Summary
हम प्रवाह cytometry द्वारा प्राथमिक गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं पर ल्यूकेमिया स्टेम सेल मार्कर के एक साथ अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा । हम कैसे तीन जनक आबादी और परिपक्वता की डिग्री बढ़ाने के साथ एक ख्यात LSC जनसंख्या यों तो पता चलता है । हम इसी रोगी-व्युत्पंन-xenografts में इन आबादियों की उपस्थिति की पुष्टि की ।
Abstract
घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) एक विषम है, और अगर इलाज नहीं, गंभीर रोग । यह वयस्कों में ल्यूकेमिया से जुड़े मृत्यु दर का सबसे आम कारण है । शुरू में, एएमएल टेम स्टेम सेल (HSC) विभेदन की गिरफ्तारी, ल्यूकेमिया विस्फोट कोशिकाओं के बाद संचय, और कार्यात्मक टेम तत्वों के कम उत्पादन की विशेषता की एक बीमारी है । विविधता ल्यूकेमिया स्टेम सेल (LSC) की उपस्थिति के लिए फैली हुई है, इस गतिशील सेल के विभिन्न चयन ल्यूकेमिया प्रगति और उपचार के दौरान लगाया दबाव पर काबू पाने के लिए विकसित डिब्बे के साथ. LSC जनसंख्या को आगे परिभाषित करने के लिए, CD90 और CD45RA के अलावा multipotent + progenitors-सेल डिब्बे के भीतर सामान्य HSCs और CD34 CD38 के भेदभाव की अनुमति देता है । यहां, हम CD45RA प्रवाह CD90 द्वारा मानव एएमएल के प्राथमिक विस्फोट कोशिकाओं पर कई ख्यात LSC मार्करों (CD34, CD38, multiparametric, cytometry) के एक साथ अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा । इसके अलावा, हम कैसे तीन जनक आबादी और परिपक्वता की डिग्री बढ़ाने के साथ एक ख्यात LSC जनसंख्या यों तो पता चलता है । हम इसी रोगी-व्युत्पंन-xenografts में इन आबादियों की उपस्थिति की पुष्टि की । पता लगाने और ख्यात LSC के ठहराव का यह तरीका नैदानिक अनुवर्ती कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया के ऊपर (यानी, ंयूनतम अवशिष्ट रोग), के रूप में अवशिष्ट LSC एएमएल पतन का कारण हो सकता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) ल्यूकेमिया से जुड़े मृत्यु दर का सबसे आम कारण है । शुरू में, एएमएल टेम स्टेम सेल (HSC) विभेदन की गिरफ्तारी, विस्फोट कोशिकाओं के बाद के संचय, और कार्यात्मक टेम तत्वों के कम उत्पादन की विशेषता की एक क्लोनिंग रोग है । हाल ही में, क्लोनिंग ब्लास्ट सेल जनसंख्या के विविधता अनिवार्य रूप से अगली पीढ़ी sequencing (NGS) रणनीतियों का उपयोग करके स्थापित किया गया है और ट्यूमर कोशिकाओं के अंतर क्लोनल विकास के अस्तित्व को दिखा रहा है1.
विविधता ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम कोशिकाओं (LSC) की उपस्थिति के लिए फैली हुई है । यह इस गतिशील कोशिका डिब्बे ल्यूकेमिया प्रगति और उपचार के दौरान लगाया विभिन्न चयन दबाव पर काबू पाने के लिए विकसित की कल्पना की है । इसलिए LSC वर्तमान कीमोथेरेपी परहेजों और मध्यस्थता रोग पतन के लिए प्रतिरोधी होना चाहिए रहे हैं, गहन नैदानिक निहितार्थ के साथ2. विभिन्न मार्करों CD1233, CLL-14, CD975 या टिम-36की तरह LSC विशेषताएं करने के लिए वर्णित किया गया है । ब्लास्ट सेल के CD34 + CD38-डिब्बे को LSC7 के लिए समृद्ध माना जाता है लेकिन इसमें सामान्य HSC भी शामिल है । CD90 और CD45RA अभिव्यक्ति CD34 + CD38-(P6) डिब्बे (चित्रा 1) के लिए लागू करने के लिए सामांय और घातक टेम के कई चरणों को अलग परमिट8। विशेष रूप से, सामान्य CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent progenitors (करेंटली) जैसे CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-कोशिकाओं और CD34 + CD38-CD90-CD45RA + लसीकावत्-primeed multipotent जनक (LMPP) कोशिकाओं को बहुमत के एएमएल मामलों में निर्धारित किया जा सकता है8 ,9. मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) CD38 के CD34 + सेल डिब्बे के भीतर विचार किया जाना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । क्योंकि CD38 तीव्रता तीन नए सेल डिब्बों को परिभाषित करती है: CD38 नेगेटिव (P6), CD38 मंद (P7) और CD38 ब्राइट (P8) (figure 1) । CD38 के MFI या तो hematogones और/या इन कोशिकाओं दृढ़ता से व्यक्त CD38 के रूप में एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्लाज्मा कोशिकाओं का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है ।
immunodeficient मंजूरी/SCID/IL2Rγcअशक्त (एनएसजी) माउस मॉडल व्यापक रूप से सामान्य और घातक मानव टेम कोशिकाओं के engraftment के लिए प्रयोग किया जाता है10,11. धारावाहिक xenotransplantation परख प्रयोग LSC या HSC समारोह मांय करने के लिए उपयोग किया जाता है । बड़े पैमाने पर अनुक्रमण दृष्टिकोण द्वारा इन अध्ययनों का बड़े पैमाने पर विश्लेषण किया गया है । फिर भी, कम एएमएल विस्फोट जनसंख्या engrafted के LSC और HSC immunophenotype के बारे में जाना जाता है एनएसजी चूहों में अपनी प्राथमिक एएमएल (चित्रा 2) की तुलना में ।
LSC की संख्या स्वाभाविक रूप से कम कर रहे हैं, इस प्रकार की पहचान और LSC के ठहराव चुनौतीपूर्ण और विधि यहां वर्णित निदान पर एक प्रवाह cytometric परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और नैदानिक अनुवर्ती कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए (के रूप में अवशिष्ट LSC मई कारण एएमएल पलटा). LSC की उपस्थिति सकारात्मक ंयूनतम अवशिष्ट रोग (MRD) का संकेत हो सकता है । तारीख करने के लिए, एएमएल में MRD निगरानी ज्यादातर आणविक तरीकों पर भरोसा करतेहैं (यानी, आरटी-पीसीआर, NGS)10,12. हालांकि, इस प्रोटोकॉल में हम CD45RA प्रवाह CD90 द्वारा मानव एएमएल की प्राथमिक विस्फोट कोशिकाओं पर कई HSC/LSC मार्करों (CD34, CD38, multiparametric, cytometry) के एक साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए,8,9। एंटीबॉडी के इस संयोजन किसी भी मानक प्रवाह cytometry प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है और इस प्रवाह MRD परख विशेष रूप से दिलचस्प है जब वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) द्वारा MRD संभव नहीं है, यानी, अगर ल्यूकेमिया विशिष्ट आणविक मार्कर नैदानिक एएमएल नमूना में detectable नहीं हैं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल, और अधिक संवेदनशील आणविक MRD तकनीक के पूरक है, क्योंकि यह पता लगाने और असामांय टेम जनक कोशिकाओं है जो एक कार्यात्मक कोशिका विशेषता (चित्रा 3) का प्रतिनिधित्व करता है का उद्देश्य है ।
हम बताते है कि कैसे तीन टेम जनक आबादी और परिपक्वता के विभिंन डिग्री के साथ ख्यात LSC डिब्बा नैदानिक प्रयोगशालाओं के बहुमत में उपलब्ध एंटीबॉडी के साथ प्रवाह cytometry की मात्रा को बढ़ाता है । इसके अलावा, हम इसी रोगी में इन सेल डिब्बों की उपस्थिति की पुष्टि-व्युत्पंन-xenografts (PDX) और उपचार के ऊपर का पालन करें ।
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Protocol
हम वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए जानवरों के उपयोग के लिए यूरोपीय मानकों का पालन करें । इस अध्ययन को स्थानीय एथिक्स कमेटी (#3097-2015120414583482v3) ने मंजूरी दी थी ।
1. नमूना तैयारी
- अस्थि मज्जा के प्रति मिलीलीटर 1.8 मिलीग्राम की एकाग्रता पर थक्कारोधी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त ट्यूबों में de नोवो एएमएल से हड्डी मज्जा (2 एमएल) ले लीजिए ।
- Ficoll जुदाई प्रदर्शन, एक घनत्व ढाल जुदाई लाल कोशिकाओं और granulocytes से mononuclear कोशिकाओं को अलग करने के लिए, के रूप में पीछा किया । फॉस्फेट बफर खारा के 3 संस्करणों में अस्थि मज्जा पतला (पंजाब: NaCl 137 मिमी, KCl 2.7 mm, Na2HPO4 10 मिमी, KH2पीओ4 1.8 मिमी). ध्यान से पतला अस्थि मज्जा की 1 मात्रा के साथ Ficoll के 1 मात्रा ओवरले । ब्रेक के बिना 300 x g पर 30 मिनट स्पिन । एक नया बाँझ ट्यूब में mononucleated कोशिकाओं के सफेद buffy कोट परत स्थानांतरण.
- दो बार पंजाब के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धो) और 5 मिनट के लिए 300 x जी में केंद्रापसारक, ताकि दूषित सीरम घटकों को दूर करने के लिए ।
2. लाल रक्त कोशिकाओं के Lysis (आरबीसी)
- lysis बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें (अमोनियम क्लोराइड 0.8%) सेल गोली, भंवर धीरे करने के लिए और कमरे के तापमान पर 5 min. के लिए 5 मिनट के लिए 300 x g पर मशीन ।
नोट: यदि आवश्यक हो, तो इस चरण को दोहराएँ । - पहले वर्णित (1.3.) के रूप में पंजाब में कोशिकाओं को धो लें ।
3. रोगी व्युत्पंन xenografts ।
- Ficoll जुदाई के बाद अस्थि मज्जा से विस्फोट कोशिकाओं को प्राप्त करने और immunomagnetic नकारात्मक चयन का उपयोग कर लिम्फोसाइटों कमी के बाद (टी के लिए CD3-, और बी CD20 के लिए लिम्फोसाइटों). निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
- बिना शर्त एनएसजी चूहों की पूंछ की नस में 5 x 106 एएमएल ब्लास्ट कोशिकाओं को इंजेक्ट करे । पूंछ नस इंजेक्शन की सुविधा के लिए एक निरोधक उपकरण का प्रयोग करें । चूहों पारंपरिक स्थितियों के तहत और विशेष रूप से विशिष्ट-रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत हर समय, व्यक्तिगत हवादार पिंजरों का उपयोग करके और लामिना फ्लो हूड के तहत हेरफेर द्वारा रखें । हर दो हफ्तों में, एक हेमाटोक्रिट केशिका का उपयोग अवअधोहनुज संग्रह विधि द्वारा रक्त की 60 µ एल ले । एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में केशिका प्लेस । कोमल एक छोटे से बाँझ धुंध पैड का उपयोग कर दबाव लागू करने से खून बंद करो । एक साफ सिरिंज के साथ रक्त Expulse ।
- lysis बफर के 1ml जोड़ें और 5min के लिए मशीन । फिर 5min के लिए 300 x जी पर केंद्रापसारक । पंजाब और centrifugre के साथ 5 मिनट के लिए 300 x g पर धो लो । निकालें supernatant, 10% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ 100 µ एल पंजाबियों (BSA) दाग 3 µ एल विरोधी मानव CD45-FITC और 1 µ एल विरोधी murine CD45 के साथ-APC और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
- धो सेल गोली दो बार पंजाब में (2 मिलीलीटर) 10% BSA के साथ और 5 मिनट के लिए 300 x g पर केंद्रापसारक ।
- Aliquot अप करने के लिए 1 एक्स 106 कोशिकाओं के प्रति 100 µ एल पंजाबियों के प्रवाह cytometry ट्यूबों में ।
- CD45 अभिव्यक्ति (ह्यूमन बनाम murine) का chimerism विश्लेषण करके हर दो सप्ताह में सर्वेक्षण engraftment प्रवाह cytometry (चित्रा 2a और बी) का उपयोग कर ।
- बलिदान पर (परिधीय विस्फोट गिनती से अधिक 70% या बीमारी के गंभीर नैदानिक लक्षण), कुचल तिल्ली से mononuclear विस्फोट कोशिकाओं को इकट्ठा करने और tibias और femurs से फ्लशिंग द्वारा अस्थि मज्जा से पहले वर्णित के रूप में13. Euthanize चूहों गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के बाद ।
- यदि सेल गोली आरबीसी शामिल, lysis बफर के साथ लाल रक्त कोशिकाओं के lysis प्रदर्शन (2.1 कदम) ।
- धो कोशिकाओं 10% BSA और 5 मिनट के लिए 300 x g पर केंद्रापसारक के साथ (2 मिलीलीटर) पंजाब में दो बार गोली ।
- कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 100 µ के प्रति 1 x 106 कोशिकाओं को aliquot फ्लो cytometry ट्यूबों में पंजाबियों के एल ।
4. सना
- संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें (4.2 कदम देखें) और भंवर । कमरे के तापमान पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाओं ।
- एंटी-CD36-FITC, 5 µ एल के एंटी-CD19-ECD के 10 µ l से मिलकर मानव प्राथमिक या PDX नमूनों के लिए निम्नलिखित पैनल का प्रयोग करें, 5 µ l के एंटी-CD33-पीसी 5.5, 5 µ l की एंटी-CD90-सुरक्ष, 5 µ l की एंटी-CD34-AA700, 5 µ l की एंटी-CD45RA-सुरक्ष-H7, 5 µ l के विरोधी CD38-प्रशांत नीला, 5 µ l के एंटी-CD123-PC7 और 2.5 µ l का एंटी-CD45-KO.
- 5 मिनट के लिए 300 x g पर केंद्रापसारक द्वारा पंजाब के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धोने से असीम एंटीबॉडी निकालें ।
- अंतिम प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए पंजाब के 450 µ एल में पुन: निलंबित कक्ष ।
5. फ्लो cytometry एनालिसिस के लिए गेटिंग स्ट्रैटेजी
- लाल, नीले और बैंगनी पराबैंगनीकिरण से सुसज्जित एक प्रवाह cytometer पर डेटा अर्जन (कम 500,000 कक्ष) निष्पादित करें. cytometer सेटिंग्स की जांच करें 1 के लिए हर दिन) ऑप्टिकल संरेखण, 2) द्रव प्रणाली, 3) ऑप्टिकल संवेदनशीलता, और 4) fluorospheres का उपयोग मानकीकरण
- CD38 व्यंजक (आरेख 1) को परिभाषित करने के लिए क्रमिक गेटिंग कार्यनीति का पालन करें ।
- hematogones या प्लाज्मा कोशिकाओं जो CD38 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा परिभाषित करने के लिए सामान्य अस्थि मज्जा नमूनों से कोशिकाओं का उपयोग करें ।
नोट: यह गेट विशेष रूप से बाद ख्यात LSC आबादी के रूप में मूल्यांकन महत्वपूर्ण है इसकी परिभाषा पर निर्भर करते हैं । - CD45dim/एसएससी (साइड स्कैटर) कम जनसंख्या मानदंड (चित्र 1a) द्वारा शारीरिक पुरोगामी कोशिकाओं (सामान्य विस्फोट कोशिकाओं) को परिभाषित करें । इस विस्फोट जनसंख्या के भीतर, परिभाषित hematogones, जो एक CD38 + + CD19 + phenotype (चित्र 1b) और अंत में, CD36 और CD33 अभिव्यक्ति का उपयोग myeloblasts, monoblasts, और erythroblasts (चित्रा 1C) को परिभाषित करने के लिए प्रदर्शित करते हैं । (आरेख 1E) में दर्शाए अनुसार hematogones पर CD34 व्यंजक का निर्धारण करें । P6-P10 (चित्र 1 d) के रूप में परिभाषित विस्फोट कोशिकाओं के भीतर पुरोगामी के कई उपजनसंख्याों का आकलन करें । पूर्व निर्धारित जनक गेट्स के आधार पर P6, P7, P8 CD38 उपआबादी में विस्फोट कोशिकाओं के CD34 डिब्बे को अलग करें । सुनिश्चित करें कि P8 डिब्बा विस्फोटों कि hematogones के रूप में एक ही CD38 तीव्रता है, कि P6 कोशिकाओं को शामिल CD38 CD38 ऋण एक (प्रतिदीप्ति) नियंत्रण पर आधारित है और यह है कि FMO कोशिकाओं के संबंध में दो चरम सीमाओं के बीच में है P7 अभिव्यक्ति (चित्र 1 d) ।
- hematogones या प्लाज्मा कोशिकाओं जो CD38 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा परिभाषित करने के लिए सामान्य अस्थि मज्जा नमूनों से कोशिकाओं का उपयोग करें ।
- CD34 + ३८-(P6) gated कोशिकाओं से, पृथक HSC से ख्यात LSC का प्रयोग CD90 और CD45RA अभिव्यक्ति (चित्रा 1F) से करें.
नोट: HSC phenotype CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-और multipotent progenitors (करेंटली) को CD34 + CD38-CD90-CD45RA-के रूप में परिभाषित किया गया है । ख्यात LSC phenotype CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + है और अधिक अपरिपक्व बहाव जनसंख्या लसीकावत्-प्राइमेड progenitors (LMPP) CD34 + CD38-CD90-CD45RA + के रूप में परिभाषित कर रहे हैं ।
6. आरटी द्वारा MRD मॉनिटरिंग-पीसीआर
- पहले14वर्णित के रूप में आर टी-पीसीआर द्वारा MRD स्तरों की निगरानी ।
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Representative Results
यहां हम सामांय और घातक मानव अस्थि मज्जा के नमूनों में जनक आबादी निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । हम एक सफल PDX से अस्थि मज्जा और तिल्ली एकत्र और ऊपर वर्णित के रूप में multiparametric प्रवाह cytometry प्रदर्शन किया । हम नैदानिक रोगी नमूना और इसी PDX और विशेष रूप से, CD34 + CD38-जनक डिब्बे, विशेष रूप से ख्यात LSC में समृद्ध के बीच विस्फोट कोशिकाओं के कई उपआबादी की तुलना में । हमने पाया है कि CD34 + CD38-विस्फोट अंश नैदानिक रोगी नमूने की तुलना में PDX में उच्च था (०.५३% बनाम, चित्रा 2c, डी) । दिलचस्प है, हम ख्यात LSC का एक उच्च प्रतिशत पाया (एक CD34 + CD38-CD90-CD45RA + phenotype प्रदर्शित) प्राथमिक रोगी नमूने की तुलना में PDX में (२.७६% बनाम ०.४८%, चित्रा 2E, एफ), घातक के एक संभव संवर्धन का सुझाव इस माउस मॉडल में hematologic ऊतकों में जनक कोशिकाओं । सामान्य जनक कोशिका भिन्न की आवृत्ति PDX और रोगी के नमूने के बीच अलग नहीं किया.
इसके अलावा, हम विस्फोट सेल जनक CD34, CD38, CD90, और CD45A की अभिव्यक्ति के आधार पर आबादी का अध्ययन किया (जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित) दो अलग रोगी नमूनों में, निदान पर और उपचार पर अनुवर्ती MRD के स्तर का निर्धारण करने के लिए । पहले रोगी में, CD34 + CD38-(P6) अंश ०.०६% से निदान पर 3.33% करने के लिए पहले उपचार का पालन करें (चित्र 3 ए, बी) में वृद्धि हुई है । इसके विपरीत, CD34 + CD38-(P6) अंश के निदान पर 7.8% से दूसरे रोगी में २.२७% के लिए पहला उपचार अनुवर्ती (चित्र 3सी, डी) में कमी आई । तदनुसार, ख्यात LSC अंश निदान पर 0% से पहले रोगी में 0.65% की वृद्धि हुई (आंकड़ा 3', बी ') और निदान पर ६.५७% से दूसरे मरीज में इलाज पर 1.44% तक की कमी अनुवर्ती (चित्र 3 सी ', घ ') । इसी तरह, आणविक मार्करों द्वारा निगरानी MRD (यानी, NPM1 उत्परिवर्तन [पहले रोगी] और CBFB-MYH11 translocation [दूसरा रोगी]) से पता चला कि आणविक MRD पहले रोगी में कम कमी (0.8%) पहले उपचार के लिए दूसरे रोगी (0.05%) की तुलना में अनुवर्ती बिंदु (चित्र 3E, G) । अंत में, सत्यापित करने के लिए कि ख्यात P6 LSC घातक हैं, ल्यूकेमिया जुड़े एंटीजन CD123 और CD33 की अभिव्यक्ति, दोनों रोगियों के लिए CD33 की असामान्य अभिव्यक्ति दिखा (चित्रा 3F, जी).
चित्र 1 : गेटिंग रणनीति शारीरिक पुरोगामी और एएमएल विस्फोटों के लिए इस्तेमाल किया । एक सामांय अस्थि मज्जा के लिए दिखाया शारीरिक पुरोगामी के गेटिंग के साथ घनत्व साजिश । (क) सभी mononucleated कोशिकाओं पर CD45dimSSClow phenotype पर आधारित विस्फोट कोशिकाओं का गेटिंग. (ख) CD38 धनात्मकता के सत्यापन के लिए hematogones (CD38 + CD19 +) का गेटिंग. (ग). CD33 और CD36 पर आधारित सामान्य myeloblasts, monoblasts और erythroblasts की गेटिंग कार्यनीति । (D) विस्फोट कक्षों को CD34 + जनक उपजनसंख्याों में पृथक किया जा सकता है और P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) कक्ष डिब्बों में CD38 व्यंजक का उपयोग कर सकते हैं । (ङ) CD34 और CD38 अभिव्यक्ति पर आधारित hematogones का गेटिंग, CD38 धनात्मकता को सत्यापित करना । (छ) HSC, करेंटली, LMPP, और ख्यात LSC उपजनसंख्या का निर्धारण CD90 और CD45RA की अभिव्यक्ति का उपयोग कर के रूप में पहले9वर्णित है । ध्यान दें, LSC का कोई पता लगाने के रूप में यह एक सामान्य अस्थि मज्जा नमूना है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : विस्फोट सेल एक रोगी में जनक आबादी और इसी मरीज में व्युत्पंन-xenograft (PDX) द्वारा multiparametric प्रवाह cytometry । (A-B) PDX का Chimerism विश्लेषण । (क) Murine और मानव विस्फोटों को सर्वप्रथम आकार और संरचना (FSC, SSC) द्वारा परिभाषित किया जाता है. (B) बाद में, मानव बनाम murine CD45 धुंधला होने का प्रतिशत xenoengraftment और ल्यूकेमिया के बोझ का संकेत है । CD34 + CD38-ब्लास्ट कोशिकाओं के बीच प्रतिशत (ग) प्राथमिक नैदानिक और (D) PDX एएमएल नमूना की तुलना । (E) प्राथमिक CD90 और (F) CD45RA के बीच ख्यात LSC (CD34 + CD38-एएमएल-PDX +) की तुलना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : विस्फोट सेल निदान में दो रोगियों में जनक आबादी और न्यूनतम अवशिष्ट रोग (MRD) का पता लगाने के लिए छूट प्रेरण चिकित्सा के बाद । CD34 + CD38 का प्रवाह cytometric विश्लेषण-दो प्रतिनिधि रोगियों में विस्फोट सेल उपजनसंख्या (ए, सी) निदान पर और (बी, डी) छूट प्रेरण चिकित्सा के बाद । आंकड़े (A'-D ') निदान में दो रोगियों और प्रारंभिक उपचार के बाद के लिए ख्यात LSC युक्त P6 फाटकों से संबंधित वर्णन. (ई, जी) में दिखाया गया है पांच महीने की अवधि में इन दो रोगियों के लिए इस्तेमाल किया आणविक मार्करों द्वारा न्यूनतम अवशिष्ट रोग (MRD) विश्लेषण (NPM1 उत्परिवर्तन और CBFß-MYH11 जीन संलयन, क्रमशः) है. (F, G) ल्यूकेमिया संबद्ध एंटीजन की अभिव्यक्ति CD123 और CD33 पर ख्यात P6 LSC, दोनों रोगियों के लिए CD33 की असामान्य अभिव्यक्ति दिखा. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
प्रवाह cytometry द्वारा झिल्ली या cytoplasmic मार्करों के एक सटीक और reproducible आकलन की आवश्यकता है कि साधन सेटिंग्स ऑप्टिकल संरेखण के लिए हर दिन सत्यापित कर रहे हैं, द्रव प्रणाली के समुचित कार्य, ऑप्टिकल संवेदनशीलता, और मानकीकरण अंशांकन मोतियों का प्रयोग ।
एएमएल में ब्लास्ट सेल की आबादी का पता लगाना मल्टी पैरामीट्रिक फ्लो cytometry विश्लेषण द्वारा CD90 और CD45RA का प्रयोग एक अपेक्षाकृत सरल और विश्वसनीय तरीका है. इस विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम विस्फोट कोशिकाओं पर CD38 अभिव्यक्ति का एक सटीक आकलन है, क्रम में CD34 + CD38-जनसंख्या के सही गेटिंग प्रदर्शन करने के लिए । CD38 तीव्रता hematogones और/या प्लाज्मा कोशिकाओं (CD38 +) पर विशेष रूप से सामान्य अस्थि मज्जा कोशिकाओं का उपयोग कर परिभाषित किया गया है । अन्य मार्करों की तीव्रता isotype नियंत्रण का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है.
CD45RA और CD90 के जोड़ को ख्यात LSC से HSC भेद किया जाता है. बाद और नहीं HSC शायद रोग पतन का कारण है, इस प्रकार इस प्रोटोकॉल ंयूनतम अवशिष्ट रोग की निगरानी के लिए ब्याज की है प्रवाह cytometry पैनलों का उपयोग कर । उपचार के दौरान एएमएल की निगरानी के लिए जोखिम स्तरीकरण में सुधार और एएमएल चिकित्सा गाइड करने के लिए आवश्यक है । दुर्भाग्य से, उपयुक्त आणविक मार्कर सभी रोगियों के लिए उपलब्ध नहीं हैं । इसलिए, प्रवाह cytometry द्वारा MRD मॉनिटरिंग सभी एएमएल मामलों के लिए व्यवहार्य हो सकता है । हालांकि इस विधि के रूप में यह एएमएल मामलों जो एक CD34 + CD38-जनक और एक ख्यात LSC आबादी है के बहुमत पर focalizes संपूर्ण नहीं हो सकता है । ध्यान रहे, यह संभव है कि ख्यात LSC डिब्बे में सामान्य progenitors, यानी, LMPP) शामिल हो सकता है । इसके अलावा, हम इस असामांय अभिव्यक्ति पैटर्न का पालन नहीं कार्यात्मक LSC के साथ दुर्लभ मामलों रहे है कि शासन नहीं कर सकता । नोट की, यहां तक कि NPM1-रूपांतरित एएमएल जो नकारात्मक CD34 माना जाता है में, हम ख्यात LSC का पता लगाने में सक्षम हैं । इसलिए, विविधता और एएमएल LSC डिब्बे की जटिलता के बावजूद, हमारे विधि एएमएल का पालन के दौरान कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया के एक अगोचर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम फ्रेंच एसोसिएशन लौरेट Fugain, LigueContre le कैंसर (उत्तर केंद्र), शौकीनों डी फ्रांस (लेकिमिया समिति), सिर्क Oncolille, और फ्रांसीसी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित भाग में था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
