Summary
Vi skissere en protokoll for å oppdage samtidige uttrykket av leukemi stamcelleforskningen markører på primære akutt myelogen leukemi celler av flowcytometri. Vi viser hvordan kvantifisere tre stamfar befolkninger og antatte Lexmarks Løsningssenter innbyggere med økende grad av modning. Vi bekreftet tilstedeværelse av disse befolkningene i tilsvarende pasient-avledet-xenografts.
Abstract
Akutt myelogen leukemi (AML) er en heterogen, og hvis ikke behandles, dødelig sykdom. Det er den vanligste årsaken av leukemi-assosiert dødelighet hos voksne. I utgangspunktet er AML en sykdom i blodkreft stamceller (HSC) preget av arrestasjonen av differensiering, etterfølgende opphopning av leukemi blast celler, og redusert produksjon av funksjonelle blodkreft elementer. Heterogenitet utvider tilstedeværelsen av leukemi stamceller (Lexmarks Løsningssenter), med dynamisk cellen kupé utvikling for å overvinne ulike utvalg press påtvunget under leukemi progresjon og behandling. For å ytterligere definere befolkningen Lexmarks Løsningssenter, kan CD90 og CD45RA diskriminering av vanlig HSCs og multipotent progenitors innen CD34 + CD38 celle batterirommet. Her skissere vi en protokoll for å oppdage samtidige uttrykket av flere mulige Lexmarks Løsningssenter markører (CD34, CD38, CD45RA, CD90) på primære blast celler av menneskelig AML av multiparametric flowcytometri. Videre viser vi hvordan kvantifisere tre stamfar befolkninger og antatte Lexmarks Løsningssenter innbyggere med økende grad av modning. Vi bekreftet tilstedeværelse av disse befolkningene i tilsvarende pasient-avledet-xenografts. Denne metoden for påvisning og kvantifisering av antatte Lexmarks Løsningssenter kan brukes for klinisk oppfølging av kjemoterapi respons (dvs., minimal gjenværende sykdom), gjenværende Lexmarks Løsningssenter kan forårsake AML tilbakefall.
Introduction
Akutt myelogen leukemi (AML) er den vanligste årsaken av leukemi-assosiert dødelighet. I utgangspunktet er AML en klonal sykdom i blodkreft stamceller (HSC) preget av arrestasjonen av differensiering, etterfølgende opphopning av blast celler, og redusert produksjon av funksjonelle blodkreft elementer. Nylig er klonal heterogenitet av blast celle befolkningen etablert i hovedsak ved hjelp av neste generasjons sekvensering (NGS) strategier og viser eksistensen av intra klonal utviklingen av tumor celler1.
Heterogenitet utvider tilstedeværelsen av leukemic stamceller (Lexmarks Løsningssenter). Det er hypotesen at dette dynamiske celle kupé utvikles for å overvinne ulike utvalg press påtvunget under leukemi progresjon og behandling. Derfor Lexmarks Løsningssenter er ment å være motstandsdyktig mot gjeldende chemotherapeutic regimer og formidle sykdommen tilbakefall, med dype klinisk implikasjoner2. Ulike merker har blitt beskrevet som betegner Lexmarks Løsningssenter som CD1233, CLL-1-4, CD975 eller TIM-36. CD34 + CD38-rommet blast celleområde regnes å være beriket i Lexmarks Løsningssenter7 men også normal HSC. CD90 og CD45RA uttrykk brukt CD34 + CD38-(P6) kupé (figur 1) tillater for å skille flere stadier av normal og ondartet blodkreft forløpere8. Spesielt vanlig CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent progenitors (MPP) som CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-celler og CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymfoide primet multipotent stamfar (LMPP) celler kan bestemmes i fleste AML tilfeller8 ,9. Mener fluorescens intensitet (MFI) CD38 er spesielt viktig vurderes i CD34 + celle batterirommet. Fordi CD38 intensitet definerer tre nye cellen avdelinger av: CD38 negative (P6), CD38 dim (P7) og CD38 lyse (P8) (figur 1). MFI CD38 bestemmes bruker enten hematogones og/eller plasma celler som en positiv internkontroll som disse cellene sterkt express CD38.
Immunodeficient hilsen/SCID/IL2Rγcnull . (NSG) musemodell er mye brukt for engraftment av normal og ondartet menneskelige blodkreft cellene10,11. Føljetong xenotransplantation analyser brukes til å validere eksperimentelt Lexmarks Løsningssenter eller HSC funksjonen. Disse studier er grundig analysert av storskala sekvensering tilnærminger. Likevel er mindre kjent om Lexmarks Løsningssenter og HSC immunophenotype AML blast befolkningen engrafted i NSG mus sammenlignet sin primære AML (figur 2).
Antall Lexmarks Løsningssenter er iboende lav dermed, identifikasjon og kvantifisering av Lexmarks Løsningssenter er utfordrende og metoden beskrevet her kan brukes som en flyt cytometric analysen diagnose og klinisk følge å evaluere kjemoterapi respons (som gjenværende Lexmarks Løsningssenter kan forårsake AML tilbakefall). Tilstedeværelsen av Lexmarks Løsningssenter kan angi positiv minimal gjenværende sykdom (MRD). Til dags dato, MRD overvåking i AML meste stole på genetiske metoder (dvs., RT PCR, NGS)10,12. Men i denne protokollen oppdage vi samtidige protein uttrykk for flere HSC/Lexmarks Løsningssenter (CD34, CD38, CD45RA, CD90) på primære blast celler av menneskelig AML ved multiparametric flyt cytometri2,8,9. Denne kombinasjonen av antistoffer kan brukes i alle standard flyt cytometri laboratorium og denne flyten MRD analysen er spesielt interessant når MRD av sanntids polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) ikke er mulig, dvs.hvis leukemi spesifikke molekylær markører er ikke synlig i diagnostiske AML utvalget. Videre er denne protokollen, komplementære til de mer følsomme molekylær MRD teknikkene, som mål å oppdage og kvantifisere unormal blodkreft stamfar celler som representerer en funksjonell celle karakteristisk (Figur 3).
Vi viser hvordan kvantifisere tre blodkreft stamfar befolkninger og antatte Lexmarks Løsningssenter rommet med forskjellige grader av modning av flowcytometri med antistoffer tilgjengelig i fleste kliniske laboratorier. Videre vi bekreftet tilstedeværelse av cellen seksjonene i tilsvarende pasient-avledet-xenografts (PDX) og på behandling oppfølging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi følger europeiske standarder for bruk av dyr for vitenskaplige formål. Denne studien ble godkjent av den lokale etikk (#3097-2015120414583482v3).
1. sample forberedelse
- Samle benmargen (2 mL) fra de novo AML i rør som inneholder antikoagulerende ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i en konsentrasjon av 1,8 mg per mL av benmarg.
- Utføre Ficoll separasjon, en tetthet gradert separasjon isolere mononukleære celler fra røde celler og granulocytter, som fulgte. Fortynne benmargen i 3 bind fosfat buffer saltoppløsning (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Nøye overlegg 1 volum av Ficoll med 1-volum av utvannet benmarg. Spinne 30 minutter på 300 x g uten brems. Overføre hvit buffy pels laget av mononucleated celler i en ny sterilt tube.
- Vask celler to ganger i 10 mL PBS) og sentrifuge 300 x g i 5 min, for å fjerne skadelige serum komponenter.
2. lysis av røde blodlegemer (RBC)
- Legge til 2 mL lyseringsbuffer (salmiakk 0,8%) i cellen pellets, vortex forsiktig og Inkuber ved romtemperatur for 5 min. sentrifuge 300 x g i 5 min.
Merk: om nødvendig Gjenta dette trinnet. - Vask celler i PBS som tidligere beskrevet (1.3.).
3. pasient avledet xenografts.
- Få blast celler fra benmargen etter Ficoll separasjon og etter lymfocytter uttømming bruker immunomagnetic negativt utvalg (CD3 for T- og CD20 for B-lymfocytter). Følg instruksjonene fra produsenten.
- Injisere 5 x 106 AML blast celler i halen åre unconditioned NSG mus. Bruke en begrensende enhet for å forenkle hale blodåre injeksjon. Holde mus under vanlige forhold og spesielt vilkår spesifikke-patogen-fri hele tiden, ved hjelp av individuelle ventilert bur og manipulasjon under laminær strømning panseret. Annenhver uke, ta 60 µL av blod av submandibular samling metoden bruker en hematokrit kapillær. Stedet av kapillær i en 5 mL rundt bunnen rør. Stopp bleed ved å bruke lett trykk bruker en liten sterilt gasbind puten. Utdriving blod med en ren sprøyte.
- Legg 1ml av lyseringsbuffer og ruge i 5min. Deretter sentrifuge 300 x g for 5min. vask med PBS og centrifugre på 300 x g i 5 minutter. Fjerne nedbryting, Legg til 100 µL PBS med 10% bovin serum albumin (BSA) flekk med 3 µL anti-menneskelige CD45-FITC og 1 µL anti-murint CD45-APC og Inkuber på 4 ° C i 30 minutter.
- Vask celle pellet to ganger i PBS (2 mL) med 10% BSA og sentrifuge 300 x g for 5 min.
- Aliquot opp til 1 x 106 celler per 100 µL av PBS i flyt cytometri rør.
- Undersøkelsen engraftment annenhver uke av chimerism analyse av CD45 uttrykk (menneskelige mot murine) bruker flowcytometri (figur 2A og B).
- På offer (ekstern eksplosjon antall større enn 70% eller alvorlig klinisk underskriver av sykdom), samle mononukleære blast celler fra knust spleens og benmarg ved flushing tibias og femurs med PBS som tidligere beskrevet13. Euthanize mus av cervical forvridning følgende internasjonale retningslinjer.
- Hvis cellen pellet inneholder RBC, utføre lysis av røde blodlegemer med lyseringsbuffer (trinn 2.1).
- Vask celler pellet to ganger i PBS (2 mL) med 10% BSA og sentrifuger 300 x g i 5 minutter.
- Samle celler og aliquot opp til 1 x 106 celler per 100 µL av PBS i flyt cytometri rør.
4. farging
- Legg konjugert antistoffer (se trinn 4.2) og vortex. Inkuber celler i 15 minutter i mørket ved romtemperatur.
- Bruk følgende panelet for menneskelig primære eller PDX prøver består av 10 µL av anti-CD36-FITC, 5 µL av anti-CD19-ECD, 5 µL av anti-CD33-PC5.5, 5 µL av anti-CD90-APC, 5 µL av anti-CD34-AA700, 5 µL av anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL av anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL av anti-CD123-PC7 og 2,5 µL av anti-CD45-KO.
- Fjerne ubundet antistoffer ved å vaske cellene i 2 mL PBS med sentrifugering 300 x g i 5 min.
- Nytt suspendere celler i 450 µL av PBS for siste flyt cytometric analyse.
5. gating strategi for flyt cytometri analyse
- Utføre datainnsamling (minst 500 000 celler) på en flyt cytometer utstyrt med rødt, blått og fiolett lasere. Kontroller cytometer innstillingene hver dag 1) optiske innretting, 2) fluidic system, 3) optisk følsomhet og 4) standardisering ved hjelp av fluorospheres
- Følg den sekvensielle gating strategien for å definere CD38 uttrykk (figur 1).
- Bruk celler fra normal benmarg prøver for å definere hematogones eller plasma celler som vil tjene som positive kontroll CD38 uttrykk.
Merk: denne porten er spesielt viktig å vurdere som etterfølgende antatte Lexmarks Løsningssenter bestander avhenger av definisjonen. - Definere fysiologiske forløpere celler (normal blast celler) ved CD45dim/SSC (siden XY) lavt befolkningstall kriterier (figur 1A). Innenfor denne blast befolkningen, definere hematogones, som viser en CD38 ++ CD19 + fenotypen (figur 1B) og til slutt, bruk CD36 og CD33 til å definere myeloblasts, monoblasts og erythroblasts (figur 1 c). Bestemme CD34 uttrykk på hematogones som vist i (figur 1E). Vurdere flere subpopulasjoner av prekursorer i blast cellene definert som P6-P10 (figur 1 d). Skille CD34 rommet blast celler i P6, P7, P8 stamfar subpopulasjoner basert på forhåndsdefinerte CD38 porter. Sikre at P8 rommet inneholder eksplosjonene som har den samme CD38 intensiteten som hematogones, at P6 inneholder celler som er CD38-basert på CD38 fluorescens minus én (FMO) kontroll og at P7 celler er i mellom de to ytterpunktene med hensyn til CD38 uttrykk (figur 1 d).
- Bruk celler fra normal benmarg prøver for å definere hematogones eller plasma celler som vil tjene som positive kontroll CD38 uttrykk.
- Fra CD34 + 38-(P6) skille gated celler, HSC fra antatte Lexmarks Løsningssenter bruker CD90 og CD45RA uttrykk (figur 1F).
Merk: HSC fenotypen er CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- og det multipotent progenitors (MPP) er definert som CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Antatte Lexmarks Løsningssenter fenotypen er CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + og mer umodne nedstrøms befolkningen er det lymfoide primet progenitors (LMPP) definert som CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. MRD overvåking av RT PCR
- Overvåke MRD nivåer av RT PCR som beskrevet tidligere14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi en metode for å bestemme stamfar populasjoner i normal og ondartet human benmarg prøver. Vi samlet benmargen og milten fra en vellykket PDX og utført multiparametric flowcytometri som beskrevet ovenfor. Vi sammenlignet flere subpopulasjoner av blast celler mellom diagnostiske pasienten prøven og den tilsvarende PDX og spesielt CD34 + CD38-stamfar rommet, særlig beriket i antatte Lexmarks Løsningssenter. Vi har funnet at CD34 + CD38-blast brøken var høyere i PDX sammenlignet med diagnostiske pasienten prøven (3.48% vs 0.53%, figur 2C, D). Interessant, fant vi en høyere prosentandel av antatte Lexmarks Løsningssenter (vise en CD34 + CD38-CD90-CD45RA + fenotypen) i PDX sammenlignet primære pasienten prøven (2.76% vs 0.48%, figur 2E, F), antyder en mulig anriking av ondartede stamfar celler i hematologic vev i denne musemodell. Hyppigheten av normal stamfar celle fraksjoner skiller ikke mellom PDX og pasienten prøven.
Videre studerte vi de blast celle stamfar populasjonene basert på uttrykk for CD34, CD38, CD90 og CD45A (som beskrevet i denne protokollen) i to forskjellige pasientprøvene, diagnose og behandling oppfølging om hvilket MRD. I første pasienten, CD34 + CD38-(P6) brøkdel økte fra 0,06 prosent på diagnose 3.33% med den første behandling oppfølgingen (figur 3A, B). I kontrast, CD34 + CD38-(P6) brøkdel redusert i andre pasienten fra 7,8% på diagnose 2,27% med den første behandling oppfølgingen (Figur 3 C, D). Følgelig antatte Lexmarks Løsningssenter brøken økte i første pasienten fra 0% diagnose 0,65% (figur 3A', B') og redusert i andre pasienten fra 6.57% på diagnose 1,44% med behandling oppfølging (Figur 3 c ', D'). Tilsvarende MRD overvåking av molekylære markører (dvs. NPM1 mutasjon [første pasienten] og CBFB-MYH11 translokasjon [andre pasienten]) viste at molekylær MRD redusere mindre i første pasienten (0,8%) sammenlignet med andre pasienten (0,05%) for første behandling oppfølging punktet (figur 3E, G). Til slutt, for å validere at antatte P6 Lexmarks Løsningssenter er ondartet, uttrykk for leukemi tilknyttet antigener CD123 og CD33 ble beregnet, viser unormale uttrykk for CD33 for både pasienter (figur 3F, G).
Figur 1 : Gating strategi brukes for fysiologiske prekursorer og AML eksplosjonene. Tetthet plott med gating av fysiologiske prekursorer vises for en vanlig benmarg. (A) Gating blast celler basert på CD45dimSSClow fenotypen på alle mononucleated celler. (B) Gating av hematogones (CD38 + CD19 +) for bekreftelse av CD38 positivitet. (C). Gating strategi normal myeloblasts, monoblasts og erythroblasts basert på CD33 og CD36. (D) Blast celler kan deles inn i CD34 + stamfar subpopulasjoner og bruke CD38 uttrykket i P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) celle avdelinger. (E) Gating av hematogones basert på CD34 og CD38, kontrollere CD38 positivitet. (G) fastsettelse av HSC, MPP, LMPP og antatte Lexmarks Løsningssenter subpopulasjoner bruker uttrykk for CD90 og CD45RA som tidligere beskrevet9. Av notatet, ingen påvisning av Lexmarks Løsningssenter som dette er et vanlig benmarg eksempel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Blast celle stamfar populasjoner i en pasient og tilsvarende pasient-avledet-xenograft (PDX) av multiparametric flowcytometri. (A-B) Chimerism analyse av PDX. (A) Murine og menneskelig eksplosjonene er først definert av størrelsen og strukturen (FSC, SSC). (B) deretter prosenten av menneskelig mot murine CD45 flekker er veiledende av xenoengraftment og leukemi byrden. Sammenligning av CD34 + CD38-blast cellene prosentverdi mellom (C) primære diagnose og (D) PDX AML prøven. Sammenligning av antatte Lexmarks Løsningssenter (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) mellom (E) primære AML og (F) PDX. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Blast celle stamfar populasjoner i to pasienter diagnose og etter remission induksjon terapi for minimal gjenværende sykdom (MRD) oppdagelsen. Flow cytometric analyse av CD34 + CD38-blast celle subpopulasjoner i to representant pasienter (A, C) diagnose og (B, D) etter remission induksjon terapi. Tall (A'-D') illustrerer respektive P6 portene som inneholder antatte Lexmarks Løsningssenter for to pasienter på diagnose og etter første behandling. Vises i (E, G) er minimal gjenværende sykdom (MRD) analysen av molekylære markører brukes for disse to pasienter over en periode på fem måneder (NPM1 mutasjon og CBFß-MYH11 gene fusion, henholdsvis). (F, G) Uttrykk for leukemi tilknyttet antigener CD123 og CD33 på antatte P6 Lexmarks Løsningssenter, viser unormale uttrykk for CD33 for både pasienter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En nøyaktig og reproduserbar vurdering av membran eller cytoplasmatiske markører av flowcytometri krever at instrument-innstillingene er bekreftet hver dag for optisk justering, riktig funksjon av det fluidic system, optisk følsomhet, og standardisering bruke kalibrering perler.
Påvisning av blast celle populasjoner i AML bruker CD90 og CD45RA multi parametrisk flyt cytometri analysen er en relativt enkel og pålitelig måte. Et viktig skritt i denne analysen er en nøyaktig vurdering av CD38 uttrykk på blast celler, for å utføre riktig gating av CD34 + CD38-befolkningen. CD38 intensitet defineres med normale bein margtransplantasjon celler spesielt på hematogones og/eller plasma celler (CD38 +). Intensiteten av andre markører bestemmes isotype kontroller.
CD45RA og CD90 brukes til å skille HSC fra antatte Lexmarks Løsningssenter. Den sistnevnte og ikke HSC kanskje årsaken til sykdommen tilbakefall, dermed denne protokollen er av interesse for minimal gjenværende sykdommen overvåking av flyt cytometri paneler. Overvåking av AML under behandling er avgjørende å forbedre risiko lagdeling og å veilede AML terapi. Beklageligvis, aktuelle molekylære markører er ikke tilgjengelige for alle pasienter. Derfor kan MRD overvåking av flowcytometri være mulig for alle AML tilfeller. Selv om denne metoden ikke kan være uttømmende som det focalizes på fleste AML tilfeller som har en CD34 + CD38-stamfar og antatte Lexmarks Løsningssenter innbyggere. Av notatet er det mulig at antatte Lexmarks Løsningssenter rommet kan inkludere normal progenitors, dvs. LMPP). Videre, vi kan ikke utelukke at det er sjeldne tilfeller med funksjonell Lexmarks Løsningssenter ikke følger denne unormal uttrykksmønster. Av notatet, selv i NPM1-mutert AML som anses CD34 negativ, er vi kjøpedyktig merker antatte Lexmarks Løsningssenter. Derfor tross av heterogenitet og kompleksiteten i AML LSC rommet, kan vår metode brukes som en biomarkør av kjemoterapi svar under oppfølging av AML.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av den franske Association Laurette Fugain, LigueContre le kreft (Nord Center), Fondation de France (leukemi Committee), SIRIC Oncolille og franske National Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
