Summary
Biz aynı anda ifade birincil akut myeloid lösemi hücreleri üzerinde lösemi kök hücre işaretlerinin Akış Sitometresi tarafından tespit etmek için bir protokol anahat. Biz üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı.
Abstract
Akut Miyeloid Lösemi (AML) heterojen, olduğunu ve eğer tedavi değil, ölümcül hastalık. Erişkinlerde lösemi ilişkili ölümlerin en sık nedenidir. Başlangıçta, AML farklılaşma, lösemi blast hücrelerinin sonraki birikimi tutuklanması tarafından karakterize ve üretim fonksiyonel hematopoetik öğelerinin azaltılmış hematopoetik kök hücre (HSC) bir hastalık var. Heterojenite lösemi kök hücreleri (LSC) varlığı uzanır, bu dinamik hücre ile çeşitli seçim baskıların üstesinden gelmek için bölme gelişen üzerine lösemi ilerleme ve tedavi sırasında empoze. Daha fazla LSC nüfusu tanımlamak için CD34 + CD38 hücreli bölmenin içinde normal HSCs ve multipotent ataları ayrımcılık CD90 ve CD45RA eklenmesini sağlar. Burada, biz birkaç sözde LSC işaretleri (CD34 CD38 CD45RA, CD90) aynı anda ifade algılamak için bir protokol multiparametric Akış Sitometresi tarafından birincil blast hücrelerinin üzerinde insan AML anahat. Ayrıca, üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı. Bu yöntem algılama ve sözde LSC miktar kemoterapi yanıt klinik izlemek için kullanılan (i.e., minimal rezidüel hastalık), kalan LSC AML nüks neden olabilir gibi.
Introduction
Akut Miyeloid Lösemi (AML) Lösemi ilişkili ölümlerin en sık nedenidir. Başlangıçta, AML farklılaşma, blast hücrelerinin sonraki birikimi tutuklanması tarafından karakterize ve üretim fonksiyonel hematopoetik öğelerinin azaltılmış hematopoetik kök hücre (HSC) klonal bir hastalık var. Son zamanlarda, klonal heterojenite blast hücre nüfusunun aslında gelecek nesil sıralama (NGS) stratejileri kullanarak ve tümör hücreleri1intra klonal evrimi varlığını gösteren kurulmuştur.
Heterojenite lösemik kök hücreleri (LSC) varlığı için genişletir. Bunun üzerine lösemi ilerleme ve tedavi sırasında uygulanan çeşitli seçim baskıların üstesinden gelmek için bu dinamik hücre bölümü geliştikçe onaylanmadığına karar. Bu nedenle LSC gereken geçerli kemoterapi rejimleri için dayanıklı ve derin klinik sonuçları2ile hastalık nüks aracılık. Çeşitli işaretler LSC CD1233, CLL-14, CD975 veya TIM-36gibi karakterize etmek için tarif edilmistir. CD34 + CD38 bölmeli blast hücrelerinin LSC'yi7 için zenginleştirilmiş kabul edilir ancak normal HSC içerir. CD34 + CD38 uygulanan CD90 ve CD45RA ifade-(P6) yuvası (şekil 1) izin veren çeşitli aşamalarında normal ve malign hematopoetik öncüleri8ayırmak için. Özellikle, normal CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent ataları (MPP) CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-hücreleri ve CD34 + CD38 gibi-CD90-CD45RA + multipotent progenitör (LMPP) astarlanmalıdır lenfoid hücrelerin AML çoğunluğu olarak belirlenen durumlarda8 ,9. (MFI) ortalama Floresans yoğunluğunu CD38 CD34 + hücre bölmesi içinde dikkate alınması gereken özellikle önemlidir. CD38 yoğunluk üç yeni cep bölmeleri bunların tanımladığından: CD38 negatif (P6) CD38 dim (P7) ve CD38 parlak (P8) (şekil 1). CD38 MFI bu hücreler şiddetle CD38 hızlı gibi ya hematogones ve/veya plazma hücreleri bir iç pozitif kontrol kullanarak belirlenebilir.
İmmünyetmezligi başını SALLAMAK/SCID/IL2Rγcnull (NSG) fare modeli normal engraftment için yaygın olarak kullanılır ve10,11kötü huylu insan hematopoetik hücreler. Seri xenotransplantation deneyleri deneysel LSC veya HSC işlevini doğrulamak için kullanılır. Bu çalışmalar geniş büyük ölçekli sıralama yaklaşımlar tarafından analiz edilmiştir. Yine de, daha az onun birincil AML (Şekil 2) karşılaştırıldığında NSG fareler içine engrafted AML patlama nüfus LSC ve HSC immunophenotype hakkında bilinir.
LSC sayıda böylece doğal olarak düşük, kimlik ve LSC miktar zor olan ve burada anlatılan yöntemi bir akış sitometrik tahlil tanı ve klinik takip (kalıntı LSC olabilir gibi kemoterapi yanıtı değerlendirmek için kullanılıyor olabileceği AML relapse) neden. LSC varlığı olumlu minimal rezidüel hastalık (MRD) gösterebilir. Bugüne kadar MRD AML içinde çoğunlukla izleme itimat moleküler yöntemler (Yani, RT-PCR, NGS)10,12. Ancak, bu protokol için biz aynı anda protein ifade çeşitli HSC/LSC işaretleri (CD34 CD38 CD45RA, CD90) birincil blast hücrelerinin üzerinde insan AML multiparametric Akış Sitometresi2,8,9tarafından tespit. Antikorlar bu arada herhangi bir standart Akış Sitometresi laboratuvarda uygulanabilir ve bu akışı MRD tahlil özellikle ilginç olduğunda MRD tarafından gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) mümkün değildir Yani, eğer lösemi özel moleküler işaretleyicileri tanılama AML örnekte algılanabilir değildir. Ayrıca, bu iletişim kuralını, daha hassas moleküler MRD teknikleri için tamamlayıcı bu tespit ve anormal hematopoetik progenitör hücre ölçmek için amaç gibi temsil eden bir işlev hücre karakteristik (şekil 3).
Akış Sitometresi ile antikor klinik laboratuvarlar çoğunda kullanılabilir tarafından üç hematopoetik progenitör nüfus ve sözde LSC yuvası ile farklı olgunlaşma derecesini ölçmek için nasıl gösterir. Ayrıca, bu hücre bölmeleri içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts (PDX) varlığını doğruladı ve tedavi takip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Avrupa standartlarında bilimsel amaçlar için hayvan kullanımı için takip ediyoruz. Bu çalışmada yerel Etik Komitesi (#3097-2015120414583482v3) tarafından kabul edildi.
1. numune hazırlama
- Kemik iliği (2 mL) de novo AML antikoagülan ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren tüpler 1.8 mg-mL kemik iliği bir konsantrasyon, toplamak.
- Ficoll ayırma, alyuvar ve granülosit, mononükleer hücreler olarak izole etmek için yoğunluğu bir degrade renk ayrımı gerçekleştirin. Kemik iliği fosfat tampon tuz 3 cilt olarak sulandırmak (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1.8 mM). Dikkatle Ficoll 1 hacmi ile seyreltilmiş kemik iliği 1 birim yerleşimi. 300 x g fren olmadan 30 dakika çevir. İltihap hücrelerinin beyaz buffy önlük katman yeni bir steril tüp içine aktarın.
- PBS 10 mL hücrelerde iki kez yıkamak) ve santrifüj kapasitesi 300 x g 5 min için de bulaşıcı serum bileşenleri kaldırmak için.
2. lizis kırmızı kan hücrelerinin (RBC)
- 2 mL lizis arabelleği (amonyum klorür % 0.8) hücreye ekleme cips, girdap yavaşça ve 5 dk. santrifüj 300 x g 5 min için de oda sıcaklığında kuluçkaya.
Not: gerekirse, bu adımı yineleyin. - PBS hücrelerde yıkama daha önce (1.3.) açıklandığı gibi.
3. hasta xenografts türetilmiş.
- Blast hücreler kemik iliği Ficoll ayrılıktan sonra elde etmek ve sonra lenfositler tükenmesi immunomagnetic kullanarak seçimi negatif (CD3 T-ve CD20 B lenfositler için). Üreticinin yönergeleri izleyin.
- 5 x 106 AML blast hücre koşulsuz NSG fare kuyruğu damar içine enjekte. Kuyruk ven enjeksiyon kolaylaştırmak için bir yasaklama aygıtı kullanın. Fareler konvansiyonel koşullar altında ve özellikle özel patojen ücretsiz koşullar altında tüm zamanlarda, bireysel havalandırılmış kafesleri kullanarak ve manipülasyon laminar akış başlık altında tutun. İki haftada bir Hematokrit kullanarak çene toplama yöntemi tarafından 60 µL kan kılcal al. Yer içine 5 mL kılcal yuvarlak alt tüp. Taşma payı küçük steril gazlı bez panelini kullanma hafif basınç uygulayarak durdurmak. Temiz bir şırınga ile Ermeniyi kan.
- 1 ml lizis arabellek ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. O zaman 300 x g 5 dk. yıkama PBS ve 300 x g de centrifugre ile de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant ekle 100 µL PBS ile 3 µL Anti-insan CD45 FITC ve 1 µL Anti-fare ile % 10 sığır serum albumin (BSA) leke kaldırmak CD45 APC ve 4° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya.
- Hücre Pelet iki kez PBS (2 mL) % 10 BSA ve 5 min için 300 x g, santrifüj ile yıkayın.
- PBS 100 µL Akış Sitometresi tüpler içine başına 1 x 106 hücre e aliquot kadar.
- Anket engraftment iki haftada chimerism analizi tarafından CD45 ifade (insan karşı fare) Akış Sitometresi (şekil 2A ve B) kullanarak.
- Kurban (periferik blast sayısı % 70 veya klinik belirtileri şiddetli hastalık büyük), mononükleer blast hücre ezilmiş dalağı ve kemik iliği yırtılmalarıteşhis temizlenerek toplamak ve uyluk PBS ile daha önce13açıklandığı gibi. Fareler tarafından servikal çıkığı uluslararası yönergeleri izleyerek ötenazi.
- Hücre Pelet RBC içeriyorsa, kırmızı kan hücre lizis arabelleği (Adım 2.1) ile lizis gerçekleştirin.
- Hücreleri Pelet iki kez PBS (2 mL) % 10 BSA ve santrifüj vasıl 300 x g ile 5 dakika yıkayın.
- PBS 100 µL başına 1 x 106 hücre için hücre ve aliquot yukarı Akış Sitometresi tüpler içine toplamak.
4. boyama
- (Bkz. Adım 4.2) konjuge antikorlar ve girdap ekleyin. 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında hücreleri kuluçkaya.
- İnsan İlköğretim veya oluşan anti-CD36-FITC 10 µL, anti-CD19-ECD 5 µL, 5 µL anti-CD33-PC5.5, anti-CD90-APC 5 µL, anti-CD34-AA700, anti-CD45RA-APC-H7 5 µL, anti-CD38-Pasifik mavi, 5 µL 5 µL 5 µL PDX örnekleri için aşağıdaki panelini kullanın anti-CD45-KO Anti-CD123-PC7 ve 2.5 µL.
- İlişkisiz antikorlar PBS 2 mL aralıklarla 300 x g 5 min için de tarafından hücrelerde yıkayarak çıkarın.
- PBS 450 µL son akış sitometrik çözümlemesi için hücreleri yeniden askıya alma.
5. Akış Sitometresi Analizi için strateji geçişi
- Veri toplama (en az 500.000 hücreleri) kırmızı, mavi ve mor lazerler ile donatılmış bir Akış Sitometresi gerçekleştirin. Her gün için 1) optik uyum, 2) sıvı sistemi, 3) optik duyarlılık ve 4) standardizasyon Flüorosferlerini kullanan sitometresi ayarlarını doğrulayın
- (Şekil 1) CD38 ifadesi tanımlamak için sıralı gating strateji izleyin.
- Normal kemik iliği örnekleri hücrelerden hematogones veya CD38 ifade için olumlu denetim işlevi görecek plazma hücreleri tanımlamak için kullanın.
Not: Bu kapı sonraki sözde LSC nüfus onun tanımına bağlı olarak değerlendirmek özellikle önemlidir. - Fizyolojik değişimler hücreleri (normal blast hücreler) CD45dim/SSC (yan dağılım) düşük nüfus kriteri (şekil 1A) tanımlayın. Bu patlama nüfus içinde bir CD38 görüntülemek hematogones tanımlamak ++ CD19 + fenotip (şekil 1B) ve son olarak, myeloblasts, sarkomlardan ve erythroblasts (şekil 1 c) tanımlamak için CD36 ve CD33 ifade kullanırsınız. CD34 ifadesini hematogones üzerinde (şekil 1Eiçinde) gösterildiği gibi belirleyin. Birkaç patlama P6-P10 (şekil 1 d) tanımlanan hücreleri içinde öncüleri altgrupları değerlendirmek. P6, P7, önceden ayarlanmış CD38 gates dayalı P8 progenitör altgrupları blast hücre CD34 bölmesine ayırın. P8 yuvası P6 CD38-eksi bir (FMO) denetim CD38 Floresans dayalı olan hücreleri içeren hematogones olarak aynı CD38 yoğunluk var patlamaların içerir ve P7 hücreleri CD38 ile ilgili olarak iki uç arasında çoğu olun ifade (şekil 1 d).
- Normal kemik iliği örnekleri hücrelerden hematogones veya CD38 ifade için olumlu denetim işlevi görecek plazma hücreleri tanımlamak için kullanın.
- CD34 + 38-(P6) CD90 ve CD45RA ifade (şekil 1F) kullanarak sözde LSC HSC ayrı Geçitli hücreler.
Not: HSC fenotip CD34 + CD38 olduğunu-CD90 + CD45RA- ve multipotent ataları (MPP) CD34 + CD38 tanımlanan-CD90 - CD45RA-. Sözde LSC fenotip CD34 + CD38 olduğunu-CD90dimCD45RA + ve daha olgunlaşmamış aşağı akım nüfus CD34 + CD38 tanımlanan lenfoid astarlanmalıdır ataları (LMPP) vardır-CD90-CD45RA +.
6. MRD RT-PCR ile izleme
- MRD düzeyleri tarafından RT-PCR14daha önce açıklandığı gibi izlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada yaratıcı nüfus normal ve kötü huylu insan kemik iliği örneklerinde belirlemek için bir yöntem mevcut. Kemik iliği ve dalak başarılı bir PDX toplanan ve multiparametric Akış Sitometresi yukarıda açıklandığı gibi yapılır. Biz birkaç blast hücreler arasında tanı hasta örnek ve karşılık gelen PDX ve özellikle, CD34 + CD38 progenitör yuvası, özellikle sözde LSC zenginleştirilmiş altgrupları göre. Biz CD34 + CD38-şok kesir PDX tanılama hasta örnek (%3,48 %0,53, şekil 2C, Dvs) göre daha yüksek bulduk. İlginçtir, sözde LSC daha yüksek bir yüzdesi bulduk (CD34 + CD38 görüntüleme-CD90-CD45RA + fenotip) birincil hasta örnek (%2,76 %0.48, şekil 2E, Fvs), için karşılaştırıldığında PDX Malign olası bir zenginlik düşündüren Bu fare modelinde hematolojik dokularda progenitör hücreler. Normal progenitör hücre kesirler sıklığını PDX ve hasta örnek arasında farklı değil.
Ayrıca, iki farklı hasta numuneleri, tanı ve tedavi takip MRD düzeyini belirlemek için ifadede CD34, CD38, CD90 ve (Bu protokol için açıklandığı gibi) CD45A göre blast hücre progenitör nüfus okudu. İlk hastada, CD34 + CD38-(P6) kesir için ilk tedavi takibi (şekil 3A, B) %3,33 %0.06 tanı, arttı. Buna karşılık, CD34 + CD38-(P6) kesir azalmıştır %2.27 (şekil 3 C, D) ilk tedavi takibi için tanı, %7,8 hastada ikinci. Buna göre sözde LSC kesir %0.65 (şekil 3A', B') tanı, % 0'dan hastada ilk artmış ve tedavi takibi (şekil 3 c %1,44 için tanı %6.57 gelen hastada ikinci azalma ', D'). Benzer şekilde, moleküler işaretleyiciler tarafından izleme MRD (yani, NPM1 mutasyon [ilk hasta] ve CBFB-MYH11 translocation [ikinci hasta]) moleküler MRD azaltmak olduğunu az ikinci hastanın (% 0.05) göre ilk hastada (% 0.8) için ilk tedavi gösterdi izleme noktası (şekil 3E, G). Son olarak, sözde P6 LSC kötü huylu olduğunu doğrulamak için CD123 ve CD33, CD33 anormal ifade (şekil 3F, G) hem de hastalar için gösterilen tahmin edilmiştir antijenleri ifade lösemi ilişkili.
Resim 1 : Strateji çoğunluğuna fizyolojik değişimler ve AML için patlamaların kullanılan. Fizyolojik değişimler için normal bir ilik gösterildiği, geçişi ile yoğunluk arsa. (A)Gating blast hücre CD45dimSSClow fenotip tüm iltihap hücreleri üzerinde dayalı. Hematogones, (B) Gating (CD38 + CD19 +) CD38 pozitifliği doğrulanması için. (C). strateji normal myeloblasts, sarkomlardan ve erythroblasts çoğunluğuna dayalı CD33 ve CD36. (D) Blast hücre progenitör altgrupları CD34 + ayrılmış ve P6 ifadeye CD38 kullanarak (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) hücre bölmeleri. (E) Gating hematogones, CD34 ve CD38 ifadeye dayalı, CD38 pozitifliği doğrulayın. (G) belirlenmesi HSC, MPP, LMPP ve daha önce CD90 ve CD45RA ifadesi kullanarak sözde LSC altgrupları9açıklanan. Not, bu LSC yok tespiti bir normal kemik iliği örneğidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Blast hücre progenitör nüfus bir hasta ve karşılık gelen hasta-türetilen-xenograft (PDX) tarafından multiparametric Akış Sitometresi. (A-B) PDX chimerism analizi. (A)fare ve insan patlamaların ilk boyutu ve yapısı (FSC, SSC) tarafından tanımlanan. (B) daha sonra insan CD45 fare boyama karşı yüzdesi xenoengraftment ve lösemi yükünün göstergesidir. CD34 + CD38-şok karşılaştırılması (C) birincil tanılama ve (D) PDX AML örnek arasında yüzde hücreleri. Sözde LSC karşılaştırılması (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) birincil AML (E) ve (F) PDX arasında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Blast hücre progenitör nüfus iki hastaların tanı ve remisyon indüksiyon tedavisi minimal rezidüel hastalık (MRD) algılama için sonra. CD34 + CD38-blast hücre altgrupları (A, C) iki temsilcisi hastalarda sitometrik analizinde remisyon indüksiyon terapisinden sonra tanı ve (B, D) akış. Rakamlar (A'-D') Tanı ve ilk tedaviden sonra iki hasta için sözde LSC içeren ilgili P6 gates göstermektedir. (E, Giçinde) gösterilir moleküler işaretleyiciler bu iki hastada bir beş ay boyunca kullanılması göre minimal rezidüel hastalık (MRD) analiz (NPM1 mutasyon ve CBFß-MYH11 gen füzyon, sırasıyla). (F, G) İfade lösemi antijenleri CD123 ve CD33 CD33 anormal ifade hem de hastalar için gösterilen sözde P6 LSC üzerinde ilişkili. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enstrüman ayarlarını her gün optik uyum, sıvı sistemi, optik duyarlılık ve standardizasyon işlevlerin doğru için doğrulanır membran veya Akış Sitometresi tarafından sitoplazmik işaretleri doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesi gerektirir kalibrasyon boncuk kullanarak.
CD90 ve CD45RA göre çok parametrik Akış Sitometresi Analizi kullanarak AML blast hücre popülasyonlarının tespiti nispeten basit ve güvenilir bir yöntemdir. Bu analizi kritik bir adımda doğru CD34 + CD38 nüfusu geçişi gerçekleştirmek için patlama hücrelerde, CD38 ifadenin doğru bir değerlendirme var. CD38 yoğunluk hematogones ve/veya plazma hücreleri (CD38 +) özellikle normal kemik iliği hücreleri kullanılarak tanımlanır. Diğer işaretleri yoğunluğunu izotip denetimleri kullanılarak belirlenir.
Ayrıca CD45RA ve CD90 HSC sözde LSC ayırt etmek için kullanılır. İkinci ve hastalık nüks nedeninin belki HSC, böylece bu protokoldür Akış Sitometresi panellerini kullanarak izleme minimal rezidüel hastalık için ilgi. AML tedavi sırasında izleme, risk stratifikasyon geliştirmek ve AML tedavi Kılavuzu için esastır. Ne yazık ki, uygun moleküler işaretleyiciler tüm hastalar için kullanılabilir değil. Bu nedenle, Akış Sitometresi tarafından MRD izleme tüm AML durumlar için uygun olabilir. Bir CD34 + CD38 Dede ve sözde LSC nüfus olan AML vakaların çoğunluğu focalizes gibi olsa bile bu yöntem ayrıntılı olmayabilir. Not, bu sözde LSC yuvası normal ataları, yani, LMPP içerebilir mümkündür). Ayrıca, biz orada bu anormal ifade deseni takip değil fonksiyonel LSC ile nadir durumlarda göz ardı edemeyiz. Notta, CD34 negatif, kabul edilen bile NPM1 mutasyona uğramış AML, biz sözde LSC tespit edebiliyoruz. Kemoterapi tepki sırasında bir biyomarker AML aşağıdaki gibi bu nedenle, heterojen ve AML LSC bölme karmaşıklığı rağmen bizim yöntem kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen Fransızca Derneği Laurette Fugain, LigueContre le kanser (Kuzey Merkezi), Fondation de France (lösemi Komitesi), SIRIC Oncolille ve Fransız Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
