Summary
Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.
Abstract
Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist eine heterogene, und wenn Sie nicht behandelt, tödliche Krankheit. Es ist die häufigste Ursache der Leukämie-assoziierten Sterblichkeit bei Erwachsenen. AML ist zunächst eine Erkrankung des blutbildenden Stammzellen (HSC) zeichnet sich durch die Verhaftung der Differenzierung, nachfolgende Ansammlung der Leukämiezellen Blast, und reduziert die Produktion von hämatopoetischen Funktionselemente. Heterogenität erstreckt sich auf das Vorhandensein von Leukämie-Stammzellen (LSC), mit dieser dynamischen Zelle Fach weiterentwickelt wird, um verschiedene Auswahl-Druck zu überwinden während Leukämie Progression und Behandlung auferlegt. Um die LSC-Bevölkerung weiter zu definieren, ermöglicht das Hinzufügen von CD90 und CD45RA die Diskriminierung von normalen HSCs und multipotenten Vorläuferzellen innerhalb der CD34 + CD38 Zellkompartiment. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck mehrere vermeintliche LSC-Marker (CD34, CD38, CD45RA, CD90) zu erkennen am primären Blastenzellen des menschlichen AML durch multiparametric Durchflusszytometrie. Darüber hinaus zeigen wir, wie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate. Diese Methode zur Erkennung und Quantifizierung von vermeintlichen LSC für die klinische Weiterbehandlung der Chemotherapie Antwort verwendet werden (zB., minimaler Resterkrankung), als passives LSC AML Rückfall verursachen.
Introduction
Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist die häufigste Ursache der Leukämie-assoziierten Sterblichkeit. AML ist zunächst eine klonale Erkrankung der blutbildenden Stammzellen (HSC) zeichnet sich durch die Verhaftung der Differenzierung, nachfolgende Anhäufung von Blasten, und reduziert die Produktion von hämatopoetischen Funktionselemente. Vor kurzem wurde klonale Heterogenität der Explosion Zellpopulation im Wesentlichen durch die Verwendung der nächsten Generation Sequencing (NGS) Strategien und zeigen die Existenz der Intra klonale Evolution von Tumor-Zellen1gegründet.
Heterogenität erstreckt sich auf das Vorhandensein von leukämischen Stammzellen (LSC). Es wird vermutet, die diese dynamische Zellkompartiment entwickelt, um verschiedene Auswahl Druck auferlegt bei Leukämie Progression und Behandlung zu überwinden. Daher LSC sollen resistent gegenüber aktuellen chemotherapeutischen Therapien und Krankheit Rückfall mit profunden klinischen Implikationen2zu vermitteln. Verschiedene Marker wurden zur Charakterisierung von LSC wie CD1233, CLL-14, CD975 oder TIM-36beschrieben. CD34 + CD38-Abteil des Blastenzellen gilt für LSC7 angereichert werden aber auch normale HSC. CD90 und CD45RA Ausdruck angewendet, die CD34 + CD38-Fach (P6) (Abbildung 1) ermöglicht es, um mehrere Stufen von normalen und malignen hämatopoetischen Vorläufer8zu trennen. Speziell, normale CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent Vorfahre (MPP) wie CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-Zellen und CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP) Zellen, in der Mehrzahl der AML ermittelt werden Fälle8 ,9. Der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CD38 ist besonders wichtig, innerhalb der CD34 + Zellkompartiment berücksichtigt werden. Da CD38 Intensität drei neue Zelle Fächer davon definiert: CD38 negativ (P6), CD38 Dim (P7) und CD38 hell (P8) (Abbildung 1). Die MFI CD38 kann entweder Hematogones und/oder Plasmazellen als interne positive Kontrolle mit, wie diese Zellen stark CD38 ausdrücken bestimmt werden.
Die immungeschwächte NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) Maus-Modell ist weit verbreitet für Engraftment des normalen und bösartigen Menschen hämatopoetischen Zellen10,11. Serielle Xenotransplantation Assays werden verwendet, um experimentell LSC oder HSC-Funktion überprüfen. Diese Studien wurden weitgehend durch groß angelegte Sequenzierung Ansätze analysiert. Dennoch ist weniger über die LSC und HSC Immunophenotype AML Explosion Bevölkerung pfropfte in NSG-Mäuse im Vergleich zu seiner primären AML (Abbildung 2) bekannt.
Die Zahl der LSC sind somit von Natur aus niedrigen, Identifizierung und Quantifizierung der LSC sind anspruchsvoll und die hier beschriebene Methode verwendet werden als ein Fluss durchflusszytometrischen Assay zum Zeitpunkt der Diagnose und bei klinischen Folgen bis Chemotherapie Antwort bewerten (wie passives LSC kann verursachen Sie AML Rückfall). Das Vorhandensein von LSC möglicherweise positiven minimalen Resterkrankung (MRD). Bis dato MRD Überwachung in AML meist verlassen Sie sich auf molekulare Methoden (d.h., RT-PCR, NGS)10,12. Jedoch in diesem Protokoll erkennen wir gleichzeitige Protein-Expression von mehreren HSC/LSC-Markern (CD34, CD38, CD45RA, CD90) auf primäre Blastenzellen des menschlichen AML durch multiparametric Flow Cytometry2,8,9. Diese Kombination von Antikörpern kann in jedem standard Flow Cytometry Labor angewendet werden und dieser Fluss-MRD-Assay ist besonders interessant, wenn MRD durch Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) nicht möglich ist, d. h., wenn Leukämie spezifische molekulare Marker sind nicht in die Diagnose AML Probe nachweisbar. Darüber hinaus ist dieses Protokolls komplementär zu empfindlicheren molekularen MRD-Verfahren, da es darum geht zu erkennen und zu quantifizieren, die abnorme hämatopoetischen Vorläuferzellen die repräsentiert einer funktionelle Zelle-Eigenschaft (Abbildung 3).
Wir zeigen, wie Sie drei hämatopoetischen Vorläuferzellen Populationen und die vermeintliche LSC-Fach mit unterschiedlichen Grad der Reifung durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern zur Verfügung, in der Mehrzahl der klinischen Labors zu quantifizieren. Darüber hinaus wir bestätigte das Vorhandensein dieser Zelle Abteilungen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate (PDX) und bei der Behandlung verfolgen.
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Protocol
Wir folgen Europäische Normen für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke. Diese Studie wurde von der lokalen Ethikkommission (#3097-2015120414583482v3) genehmigt.
1. die Probenvorbereitung
- Knochenmark (2 mL) von de Novo AML in Röhrchen mit Antikoagulanzien Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in einer Konzentration von 1,8 mg / mL Knochenmark zu sammeln.
- Durchzuführen Sie Ficoll Trennung, eine Steigung Dichtetrennung Mononukleäre Zellen von Erythrozyten und Granulozyten, zu isolieren, wie folgt. Verdünnen Sie Knochenmark in 3 Bänden von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS: NaCl 137 mM, KCl-2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). 1 Volumen von Ficoll mit 1 Volumen von verdünnten Knochenmark sorgfältig zu überlagern. 30 Minuten bei 300 X g ohne Bremse zu spinnen. Übertragen Sie die weißen buffy Coat Schicht Mononucleated Zellen in ein neues steriles Röhrchen.
- Waschen Sie Zellen zweimal in 10 mL PBS) und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min um kontaminierende Serumkomponenten zu entfernen.
2. lyse der Erythrozyten (RBC)
- Hinzufügen von 2 mL Lyse-Puffer (Ammoniumchlorid 0,8 %) für die Zelle Pellets, Wirbel sanft und in 5 min. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Schritt. - Wie zuvor beschriebenen Wash Zellen mit PBS-Puffer (1.3.).
3. Patienten abgeleitet Xenotransplantate.
- Blast-Zellen aus dem Knochenmark nach Ficoll Trennung erhalten und nach Erschöpfung der Lymphozyten mit Immunomagnetic negative Auswahl (CD3 für t- und CD20 für B-Lymphozyten). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
- 5 x 106 AML Blasten in die Rute Vene unbedingte NSG Mäuse zu injizieren. Verwenden Sie eine Haltevorrichtung Schweif Vene Injektion zu erleichtern. Halten Sie Mäuse unter herkömmlichen Bedingungen und vor allem unter spezifischen-Pathogen-freies Bedingungen überhaupt, Zeiten, indem einzelne belüftete Käfige und Manipulation unter Laminar-Flow-Haube. Nehmen Sie alle zwei Wochen 60 µL Blut durch die submandibulären Sammlung-Methode mit einem Hämatokrit Kapillaren. Ort der Kapillare in 5 mL Runde Unterrohr. Stoppen Sie die Blutung durch sanften Druck mit einem kleinen sterilen Tupfer. Ausspülung Blut mit einer sauberen Spritze.
- Fügen Sie 1ml Lyse-Puffer und 5min inkubieren. Dann für 5 Minuten bei 300 X g für 5min. Waschen mit PBS und Centrifugre bei 300 X g zentrifugieren. Entfernen Sie überstand, Add 100 µL PBS mit 10 % Rinderserumalbumin (BSA) Fleck mit 3 µL Anti-Human CD45-FITC und 1 µL Anti-Murine CD45-APC und 30 Minuten bei 4 ° C inkubieren.
- Waschen Sie Zelle Pellet zweimal mit PBS-Puffer (2 mL) mit 10 % BSA und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
- Aliquoten bis zu 1 x 106 Zellen pro 100 µL PBS in Flow Cytometry Röhren.
- Umfrage Engraftment alle zwei Wochen durch Chimerism Analyse von CD45 Ausdruck (menschliche gegen murine) mittels Durchflusszytometrie (Abb. 2A und B).
- Unter Opfern (periphere Explosion Count größer als 70 % oder schweren klinischen Anzeichen der Krankheit), sammeln Sie mononukleären Blasten aus zerkleinerten Milz und Knochenmark durch Spülung Tibien und Oberschenkelknochen mit PBS wie oben beschrieben13. Einschläfern Sie Mäuse durch zervikale Dislokation nach internationalen Richtlinien.
- Wenn Zelle Pellet RBC enthält, führen Sie lyse der roten Blutkörperchen mit Lyse Puffer (Schritt 2.1).
- Waschen Sie Zellen Pellet zweimal mit PBS-Puffer (2 mL) mit 10 % BSA und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
- Sammeln Sie Zellen und aliquoten bis zu 1 x 106 Zellen pro 100 µL PBS in Flow Cytometry Röhren.
(4) Färbung
- Fügen Sie konjugierten Antikörpern (siehe Schritt 4.2) und Wirbel. Inkubieren Sie Zellen für 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- Verwenden Sie das folgende Panel für menschliche Grund- oder PDX Proben bestehend aus 10 µL Anti-CD36-FITC, 5 µL des Anti-CD19-ECD, 5 µL Anti-CD33-PC5.5, 5 µL Anti-CD90-APC, 5 µL Anti-CD34-AA700, 5 µL Anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL Anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL Anti-CD123-PC7 und 2,5 µL Anti-CD45-KO.
- Ungebundenen Antikörper durch die Zellen in 2 mL PBS durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min waschen zu entfernen.
- Wieder aussetzen Sie Zellen in 450 µL PBS für endgültige durchflusszytometrischen Analyse.
5. gating Strategie für Flow-Zytometrie-Analyse
- Durchführen Sie Datenerfassung (mindestens 500.000 Zellen) auf einem Durchflusszytometer ausgestattet mit roten, blauen und violetten Lasern. Überprüfen Sie die Einstellungen der Cytometer täglich für 1) optische Ausrichtung, 2) fluidische System und (3) optische Empfindlichkeit 4) Standardisierung mit fluorospheres
- Folgen Sie der sequentiellen gating Strategie definieren CD38 Ausdruck (Abbildung 1).
- Verwenden Sie Zellen von normalen Knochenmarkproben zur Definition Hematogones oder Plasma-Zellen dienen als Positivkontrolle für CD38 Ausdruck.
Hinweis: dieses Tor ist vor allem wichtig zu beurteilen, da seine Definition anschließenden vermeintlichen LSC Bevölkerung abhängen. - CD45dim/SSC (Side Scatter) geringe Bevölkerungsdichte Kriterien (Abbildung 1A) physiologische Vorläufer Zellen (normale Blasten) eingrenzen. Innerhalb dieser Population Explosion definieren Hematogones, die eine CD38 anzeigen ++ CD19 + Phänotyp (Abbildung 1 b) und schließlich CD36 und CD33 Ausdruck verwenden, um Myeloblasts, Monoblasts und Erythroblasts (Abbildung 1) zu definieren. CD34 Ausdruck auf Hematogones zu bestimmen, wie in (Abbildung 1E) dargestellt. Bewerten Sie mehrere Subpopulationen von Vorstufen innerhalb der Blasten definiert als P6-P10 (Abbildung 1). Trennen Sie das CD34-Fach von Blasten in P6, P7, P8 Stammvater Subpopulationen basierend auf vordefinierten CD38 Tore. Sicherstellen Sie, dass die P8-Fach die Blasten, die die gleiche CD38 Intensität wie die Hematogones enthält, dass P6 Zellen enthält die CD38-basierend auf die CD38 Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrolle und P7 Zellen zwischen den beiden extremen hinsichtlich CD38 sind Ausdruck (Abbildung 1).
- Verwenden Sie Zellen von normalen Knochenmarkproben zur Definition Hematogones oder Plasma-Zellen dienen als Positivkontrolle für CD38 Ausdruck.
- Die CD34 + 38-(P6) trennen geschlossene Zellen HSC aus vermeintlichen LSC mit CD90 und CD45RA Ausdruck (Abb. 1F).
Hinweis: der HSC-Phänotyp ist CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- und die multipotent Vorfahre (MPP) sind definiert als CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Der vermeintliche LSC-Phänotyp ist CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + und mehr unreife nachgelagerten Bevölkerung sind die lymphatischen grundiert Vorfahre (LMPP) definiert als CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
(6) MRD Überwachung durch RT-PCR
- Überwachen Sie durch RT-PCR, wie zuvor beschrieben14MRD.
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Representative Results
Hier präsentieren wir eine Methode zum Stammvater Populationen in normalen und bösartigen menschlichen Knochenmarkproben zu bestimmen. Wir sammelten Knochenmark und Milz von einer erfolgreichen PDX und multiparametric Durchflusszytometrie durchgeführt, wie oben beschrieben. Wir verglichen mehrere Subpopulationen von Blasten zwischen der diagnostischen Patientenprobe und die entsprechenden PDX und insbesondere das CD34 + CD38-Vorläuferzellen Fach, vor allem in vermeintlichen LSC bereichert. Wir haben festgestellt, dass die CD34 + CD38-Blast-Fraktion PDX im Vergleich zu der Diagnose Patientenprobe (3,48 % vs. 0,53 %, Abbildung 2, D) höher war. Interessanterweise fanden wir einen höheren Prozentsatz von vermeintlichen LSC (Anzeige von CD34 + CD38-CD90-CD45RA + Phänotyp) in der PDX im Vergleich zu der primären Patientenprobe (2,76 % vs. 0,48 % Abbildung 2E, F), was auf eine mögliche Bereicherung des malignen Vorläuferzellen im hämatologischen Gewebe in diesem Mausmodell. Die Häufigkeit der normalen Stammvater Zelle Brüche unterscheiden zwischen den PDX und der Patientenprobe nicht.
Darüber hinaus haben wir die Explosion Stammvater Zellpopulationen basierend auf die Expression von CD34, CD38, CD90 und CD45A (wie in diesem Protokoll beschrieben) in zwei unterschiedlichen Patientenproben, Diagnose und Behandlung Folgemaßnahmen zur Bestimmung der Höhe des MRD untersucht. In die erste Patientin, die CD34 + CD38-(P6) Anteil stieg von 0,06 % zum Zeitpunkt der Diagnose auf 3,33 % bei der ersten Behandlung Follow-up (Abb. 3A, B). Im Gegensatz dazu die CD34 + CD38-(P6) Bruchteil verringerte sich in der zweiten Patienten von 7,8 % zum Zeitpunkt der Diagnose bis 2,27 % bei der ersten Behandlung Follow-up (Abbildung 3 C, D). Entsprechend der vermeintliche LSC-Anteil stieg in den ersten Patienten von 0 % bei der Diagnose auf 0,65 % (Abbildung 3A', B') und sank im zweiten Patienten von 6,57 % zum Zeitpunkt der Diagnose um 1,44 % bei Behandlung Follow-up (Abbildung 3 ', D'). In ähnlicher Weise MRD Überwachung durch molekulare Marker (d. h. NPM1 Mutation [erster Patient] und CBFB-MYH11 Translokation [zweite Patient]) zeigte, dass molekulare MRD verringern weniger in der erste Patient (0,8 %) im Vergleich zu der zweiten Patient (0,05 %) für die erste Behandlung Follow-up-Punkt (Abbildung 3E, G). Schließlich, um zu überprüfen, dass vermeintliche P6 LSC sind bösartig, Ausdruck der Leukämie verbunden Antigene, die CD123 und CD33 geschätzt wurden, zeigt abnormale Expression von CD33 für beide Patienten (Abbildung 3F, G).
Abbildung 1 : Gating Strategie zur physiologischen Vorstufen und AML Blasten. Dichte Handlung mit Anspritzung von physiologischen Vorstufen für eine normale Knochenmark gezeigt. (A) Herbeirufung von Blasten basierend auf CD45dimSSClow Phänotyp auf alle Mononucleated Zellen. (B) Herbeirufung von Hematogones (CD38 + CD19 +) für die Überprüfung der CD38 Positivität. (C). Gating Strategie der normalen Myeloblasts, Monoblasts und Erythroblasts basierend auf CD33 und CD36. (D) Blasten in Vorläuferzellen Subpopulationen CD34 + getrennt werden können und mit CD38 Ausdruck in P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) Zell-Fächer. (E) Herbeirufung von Hematogones basierend auf CD34 und CD38 Ausdruck, CD38 Positivität zu überprüfen. (G) Bestimmung des HSC, MPP, LMPP und vermeintliche LSC-Subpopulationen mit Ausdruck der CD90 und CD45RA wie zuvor beschrieben,9. Keine Erkennung der LSC als dies ist eine normale Knochenmarkprobe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Blast Stammvater Zellpopulationen bei einem Patienten und in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenograft (PDX) durch multiparametric Durchflusszytometrie. (A-B) Chimärismus Analyse der PDX. (A) murinen und menschlichen Blasten zeichnen sich zunächst durch Größe und Struktur (FSC, SSC). (B) ist der Prozentsatz der Menschen gegen murine CD45 Färbung anschließend bezeichnend für Xenoengraftment und Leukämie Belastung. Vergleich von CD34 + CD38-Blast Zellen Prozentsatz zwischen primären Diagnostik (C) und (D) PDX AML Probe. Vergleich der vermeintlichen LSC (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) zwischen primären AML (E) und (F) PDX. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Blast Zellpopulationen Vorläuferzellen bei zwei Patienten bei der Diagnose und nach Remission-Induktions-Therapie zur Detektion minimaler Resterkrankung (MRD). Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse von CD34 + CD38-Blast Zelle Subpopulationen in zwei repräsentativen Patienten (A, C) bei Diagnose und (B, D) nach Remission-Induktions-Therapie. Zahlen (A'-D') jeweiligen P6-Tore mit vermeintlichen LSC für die beiden Patienten bei der Diagnose und nach der Erstbehandlung zu veranschaulichen. (E, G) zeigt die minimaler Resterkrankung (MRD) Analyse von molekularen Markern verwendet für diese beiden Patienten über einen Zeitraum von fünf Monaten (NPM1 Mutation und CBFß-MYH11 gen Fusion, beziehungsweise). (F, G) Ausdruck der Leukämie verbunden Antigene CD123 und CD33 auf vermeintliche P6 LSC, abnorme Ausdruck CD33 für beide Patienten zeigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Eine genaue und reproduzierbare Beurteilung der Membran oder zytoplasmatischen Marker durch Durchflusszytometrie erfordert, dass Geräteeinstellungen für optische Ausrichtung, das ordnungsgemäße Funktionieren der fluidische System, optische Empfindlichkeit und Standardisierung täglich überprüft werden unter Verwendung der Kalibrierung Korne.
Nachweis von Blast Zell-Populationen in AML mit CD90 und CD45RA durch multiparametrischen Flow-Zytometrie-Analyse ist eine relativ einfache und zuverlässige Methode. Ein wichtiger Schritt in dieser Analyse ist eine genaue Einschätzung CD38 Ausdruckslosigkeit Blasten, um korrekte Anspritzung von CD34 + CD38-Bevölkerung zu erfüllen. CD38 Intensität definiert sich über normalen Knochenmarkzellen speziell auf Hematogones und/oder Plasmazellen (CD38 +). Intensität der anderen Markern wird bestimmt Isotype Steuerelemente verwenden.
Die Zugabe von CD45RA und CD90 wird verwendet, um vermeintliche LSC HSC unterscheiden. Die letzteren und nicht HSC vielleicht die Ursache der Krankheit Rückfall, damit dieses Protokoll ist interessant für minimaler Resterkrankung Überwachung mit Flow Cytometry Paneele. Überwachung während der Behandlung der AML ist unerlässlich zur Risikostratifizierung verbessern und AML-Therapie zu führen. Entsprechenden molekulare Marker sind leider nicht für alle Patienten zur Verfügung. Daher vielleicht MRD Überwachung durch Durchflusszytometrie für alle AML Fälle durchführbar. Obwohl diese Methode nicht vollständig sein kann wie es bei den meisten der AML-Fälle fokussiert die CD34 + CD38-Vorläuferzellen und eine vermeintliche LSC-Bevölkerung haben. Beachten ist ist es möglich, dass das vermeintliche LSC-Fach normal Stammväter, d. h. LMPP enthalten kann). Darüber hinaus kann nicht wir ausschließen, dass es gibt seltene Fälle mit funktionalen LSC nicht nach dieser abnormen Expressionsmuster. Der Hinweis, auch in NPM1 mutiert AML CD34 gelten negativ, können wir vermeintliche LSC zu erkennen. Daher kann trotz der Heterogenität und Komplexität der AML LSC-Fach, unsere Methode verwendet werden wie ein Biomarker der Chemotherapie Reaktion während der follow-up der AML.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Französisch Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (North Center), Fondation de France (Leukämie Committee), SIRIC Oncolille und französische National Cancer Institute unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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