट निकालें इस प्रकार है: 2 मिनट के लिए, तो धीरे से एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए उंहें भंवर करने के लिए संग्रह की सतह का पालन करने से भ्रूण को रोकने के लिए दो । डिश.
  4. धीरे से एक साफ चोंच में पकवान सामग्री डालो और जल्दी से चोंच से जेली समाधान नहीं कर सकते । तुरंत शेष जेली समाधान कुल्ला करने के लिए 0.1 x SS के साथ अंडे को कवर, धीरे भंवर, और फिर समाधान नहीं कर सकते । भ्रूण को अच्छी तरह से धोने के लिए इस चरण को चार बार दोहराएं ।
    नोट: भ्रूण की सीमा के लिए 4 मिनट के लिए जेली समाधान के लिए जोखिम व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए । व्यापक प्रोटोकॉल जेली कोट को दूर करने के लिए३३कहीं उपलब्ध हैं ।
  5. एक पेट्री डिश में 1x SS में dejellied भ्रूण स्थानांतरण । प्लेटों के भीतर भीड़ कम करने के लिए, जगह ~ १०० mm डिश३३प्रति १०० भ्रूण ।
    नोट: भ्रूण युक्त व्यंजन 14-18 डिग्री सेल्सियस के बीच संग्रहीत किया जा सकता है विकास को धीमा और एक ही माता पिता से चौंका देने वाले विकास चरणों में भ्रूण प्राप्त करते हैं । विकास और विकास के तापमान पर निर्भरता पर अतिरिक्त दिशा निर्देशों Xenbase और कहीं३३,३५,३६,३७पर प्रकाशित कर रहे हैं ।
  6. 2-सेल स्टेज पर एक अलग डिश है जिसमें बाहुबली रंजकता आत्मविश्वास से पृष्ठीय-ventral अक्ष के निशान में, स्थापित सेल भाग्य मैप्स३८,३९,४०के संदर्भ के साथ में सट भ्रूण क्रमबद्ध करें ।
    1. सही ढंग से पहचान सुनिश्चित करना है कि पहली दरार कुंड, जो midsagittal विमान, bisects (ventral) और हल्के (पृष्ठीय) pigmented पशु ध्रुव ऐसी है कि दो हिस्सों दर्पण छवियों है४१को चिह्नित करके भ्रूण सट ।
  7. एक बहु धुरी micromanipulator पर एक गढ़े micropipette माउंट (मैनुअल या दूर से नियंत्रित) । micropipette को microinjector से कनेक्ट करें ।
  8. 8-सेल भ्रूण के महाप्राण ~ 5 करने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें और उंहें 0.5 x SS युक्त नमूना डिश में स्थानांतरण ।
एक बाल पाश का प्रयोग, स्थिति भ्रूण एक व्यक्ति में अच्छी तरह से नमूना है, और सुनिश्चित करें कि सही ढंग से ब्याज की कोशिका की पहचान एक ~ ९० ° कोण पर microprobe का सामना करना पड़ रहा है ।
नोट: सेल भाग्य मैप्स३८,३९,४०के संदर्भ के साथ, भ्रूण में रंजकता और स्थिति के आधार पर कोशिकाओं की पहचान ।
  • stereomicroscope के तहत काम करते हुए (20-30X आवर्धन पर), लाइव भ्रूण के भीतर की पहचान एकल सेल में micropipette के टिप गाइड के रूप में चित्रा 1 में दिखाया गया पैनल बी में कोशिकाओं पर नमूना अंक और पैनल में उपकरण सी देखें).
  • microinjector (' भरण मोड ') का उपयोग कर microcapillary करने के लिए नकारात्मक दबाव दालों को लागू करके सेल की सामग्री के एक वांछित हिस्से को वापस ले ।
    नोट: उदाहरण के लिए, हम नियमित रूप से महाप्राण ~ 10-15 nL मात्रा सेल से ~ 3 दालों की केशिका करने के लिए-30 साई । यह पूरा कदम30आकांक्षा के लिए ~ 5 एस रहता है ।
  • धीरे सेल से microprobe वापस लेना और metabolite निष्कर्षण विलायक ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) के 4 µ एल में अपनी टिप हस्तांतरण एक सूक्ष्म आकार की शीशी में । अगले, microinjector का उपयोग कर केशिका करने के लिए 1 एस के लिए + ८० साई की एक दबाव वृद्धि लागू करें (' स्पष्ट मोड ') विलायक में महाप्राण निष्कासित करने के लिए ।
    1. कसकर, वाष्पीकरण को रोकने के लिए शीशी को बंद करें और शीशी को 4 ° c आइस बकेट में वापस रखें जब तक कि नमूना पूरा न हो जाए । एक needlestick जोखिम को रोकने के लिए एक sharps कंटेनर में प्रयुक्त micropipette त्यागें ।
      नोट: aspirated कोशिका सामग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए, खनिज तेल में महाप्राण सुई, जहां यह एक गोलाकार आकार प्राप्त करता है । इस क्षेत्र के व्यास एक खुर्दबीन का उपयोग कर मापा जा सकता है । aspirated वॉल्यूम की गणना करें: v = 4/3 π r3, जहां v वॉल्यूम है, और r क्षेत्र की त्रिज्या है ।
  • एक ही सेल फिर से या भ्रूण के अंय कोशिकाओं के नमूने के लिए, दोहराएं कदम 2.7-2.11 (चित्रा 1c) । लगातार नमूने के बीच की क्षमता से बचने के लिए, प्रत्येक अलग कक्ष के विश्लेषण के लिए एक ताजा micropipette का उपयोग करें ।
  • एक बार नमूना पूरा हो गया है, भंवर मिश्रण-नमूना युक्त microcentrifuge शीशियों ~ 1 मिनट के लिए चयापचयों के निष्कर्षण में तेजी लाने के लिए, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ८,००० × जी पर केंद्रापसारक सेलुलर मलबे और अंय कण गोली ।
  • कक्ष के मलबे और एक दिन के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर या-८० ° c पर 1 महीने के लिए CE-ईएसआई-MS द्वारा माप तक के लिए एक साथ सेल निष्कर्षों की दुकान ।

    • 3. CE-ईएसआई-एमएस माप

    1. मानक और समाधान के लिए CE-ईएसआई-MS की तैयारी
      1. नियंत्रण रेखा-एमएस ग्रेड पानी में 1% फार्मिक एसिड से मिलकर पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट (BGE) तैयार करें ।
      2. ५०% मेथनॉल में LC-MS ग्रेड पानी और ०.१% के रूप में शामिल करने के लिए म्यान समाधान तैयार करें ।
      3. CE-ईएसआई-MS सिस्टम के प्रदर्शन के दैनिक मूल्यांकन के लिए म्यान समाधान में ५० एनएम acetylcholine समाधान तैयार करें ।
      4. सकारात्मक आयन मोड में कम m/z श्रेणी के लिए जन-अंशांकन मानक के रूप में १५० mM सोडियम क्लोराइड समाधान तैयार करें । एक मास (m/z) की सटीकता & #60; 10 पीपीएम की सिफारिश की है । इस चरण को पूरा करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर वेंडर के निर्देशों का पालन करें ।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, ज्ञात m/z मान के साथ अंय मानकों जन स्पेक्ट्रोमीटर को जन-जांचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. सीई-ईएसआई प्लेटफार्म का निर्माण
      1. एक CE इंजेक्शन BGE शीशी और नमूना लोड हो रहा है microvial पकड़े एक मंच के तेजी से ऊर्ध्वाधर अनुवाद करने में सक्षम मंच का निर्माण । प्लेटफ़ॉर्म के निर्माण और संचालन के लिए,31संदर्भ में विवरण देखें ।
      2. CE-ईएसआई इंटरफ़ेस (चित्रा 1c) निम्नानुसार इकट्ठा. माउंट electrospray धातु उत्सर्जक (130/260 µm इनर/बाहरी व्यास और ~ ३५ mm लंबाई) एक 3-पोर्ट टी यूनियन में । जुदाई CE केशिका फ़ीड (40/105 µm इनर/बाहरी व्यास और ~ १०० सेमी लंबाई) electrospray उत्सर्जक के माध्यम से यह बहर की अनुमति ~ 40-100 µm उत्सर्जक की नोक से परे । एक stereomicroscope के तहत काम करने के लिए सटीकता सहायता ।
        1. electrospray समाधान की आपूर्ति करने के लिए शेष बंदरगाह के लिए म्यान समाधान केशिका (75/360 µm इनर/बाहरी व्यास और ~ १०० सेमी लंबाई) कनेक्ट करें । उपयोग उचित आस्तीन और उंगली-कड़ी CE-ईएसआई अंतरफलक के रिसाव मुक्त आपरेशन के लिए कनेक्शन । पिछले प्रोटोकॉल31,३२ के लिए देखें इस अंतरफलक के विधानसभा और मुसीबत शूटिंग पर विवरण के लिए ।
          नोट: केशिका आयाम सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एस/एन) और जुदाई की अवधि को प्रभावित करते हैं । उदाहरण के लिए, संकीर्ण-बोर और लघु केशिकाओं उच्च जुदाई वोल्टेज का उपयोग तेजी से जुदाई की सुविधा४२,४३। इसके अतिरिक्त, एक अध्ययन में रुचि के अणुओं के प्रकार पर निर्भर करता है, जुदाई केशिकाओं को कम करने के लिए लेपित किया जा सकता है/अवांछित अणु-केशिका दीवार इंटरैक्शन४४से बचें ।
      3. एक प्लेट धारक का प्रयोग, एक तीन अक्ष अनुवाद मंच और स्थिति electrospray उत्सर्जक टिप ~ 2 मिमी जन स्पेक्ट्रोमीटर छिद्र (चित्रा 1c) से पर CE-ईएसआई इंटरफेस माउंट ।
      4. अंतरफलक के घटकों को साफ करने के लिए, 1 µ l/मिनट पर electrospray उत्सर्जक के माध्यम से electrospray म्यान समाधान की आपूर्ति और CE जुदाई केशिका के माध्यम से BGE द्वारा कुल्ला । सिरिंज पंपों का उपयोग करने के लिए एक स्थिर दर पर सॉल्वैंट्स फ़ीड ।
      5. एक सिरिंज केशिका प्रवेश अंत करने के लिए जोड़ने के द्वारा प्रत्येक माप से पहले CE जुदाई केशिका फ्लश. को कम करने और विलायक आपूर्ति लाइनों की भड़काना पर्याप्त बड़ी सीरिंज का प्रयोग करें ।
        नोट: प्रयोग आम तौर पर 1 मिलीलीटर गैस तंग सीरिंज electrospray म्यान विलायक और एक ५०० µ एल सिरिंज जुदाई केशिका फ्लश की आपूर्ति करने के लिए उपयोग करें ।
    3. CE-ईएसआई-एमएस प्लेटफार्म और चयापचयों के माप का सत्यापन
      नोट: इस कदम के लक्ष्य के लिए CE-ईएसआई-एमएस साधन के विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता की पुष्टि दैनिक एकल-सेल निष्कर्षों का विश्लेषण करने से पहले है ।
    CE-ईएसआई मंच का उपयोग यहां वर्णित है, हम ६० पर पता लगाने की एक कम सीमा को पूरा कर सकते है एक quadrupole ओर्थोगोनल-त्वरण समय के उड़ान मास स्पेक्ट्रोमीटर16का उपयोग कर अमोल ।
    1. ~ 5 मिनट के लिए जुदाई केशिका धोने के बाद, एक स्टेनलेस स्टील की शीशी में स्थित BGE समाधान में अपनी प्रवेश हस्तांतरण ।
    2. स्थिति electrospray उत्सर्जक टिप ~ 2 मिमी मास स्पेक्ट्रोमीटर छिद्र से और ठीक-इस दूरी को समायोजित एक अनुवाद चरण का उपयोग करने के लिए स्थिर शंकु जेट शासन में electrospray उत्पन्न करते समय एक stereomicroscope का उपयोग कर स्प्रे की निगरानी (संदर्भ देखें 31,४५) । स्थिर आपरेशन सुनिश्चित करने के लिए ~ 30-45 मिनट के लिए कुल आयन वर्तमान (टिक) की स्थिरता की निगरानी ।
    3. लागू करें ~ BGE शीशी के लिए 20 केवी धीरे से ऊपर क्षमता रैंप पर ~ 15 एस, आम तौर पर पैदा ~ ७.५ जुदाई केशिका भर में वर्तमान µA 1% BGE के रूप में अंलीय एसिड का उपयोग कर । प्रत्येक माप से पहले, ~ 5-10 मिनट के लिए टिक प्रोफाइल की निगरानी द्वारा प्रणाली स्थिरता सुनिश्चित करने, और फिर चरण वार कम जुदाई (CE) 0 वी (जमीन) की क्षमता ।
      नोट: इस प्रक्रिया को अर्ध-स्वचालित करने के लिए, हम दूरस्थ रूप से CE उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति को नियंत्रित करने के लिए एक कस्टम-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग31। यदि ce-ईएसआई-एमएस मंच अस्थिर है, ध्यान से अस्थिरता के स्रोत का मूल्यांकन केवल ईएसआई मोड में ce-ईएसआई एमएस प्लेटफॉर्म पहले परीक्षण और फिर ce-ईएसआई संचालन मोड में के रूप में की सिफारिश की कहीं31। संक्षेप में, केवल ईएसआई मोड में मंच का परीक्षण करने के लिए, CE उच्च वोल्टेज बंद और शंकु-जेट छिड़काव शासन में ~ 30 मिनट के लिए टिक की निगरानी । यदि आवश्यक हो, तो पता त्रुटियों के लिए निम्नानुसार आगे बढ़ना: (i) लीक के लिए कनेक्शन का निरीक्षण; (२) जल, isopropanol, जल, और मेथनॉल के साथ electrospray उत्सर्जक को स्वच्छ करना; (iii) de-गैस सॉल्वैंट्स; (iv) फिर से परीक्षण से पहले ~ 25 मिनट के लिए उत्सर्जक फ्लश । यदि ce-ईएसआई मंच में स्थिर पाया जाता है ईएसआई केवल मोड लेकिन ce जुदाई के दौरान अस्थिर हो जाता है, जूल हीटिंग और/इलेक्ट्रोलिसिस के लिए प्रणाली का निरीक्षण: (i) BGE के साथ जुदाई केशिका फ्लश ~ 25 मिनट के लिए और प्रयोग दोहराने; (ii) एक रैखिक Ohmic प्रतिक्रिया (यानी, रैखिक CE वर्तमान बनाम जुदाई वोल्टेज वक्र) बनाए रखने के लिए कम जुदाई क्षमता का उपयोग करें; (iii) संभावित क्षतियों के लिए CE केशिका का निरीक्षण, जैसे दरारें, और यदि आवश्यक हो तो केशिका की जगह ।
    4. विश्लेषण ~ 6 नमूने के nL निंनानुसार:
      1. पिपेट इंजेक्शन शीशी में acetylcholine मानक समाधान के 1 µ l ।
      2. इंजेक्शन शीशी में BGE शीशी से पृथक्करण केशिका स्थानांतरण ।
      3. 1s में CE इंजेक्शन चरण 15 सेमी उठा ।
      4. ६० एस के लिए ऊंचा स्टेज पकड़ो hydrodynamically इंजेक्षन करने के लिए ~ 6 नमूने के nL जुदाई केशिका में ।
      5. बाद में, स्तर शुरू करने के लिए वापस मंच का अनुवाद (केशिका आउटलेट के साथ लाइन में) ।
      6. धीरे BGE में केशिका प्रवेश अंत चाल ।
      7. तुरंत बाद, electrophoretic जुदाई शुरू करने के लिए CE वोल्टेज रैंप ऊपर.
      8. MS डेटा प्राप्ति प्रारंभ करें ।
        नोट: सिस्टम प्रदर्शन किसी भी रासायनिक मानक का उपयोग कर विशेषता हो सकती है । एकल-कक्ष CE-ईएसआई-MS का पता लगाने की कम सीमा उद्धार ~ 10 एनएम (~ ६० अमोल) के लिए acetylcholine, मिथीयोनाईन, और histidine16। मात्रा (Vinj) इंजेक्शन, nL में केशिका में, ऊंचाई अंतर पर निर्भर करता है (एच, सेमी) इंजेक्शन के दौरान, घनत्व (दर्षाया, जी सेमी-3) और चिपचिपापन (η, केजी एम-1एस-1) के BGE, लंबाई (एल, एम) और त्रिज्या (आर, µm) के CE केशिका, और इंजेक्शन अवधि (टीinj, एस) । इस संबंध निम्नलिखित सूत्र द्वारा व्यक्त किया जाता है, जहाँ g (m s-2) गुरुत्वाकर्षण त्वरण है:
        Equation
    5. एक बार मानक का पता लगाया गया है, बंद करो डेटा अधिग्रहण, कम जुदाई वोल्टेज stepwise 0 वी (जमीन) के लिए, तो छिद्र से 2 सेमी के लिए उत्सर्जक पुनः प्राप्त । सेल निकालने का विश्लेषण करने से पहले 5 मिनट के लिए जुदाई केशिका फ्लश ।
    6. उपाय दोहराएं द्वारा एकल-सेल निकालने के 10 nL 3.3.1-3.3.5 का उपयोग ९० एस hydrodynamically सुई नमूना ।
  • डेटा प्रोसेसिंग
    नोट: डेटा प्रोसेसिंग के लक्ष्य की पहचान और एकल कोशिकाओं के बीच यौगिकों को यों तो बढ़ाता है । एकल-कक्ष CE-ईएसआई-MS प्रोटोकॉल कुछ सेकंड के विशिष्ट आधार चौड़ाई के साथ संकीर्ण electropherographic चोटियों उत्पन्न करता है । निम्न चरणों का उपयोग करके डेटा विश्लेषण अर्द्ध-मैन्युअल रूप से निष्पादित करके, आणविक सुविधाओं (अनन्य माइग्रेशन समय के साथ अद्वितीय m/ चित्र 2aमें चयनित पहचाने गए चयापचयों के लिए प्रतिनिधि पृथक्करण दिखाया जाता है ।
    1. जन-जांच कच्चे डेटा फ़ाइलें पोस्ट डेटा अधिग्रहण ।
      नोट: हम सोडियम प्रारूपण समूहों है कि नमूने से प्रचुर मात्रा में सोडियम आयनों की जुदाई के दौरान उत्पंन कर रहे हैं, जो natively कोशिकाओं में मौजूद है या भ्रूण संस्कृति मीडिया से निकाले से संकेतों का उपयोग करें । इस चरण का लक्ष्य एक उच्च द्रव्यमान सुनिश्चित करके बाद के चरणों में metabolite पहचान को बढाना है (m/z) सटीकता, अधिमानतः & #60; 5 एमडीएस, या & #60; 10 पीपीएम, m/z 50-1000 के बीच । यहां, पोस्ट डेटा अधिग्रहण अंशांकन यह संभव नियमित रूप से प्राप्त करने के लिए बनाता है मास accuracies & #60; 1 एमडीए, या & #60; 2 पीपीएम के लिए m/z 50-500 ।
    2. एक प्रसंस्करण स्क्रिप्ट का प्रयोग, पता लगाया जन रेंज भर में आणविक सुविधाओं के लिए खोज । प्रत्येक चोटी में औसत द्रव्यमान स्पेक्ट्रा सटीक द्रव्यमान निर्धारित करने के लिए, और उनके इसी प्रवास के समय नीचे ध्यान दें । m/z 50-500 रेंज में कम मास चयापचयों की पहचान के लिए, S/N & #62; 3 के साथ आणविक सुविधाओं पर नजर रखने के लिए एक ५०० एमडीए कदम खिड़की का उपयोग करें ।
    3. प्रत्येक आणविक सुविधा के लिए स्वयं या स्वचालित रूप से पीक क्षेत्र-में-वक्र एकीकृत । परिणामस्वरूप क्षेत्र मूल्यों metabolite बहुतायत के एक उपाय के रूप में उपयोग किया जाता है ।
    4. इस प्रकार के रूप में उच्च विश्वास के साथ ब्याज की आणविक सुविधाओं की पहचान (अंजीर देखें.
    • बी) ।
    1. सबसे पहले, एक metabolite डेटाबेस के खिलाफ आणविक सुविधाओं के सटीक द्रव्यमान की तुलना (उदा, Metlin४६ और HMDB४७) 10 पीपीएम सटीकता के साथ ख्यात मास मैचों की एक सूची प्राप्त करने के लिए ।
    2. अगले, उनके मिलकर बड़े पैमाने पर metabolite डेटाबेस या मिलकर बड़े पैमाने पर इसी रासायनिक मानक के लिए मापा स्पेक्ट्रम में उपलब्ध डेटा के साथ सेल के अर्क से प्राप्त स्पेक्ट्रम की तुलना द्वारा इन सामूहिक मैचों का मूल्यांकन ।
    3. पिछले, आणविक एक ही CE-ईएसआई-एमएस इंस्ट्रूमेंट द्वारा विश्लेषण संबंधित रासायनिक मानकों के साथ सेल निष्कर्षों में दर्ज सुविधाओं के प्रवास के समय की तुलना करके इन कार्य को मांय ।
      नोट: प्रायोगिक प्रवाह को बढ़ाने के लिए, हम आम तौर पर केवल आणविक सुविधाओं कि सांख्यिकीय प्रयोगात्मक स्थितियों या सेल प्रकार के बीच काफी अलग है की पहचान । प्रतिनिधि पहचान आरेख 2में दिखाए जाते हैं । उच्च बड़े पैमाने पर सटीकता के साथ चयापचयों की पहचान करने के लिए, हम बाहरी जन स्पेक्ट्रोमीटर दैनिक जांच, एक आंतरिक मानक का उपयोग करते हुए प्रत्येक माप के दौरान वास्तविक समय reअंशांकन प्रदर्शन, और/ फ़ाइल पोस्ट-डेटा प्राप्ति (उदा., यहां सोडियम फॉर्मेटिंग क्लस्टर के लिए) की सिफारिश की गई है ।
  • एकल कोशिकाओं के बीच छोटे-अणु उत्पादन की तुलना करने के लिए, यौगिक बहुतायत के सापेक्ष उपाय के रूप में चयनित आयन electropherograms में (स्टेप 3.4.3 से) पीक क्षेत्र-के अंतर्गत वक्र का उपयोग करें.
    नोट: हमारे प्रयोगों में, ऑनलाइन सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों४७ निम्नलिखित चरणों सहित अनुवर्ती डेटा विश्लेषण के सभी चरणों को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था: i) प्रत्येक नमूना सेट (उदा., सेल के कम से ५०% में घटना के साथ आणविक सुविधाओं की फ़िल्टरिंग प्रकार); ii) डेटा का सामांयीकरण; iii) सांख्यिकीय (उदा., t-परीक्षण) और बहुभिंनरूपी डेटा विश्लेषण, जैसे कि प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (पीसीए) और श्रेणीबद्ध क्लस्टर विश्लेषण (HCA) । हम p & #60; ०.०५ (Student ' s t-test) का उपयोग सांख्यिकीय महत्व को चिह्नित करने और गुना-परिवर्तन ≥ १.५ को जैविक महत्व पर ध्यान दें.
  • एक एकल कोशिका में एक छोटे से अणु की निरपेक्ष एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, अंशांकन के शास्त्रीय तरीकों को लागू (उदा., बाहरी अंशांकन या मानक इसके अलावा) पीक क्षेत्र का उपयोग करते हुए, ब्याज16के यौगिक के वक्र ।

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    Representative Results

    हम हाल ही में microprobe एकल सेल CE-ईएसआई-एमएस में स्वतंत्र रूप से विकासशील Xenopus laevis भ्रूण29,30विकसित करने में व्यक्ति की पहचान की कोशिकाओं में चयापचयों विशेषताएं कार्यरत हैं । microprobe (~ 5 सेकंड/सेल), सीटू की आकांक्षा में सक्षम बनाता है एक व्यक्ति सेल से ~ 10 nL, एक ही सेल, या जीवित भ्रूण के विकास के एक ही या बाद के चरणों के भीतर कई अलग कोशिकाओं की कई आकांक्षाओं (आंकड़ा 1b) । aspirated सेलुलर सामग्री एक उपयुक्त विलायक और चयापचयों का उपयोग कर निकाला तो अलग कर रहे है और कस्टम-CE-ईएसआई इंटरफेस का उपयोग कर रहे है और MS. सामांयतया द्वारा पता लगाया, दृष्टिकोण पैदावार ~ ३०० बेमानी metabolite संकेतों (हटाने के बाद प्रत्येक कोशिका से isotopic और क्लस्टर चोटियों). पृथक्करण चित्रा 2aमें चुनिंदा अणुओं के लिए उदाहरण है । हम छोटे ध्रुवीय चयापचयों के रूप में उच्च विश्वास के साथ ७० अलग संकेतों की पहचान की, प्रवास के समय और सेल निकालने के संकेतों के एमएस/एमएस विखंडन पैटर्न के आधार पर, एक मानक या मिलकर जन वर्णक्रमीय पुस्तकालयों से उन लोगों की तुलना में । उदाहरण के लिए, आरेख b जानकारी के इन ओर्थोगोनल टुकड़ों के संयोजन के आधार पर histidine की आश्वस्त पहचान दिखाता है ।

    microprobe CE-ईएसआई-एमएस एकल कोशिकाओं के बीच चयापचय मतभेद के ठहराव के लिए अनुमति देता है । CE-ईएसआई-MS 8% RSD के अंतर्गत-वक्र शिखर क्षेत्रों में चयनित-आयन electropherograms16,30के आधार पर एक मात्रात्मक दोहराव है । microprobe नमूना के साथ, इस तकनीकी reproducibility है 14% RSD30, जो एक सांख्यिकीय और जैविक महत्व के लिए कोशिकाओं के बीच चयापचय गतिविधि मतभेदों को क्वेरी करने के लिए पर्याप्त है । एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 3 से पता चलता है कि सूक्ष्म CE-ईएसआई-MS तीन पृष्ठीय सेल प्रकार (चित्रा 3) के सीटू माइक्रो-नमूना में सक्षम है । इसके अलावा, मात्रात्मक मेटाडाटा के पीसीए 8 सेल भ्रूण की एक पहचान जनक सेल के रूप में खुला चयापचय परिवर्तन (D1R सेल देखें) 16-सेल में एक सेल क्लोन फार्म (D11R सेल देखें) और ३२-सेल (D111R सेल) भ्रूण (चित्र 3 बी) के रूप में विभाजित । प्रतिनिधि रुझान आरेख 3सी में चयन चयापचयों के लिए दिखाए जाते हैं । चयापचयों जैसे acetylcholine कोशिका विभाजन के साथ बहुतायत में कम है, जबकि trolamine और Ser-Arg इन सेल प्रकार में प्रवृत्तियों का विरोध दिखाया । Trolamine 8 से बहुतायत में कमी आई-16 सेल भ्रूण को और फिर ३२-सेल भ्रूण में समृद्ध हो गया, जबकि Ser-Arg 16-सेल भ्रूण ३२ में कम करने से पहले सेल भ्रूण को बढ़ाने के द्वारा एक विपरीत प्रवृत्ति को दर्शाया गया है । Arginine इन सेल चरणों के बीच बहुतायत में काफी परिवर्तन नहीं किया । इन प्रवृत्तियों को मूलभूत प्रक्रियाओं पर अधिक प्रकाश डालता है जो X. laevisके प्रारंभिक विकास चरणों को आबाद करने की अपेक्षा की जाती है ।

    Figure 1
    चित्रा 1: के लिए प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह में सीटू microprobe एकल सेल केशिका ट्रो (CE) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस). (क) गढ़े हुए micropipettes (ऊपर) से पहले और (नीचे) microsampling में उपयोग के लिए 20 µm बाहरी व्यास के लिए टिप सट के बाद । (ख) Microsampled कोशिकाओं 16 सेल मंच को विकसित 8 सेल भ्रूण के रूप में विभाजित करने के लिए जारी, vivo अध्ययन में के लिए मंच खोलने । (ग) की पहचान एकल कोशिकाओं 8-सेल Xenopus laevis भ्रूण में एक microprobe (µ पी) का उपयोग कर नमूने थे (V1R और D1R कोशिकाओं को देखें), सेल चयापचयों निकाला और CE-MS. स्केल सलाखों के उपयोग का विश्लेषण = २५० µm (डार्क/ 10 मिमी (सफेद) । कुंजी: एसपी, सिरिंज पंप. (संदर्भ से अनुमति के साथ अनुकूलित आंकड़े29,30.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2: Microprobe एकल-कक्ष CE-MS चयापचयों की विश्वास पहचान सक्षम करता है. (क) प्रतिनिधि electropherogram के लिए चुने गए पहचान चयापचयों. (B) metabolite मानक के विरुद्ध सटीक मास, माइग्रेशन समय, और विखंडन संबंधी डेटा (टक्कर-प्रेरित पृथक्करण) की तुलना के आधार पर histidine की पहचान । कुंजी: 1, मिथाइल histidine; 2, homolysine; सैम, एस-adenosylmethionine; Orn, ornithine; चहा, triethylamine; कार, carnitine; AcCho, acetylcholine; AcCar, acetylcarnitine; HPX, hypoxanthine; GSH, glutathione । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3: एकल कक्षों के बीच मात्रात्मक चयापचय अंतर जो X. laevisमें पृष्ठीय वंशावली बनाते हैं । (क) 8 सेल भ्रूण के जनक D1R सेल की ऑप्टिकल छवियां, और उसके वंशज, 16-सेल भ्रूण में D11R सेल और ३२ सेल भ्रूण में D111R सेल । । (B) इन तीन सेल प्रकारों में चयापचयों मात्रा का मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) भिंन चयापचय प्रोफाइल का पर्दाफाश करता है । प्रत्येक डेटा बिंदु किसी भिंन कक्ष (संख्याओं को देखें) जो तकनीकी प्रतिकृति (कनेक्टेड पॉइंट्स) में मापा गया था को नोट करता है । दीर्घवृत्त चिह्न ९५% विश्वास । (ग) प्रसरण का विश्लेषण (ANOVA) और पोस्ट-हॉक फिशर का कम से महत्वपूर्ण विभेदक विश्लेषण कक्ष चरणों में जटिल चयापचय प्रवृत्तियों का पता चलता है । बॉक्स भूखंडों के लिए, वर्ग मतलब है, बॉक्स 1 मतलब (sem) की × मानक त्रुटि है, और मूंछ १.५ × sem है. Key: *p & #60; ०.०५; एनएस, कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है । स्केल पट्टियां = २५० µm. (संदर्भ से अनुमति के साथ अनुकूलित आंकड़े30.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    Microprobe CE-ईएसआई-एमएस रहते हैं, स्वतंत्र रूप से भ्रूण के विकास में एकल कोशिकाओं में चयापचयों के प्रत्यक्ष लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है । दृष्टिकोण के दिल में दो तकनीकी उपघटक हैं, अर्थात् में सीटू केशिका microsampling और उच्च संवेदनशीलता CE-ईएसआई-MS. पूरे सेल विच्छेदन की तुलना में, केशिका microsampling तेजी से आपरेशन (कुछ सेकंड बनाम 5 मिनट का लाभ है विच्छेदन से/cell), भ्रूण के परिसर में तीन आयामी आकृति विज्ञान के साथ संगतता, और छोटे कोशिकाओं के लिए दरिद्रता कि विकास के बाद के चरणों में फार्म । विच्छेदन के विपरीत, microprobe नमूना बाद विश्लेषण के लिए बरकरार भ्रूण में अन्य कोशिकाओं को छोड़ देता है । पेचीदा, microsampled कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, सेल भेदभाव के दीर्घकालिक अध्ययन के लिए संभावना स्थापना जारी रख सकते हैं। microprobe के टिप आकार को नियंत्रित करने की क्षमता भी microprobe CE-ईएसआई-MS कोशिकाओं और विकासात्मक प्रक्रियाओं में चयापचय की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में सेवा करने के लिए अनुमति देता है zebrafish और माउस सहित अन्य मॉडल जीवों, का उपयोग कर. विश्वसनीय परिणाम आश्वस्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि ब्याज की कोशिकाओं को ठीक है, सही है, और लगातार पहचान और नमूना है । आकांक्षा के प्रायोगिक मापदंडों (जैसे, केशिका आयाम, दबाव, और समय) एक सेल के एक वांछित हिस्से के नमूने के अनुरूप किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, यह भ्रूण को स्थिर करने के लिए ब्याज की कोशिका को लक्षित करने में परिशुद्धता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है, जो बदले में भ्रूण को नुकसान को कम करता है । इस प्रोटोकॉल में, हम agarose-लेपित पेट्री व्यंजन के भीतर कुओं बनाया नमूना के दौरान भ्रूण को स्थिर करने के लिए । हमारे अनुभव में, बेवल्ड युक्तियों वाली केशिकाएं कुंद युक्तियों की तुलना में कक्ष को ंयूनतम क्षति सुनिश्चित करती हैं । और नमूना और रासायनिक विश्लेषण के प्रवाह में सुधार कोशिकाओं की बड़ी आबादी के लक्षण वर्णन सक्षम हो जाएगा, इस प्रकार सांख्यिकीय विश्लेषण को सशक्त बनाने के लिए महत्वपूर्ण चयापचयों अंतर्निहित सेल और विकास प्रक्रियाओं की पहचान ।

    CE-ईएसआई-MS का उद्देश्य ट्रेस स्तर संवेदनशीलता में metabolome के लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए है । CE ऐसे नैनो प्रवाह तरल क्रोमैटोग्राफी या गैस क्रोमैटोग्राफी के रूप में अन्य लोकप्रिय जुदाई तकनीक, पर एकल सेल अध्ययन के लिए पूरक लाभ प्रदान करता है. सीई जटिल metabolome को संबोधित करने के लिए उत्तम पृथक्करण दक्षता प्रदान करता है । CE के भौतिक आयाम एकल कक्षों से परिणाम वॉल्यूम-सीमित नमूने के साथ संगत हैं । इसके अतिरिक्त, विभिन्न संवर्धन तकनीक CE में मौजूद (उदा., स्तंभ पर नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए, क्षेत्र-प्रवर्धित नमूना स्टैकिंग या गतिशील पीएच जंक्शन) इस प्रकार का पता लगाने संवेदनशीलता बढ़ाने. सफल अध्ययन के लिए, CE-ईएसआई-एमएस साधन विशेषता और दैनिक पुष्टि की जानी चाहिए । उदाहरण के लिए, हम की आवश्यकता होती है एक S/N के लिए कम से ६० के लिए 3 acetylcholine मानक के अमोल (6 nL के ५० एनएम मानक इंजेक्शन) और एक reproducibility के & #60; 5% RSD जुदाई में (माइग्रेशन) समय और & #60; पीक एरिया के आधार पर ठहराव में 25% RSD-अंडर-वक्र में मानक के लिए चयनित-आयन electropherograms. ट्रेस-संवेदी पता लगाना और गतिशील ठहराव चयापचयों के विविध प्रकार के माप की सुविधा (और पेप्टाइड्स) एकल कोशिकाओं में एकाग्रता की एक व्यापक रेंज फैले CE-ईएसआई-MS6,16,25 का उपयोग कर , 31. जब हम नियमित रूप से पता लगाने ~ ३०० अलग सकारात्मक आरोप लगाया metabolite संकेतों, CE-MS भी नकारात्मक ionization मोड के साथ संगत है४८, इस प्रकार एकल कोशिका metabolome के detectable हिस्से की गहराई को बढ़ाने.

    हालांकि एक्स. laevis विकास के अध्ययन के लिए इस तकनीक के निर्माण में कई फायदे की पेशकश की, microprobe CE-ईएसआई-एमएस भी मॉडल जीवों के अन्य प्रकार के लिए अनुकूलनीय हो सकता है. में Xenopus, रंजकता और आकार प्रतिलिपि सेल भाग्य नक्शे के साथ कोशिकाओं के बीच मतभेद४९ यह ज्ञात ऊतक भाग्य के साथ विशिष्ट कोशिकाओं की पहचान करने के लिए संभव बनाते हैं । यह, बारी में, खोज के लिए दरवाजे खोलता है या कोशिकाओं के रूप में पूरे कोशिका वंश के चयापचय प्रयोगों को लक्षित भेदभाव की ओर विभिंन विकास कार्यक्रमों जमना । कोशिका-चक्र अलग करने के कारण उत्पन्न होने वाले मतभेदों को समाप्त करने के लिए, भ्रूण को पूरी तरह से नमूने से पहले अगले चरण में विभाजित करने की अनुमति दी जानी चाहिए, जैसा कि कहीं५०में दिखाया गया है. Microprobe CE-ईएसआई-एमएस शास्त्रीय embryological जोड़तोड़ या आणविक उपकरण के लिए अनुकूलनीय है (उदा., जीन बाहर दस्तक/चयन कक्ष या कक्ष प्रकार के बीच महत्वपूर्ण dysregulation के साथ छोटे अणुओं के विकासात्मक महत्व का परीक्षण करने के लिए . उदाहरण के लिए, सेल भाग्य ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से ट्रैकिंग के साथ एकल सेल metabolomics के संयोजन पहले से अज्ञात विकास प्रभावों के साथ चयापचयों की खोज के लिए नेतृत्व किया16।

    एकल-सेल metabolomics अध्ययन, विशेष रूप से ठहराव के मामले में विश्लेषणात्मक विवरण के लिए सावधान ध्यान के लिए कॉल; हमारी तकनीक कोई अपवाद नहीं है । आदर्श रूप में, नमूना तैयारी कार्यप्रवाह के प्रत्येक चरण सावधानी से मूल्यांकन किया जाना चाहिए करने के लिए संभावित क्षरण और/या अंतर्जात चयापचयों या संदूषण के नमूनों को नुकसान कम । उच्च शुद्धता denaturing सॉल्वैंट्स का उपयोग (उदा., नियंत्रण रेखा/एमएस ग्रेड), एसिड या कुर्सियां, और कम तापमान (~ 4 डिग्री सेल्सियस) एंजाइमों की गतिविधि बुझाने के लिए सिफारिश कर रहे है और दूर/सहायक विश्लेषण करने से पहले नमूनों में चयापचय परिवर्तन से बचें6 , ५१. सरल कार्बनिक मेथनॉल और acetonitrile पर आधारित समाधान छोटे ध्रुवीय चयापचयों के कुशल निष्कर्षण28अनुमति देते हैं । बेशक, प्रयोग चयापचयों के विशिष्ट वर्गों के लिए लक्षित (उदा, apolar यौगिकों, लिपिड) निष्कर्षण विलायक की संरचना पहले से सिलाई से लाभ । उदाहरण के लिए, हम हाल ही में प्रदर्शन किया है कि निष्कर्षण सॉल्वैंट्स के कई प्रकार के उपयोग के कवरेज को बढ़ाता है एकल सेल metabolome28। इन चयापचयों के ठहराव को आंतरिक मानकों द्वारा सुविधा दी जा सकती है, जैसे isotopically लेबल चयापचयों, जो metabolite निष्कर्षण के दौरान अर्क में नुकीला हो सकता है । आंतरिक मानकों निष्कर्षण और माप चरणों के लिए गुणवत्ता आश्वासन में भी लाभप्रद हैं, इस प्रकार तकनीकी और प्रणाली reproducibility के मूल्यांकन और नमूना analytes की वसूली की सुविधा । पिछले, हम जैविक प्रतिकृति के लिए वकील (अलग भ्रूण से aspirated विभिंन कोशिकाओं) प्रत्येक कोशिका के साथ तकनीकी प्रतिकृति में विश्लेषण (एक ही निकालने के कई बार मापा) के लिए सांख्यिकीय शक्ति और परिणामों की व्याख्या सहायता ।

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    यह काम स्वास्थ्य अनुदान GM114854 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (करने के लिए पीएनएस) और CA211635 (पीएनएस करने के लिए), अर्नोल्ड और माबेल Beckman फाउंडेशन Beckman युवा अन्वेषक अनुदान (पीएनएस करने के लिए), ड्यूपॉंट युवा प्रोफेसर पुरस्कार के लिए (पीएनएस), अमेरिकन सोसायटी फॉर मास स्पेक्ट्रोमेट्री अनुसंधान पुरस्कार (to पीएनएस), और ब्रह्मांड क्लब फाउंडेशन फैलोशिप (R.M.O. और E.P.P. के लिए) । राय और इस प्रकाशन में व्यक्त निष्कर्ष केवल लेखकों के उन है और जरूरी नहीं कि धन स्रोतों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents for Embryo Culture Media
    Potasium chloride Fisher Scientific BP 366-1
    Magnesium sulfate Fisher Scientific M 65-3
    Calcium nitrate Sigma Aldrich C1396
    Cysteine MP Biomedicals 101444
    Trizma hydrochloride Sigma Aldrich T3253
    Trizma base Sigma Aldrich T1503
    Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
    Name Company Catalog Number Comments
    Metabolite Extraction Solvents
    Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
    Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
    Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
    Name Company Catalog Number Comments
    Solvents and Standards for CE-ESI-MS
    Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A11710X1-AMP
    Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
    Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
    Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
    Acetylcholine chloride Acros Organics 159170050
    Name Company Catalog Number Comments
    Microprobe Fabrication Setup
    Micropippette puller Sutter Instrument Co. P-1000
    Borosilicate capillaries Sutter Instrument Co. B100-50-10
    Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel Fine Science Tools (USA) Inc 11252-30 Corrosion resitant and autoclavable.
    Name Company Catalog Number Comments
    Microprobe Sampling Setup
    Micromanipulator Eppendorf, Hauppauge, NY TransferMan 4r
    Stereomicroscope Nikon SMZ18 Should be vibrationally isolated.
    Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
    Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
    Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
    Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
    Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) Fisher Scientific 13-678-20A
    Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R
    Name Company Catalog Number Comments
    CE-ESI-MS Setup
    High voltage power supply Spellman CZE1000R The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.
    Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
    Stereomicroscope Amscope SM-3BZZ Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.
    XYZ translation stage Thorlabs PT3
    XYZ translation stage Custom-built This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary
    Stainless steel sample vials Custom-built
    Stainless steel BGE vial Custom-built
    Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP040105
    Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP075375
    Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) Hamilton Co. 21031A For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.
    Syringes (gas-tight): 500 - 1000 µL Hamilton Co. 1750TTL
    Digital multimeter Fluke Fluke 117
    High-resolution Mass Spectrometer Bruker Daltonics Maxis Impact HD High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI
    Tunning mixture for mass spectrometer calibration Agilent technologies ESI-L G1969-85000
    Data Analysis ver. 4.3 software Bruker Daltonics
    Name Company Catalog Number Comments
    Ancillary Equipment
    Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C Labconco 7310022
    Analytical microbalance (XSE105DU) Fisher Scientific 01911005
    Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1
    Freezer (-80 °C) Fisher Scientific 88300ASP
    Refrigerated Incubator Fisher Scientific 11475126
    Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000

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    References

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    रसायनशास्त्र अंक १३० केशिका ट्रो electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री microsampling metabolomics एकल कोशिका Xenopus मेंढक embryogenesis
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    Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos. J. Vis. Exp. (130), e56956, doi:10.3791/56956 (2017).

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