Summary
Dit manuscript beschrijft het protocol voor Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP). Deze nieuwe methode vergemakkelijkt de specifieke isolatie en downstream proteomic karakterisering van elk twee interacterende eiwitten, terwijl met uitzondering van VN-complexvorm individuele eiwitten evenals complexen gevormd met concurrerende bindende partners.
Abstract
De vergadering van eiwitcomplexen is een centraal mechanisme dat ten grondslag ligt aan de regulering van vele cel signalering trajecten. Een belangrijk aandachtspunt van het biomedisch onderzoek is hoe deze dynamische eiwitcomplexen handelen om signalen van meerdere bronnen om een specifieke biologische reactie te integreren, en hoe dit wordt gedereguleerd in veel instellingen van ziekte ontcijferen. Ondanks het belang van dit belangrijke biochemische mechanisme is er een gebrek aan experimentele technieken die de specifieke en gevoelige deconvolutie van deze multi moleculaire signalering complexen kan vergemakkelijken.
Hier is deze tekortkoming aangepakt door de combinatie van een kwantitatieve analyse van eiwit, complementeren met een conformatie-specifieke nanobody, die wij hebben genoemd Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP). Deze nieuwe techniek faciliteert de specifieke isolatie en downstream proteomic karakterisering van elk paar van interacterende eiwitten, met uitsluiting van het un-complexvorm individuele eiwitten en complexen gevormd met concurrerende bindende partners.
De BiCAP techniek is aanpasbaar aan een breed scala van downstream experimentele tests en de hoge mate van specificiteit die worden geboden door deze techniek laat meer genuanceerde onderzoek naar de mechanica van eiwit complex vergadering dan momenteel mogelijk is met behulp van standaard affiniteit zuivering technieken.
Introduction
Eiwit complex vergadering is een belangrijke proces bij het handhaven van de spatio specificiteit van vele seingeving trajecten1,2. Terwijl de kritische aard van deze regelgevende rol wordt algemeen erkend, is er een gebrek aan experimentele technieken beschikbaar om onderzoekt deze complexen. Meeste interactomics studies richten op interacties met afzonderlijke proteïnen, of de sequentiële verrijking van individuele complexe componenten. Hier presenteren we een techniek voor de isolatie van een specifieke proteïne-dimeer terwijl met uitzondering van de individuele wordt van het onderdeel eiwitten evenals complexen gevormd met concurrerende partners3bindend. We hebben deze techniek genaamd Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP), als het is een combinatie van een eerder bestaande eiwit fragment complementatie assay, Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC), met het nieuwe gebruik van een de recombinante nanobody conformatie-specifieke richting GFP en derivaten daarvan (Zie tabel of Materials).
Een typisch eiwit-fragment complementatie assay is afhankelijk van de expressie van "aas" en "prooi" eiwitten gesmolten als u wilt splitsen fragmenten van verslaggevers zoals luciferase4, β-galactosidase5of groen fluorescente proteïne (GFP)6 ( Figuur 1A). Door de interactie van de aas en prooi eiwitten, worden de split verslaggever domeinen aangemoedigd om refold in een functionele structuur, waardoor de interactie van het aas en prooi eiwitten worden gevisualiseerd of gekwantificeerd. BiCAP werd aangepast van een versie van deze techniek die gebruik van fragmenten van het GFP-variant Venus. Fluorescent proteïne complementatie testen zijn een populaire methode voor het visualiseren van eiwit-eiwitinteractie in een levende cel, maar tot nu toe beperkt gebleven tot en met dit één functie7. BiCAP vertegenwoordigt een belangrijke stap vooruit in dit opzicht, aangezien deze techniek niet alleen voor visualisatie, maar ook de isolatie en ondervraging van de resulterende eiwit-eiwit interactie staat.
Figuur 1: de structurele opdrachtgever achter de techniek BiCAP. (A) een schema waarin de opdrachtgever achter bimolecular fluorescentie complementatie weergegeven: de 'aas' en 'prooi' eiwitten gelabeld met de N-terminale V1 of V2 C-terminal fragmenten van de full-length Venus proteïne. (B) structurele analyse van de interactie interface (cyaan) tussen de GFP nanobody (groen) en gerecombineerde Venus, waarop de plaats van de (grijze) V1 en V2 (oranje) fragmenten (VOB toetreding 3OGO). Dit cijfer is heruitgegeven fromCroucher et al.3 herdrukt met toestemming van AAAS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De BiCAP techniek maakt gebruik van twee niet-belichting fluorescerende fragmenten van Venus (met de naam V1 en V2) die associëren met een lage graad van verwantschap, tenzij een interactie tussen de partners van hun fusie plaatsvindt. In dit geval refold de twee gesplitste domeinen naar de functionele structuur van de β-vat van de fluorophore (figuur 1B)6. De belangrijkste vernieuwing van BiCAP komt uit de invoering van de recombinante GFP-nanobody, die een driedimensionale epitoop herkend op de β-vat van GFP (en varianten zoals Venus) die alleen aanwezig op het fluorophore correct gerecombineerde en gevouwen ( is Figuur 1B)8. De nanobody van GFP bindt is cruciaal, niet tot een van de afzonderlijke fragmenten van Venus. Dit vergemakkelijkt de isolatie van de eiwit-Dimeren pas nadat de twee eiwitten een complex van hun eigen houtje, wat leidt tot meer representatieve resultaten dan die verworven van methoden waarmee het gebruik van chemisch geïnduceerde, gedwongen interacties9hebben gevormd.
BiCAP is een krachtige techniek die zich specifiek op meerdere eiwitcomplexen, die potentieel kunnen worden gecombineerd met een aantal downstream toepassingen richt ter verbetering van de granulariteit van ons begrip van de rol van deze complexen in signaaltransductie . Het omvat ook de belangrijke functie van het toestaan van visualisatie van eiwit interacties in situ. Tot op heden als een effectieve methode van het analyseren van de interactome van receptor tyrosine kinase (RTK) Dimeren3BiCAP is aangetoond, maar het aanpassingsvermogen van deze methode betekent dat het kan worden aangenomen in bijna elke context van de interactie eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het klonen van de plasmide
Opmerking: Voor het genereren van plasmide vectoren met de V1 of V2 tags gesmolten aan de N-terminus- of C-terminus van het gen van belang, BiFC bestemming vectoren zijn nedergelegd met Addgene [N-terminale label: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminal label: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Het gen/s van belang moeten worden in specifieke recombinatie klonen compatibel vermelding vectoren (dat wil zeggen, pDONR223 of pENTR221), zonder stop codonen, om verder te gaan met het klonen. Veel compatibel klonen zijn al beschikbaar binnen verschillende plasmide collecties, met inbegrip van de zoogdieren genoom-collectie (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).
- Voer een recombinatie reactie als u wilt invoegen het gen van belang tussen de sites van attR van de passende BiFC bestemming vector:
- In een 0,2 mL-buis, 150 ng post vector, 150 ng BiFC bestemming vector en 8 µL TE buffer (pH 8.0) toevoegen.
- 2 µL recombinase enzym mix toevoegen (Zie Tabel van materialen). Meng goed en kort centrifugeren.
- Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 16 ° C's nachts.
- Zet de reactie stop door toevoeging van 1 µL proteïnase-K oplossing en incuberen bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Transformeren warmte-schok-bevoegde cellen (Zie Tabel van materialen) met het reactieproduct van LR:
Opmerking: Elke elementaire stam denkbaar inzetbaar op dit punt, zolang het bevat niet de Ccdb-antitoxine, die zou voorkomen dat de specifieke selectie van plasmiden met de invoegen.- Ontdooi bevoegde cellen op ijs en breng 50 µL van cellen in een 14 mL Rondbodemkolf polypropyleen buis.
- Voeg 1 µL van reactieproduct aan de cellen en voorzichtig mengen. Incubeer gedurende 20 min op ijs.
- Verwarm schok in 42 ° C waterbad voor 45 s. onmiddellijk terug te keren naar het ijs gedurende 2 minuten.
- Voeg vervolgens 1 mL van LB-media en incubeer met schudden bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Plaat van de transformatie op een bord van 10 cm agar met ampicilline (100 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
- Zuivering van BiFC plasmide.
- Als u wilt zuiveren plasmide van een individuele kolonie, 100 mL van LB-media aan een grote erlenmeyer toevoegt en ampicilline (100 µg/mL). Om het scherm van meerdere kolonies, voeg 5 mL van LB-media 14 mL Rondbodemkolf polypropyleen buizen en toevoegen van ampicilline (100 µg/mL).
- Met behulp van een steriele inoculatie lus, kies een één kolonie van de agarplaat. Plaats de inoculatie lus in de LB-media en meng kort.
- Bedek de bovenkant van de erlenmeyer met aluminiumfolie en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden.
- Produceren van transfectie rang plasmide DNA met behulp van een standaard maxiprep of midiprep plasmide DNA zuivering kit (Zie Tabel van materialen)10. Beoordeling van kwaliteit van DNA door absorptie spectra.
Opmerking: DNA moet een verhouding van A260/A280 > 1.8 en een verhouding van A260/A230 > 2.0. Op dit punt, is het aanbevolen om meerdere afzonderlijke kolonies te controleren voor efficiënte expressie van het donormateriaal en de label van het scherm.
2. cel cultuur en transfectie
Opmerking: Voor transfectie van de vectoren van BiFC het is belangrijk om een hoog rendement en relatief homogene transfectie. De vectoren zal wellicht compatibel met elke standaard transfectiereagens, en de voorwaarden van de transfectie moeten dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. Voor het uitvoeren van massaspectrometrie, cultuur we meestal cellen binnen 10 cm schotels, hoewel dit kan ook worden proportioneel verkleind tot kleinere gerechten of platen voor experimenten die minder materiaal vereisen.
- Zaad 1.0 × 106 HEK293T cellen in een 10 cm schotel met 10 mL van DMEM media, aangevuld met 10% FBS en penicilline/streptomycine (1:100).
- Verdun 2,5 µg voor elke BiFC vector in 500 µL van transfectie buffer (Zie Tabel van materialen) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
- Voeg 10 µL van transfectiereagens (Zie Tabel van materialen).
- Vortex mengsel voor 10 s, dan kort centrifuge. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het mengsel van de transfectie DNA aan de plaat, ontkleuring. Incubeer de cellen gedurende een voldoende tijd voor de BiFC fusion eiwitten om te communiceren en voor Venus vouwen en fluorophore rijping, over het algemeen ~ 8-24 uur.
Opmerking: De excitatie van de piek voor Venus is 515 nm en haar piek-emissie is 528 nm, hoewel dit is gemakkelijk bekeken met behulp van een standaard fluorescente microscoop opgericht om te visualiseren GFP fluorescentie.
3. de monstervoorbereiding
-
Oogsten lysates
- Vóór lysate collectie, bereiden Lysis van de cel Buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, de niet-ionogene wasmiddel 1% (v/v) (Zie Tabel van materialen)]. Bewaren bij 4 ° C.
- Onmiddellijk vóór de oogst, een aanvulling op 10 mL Lysis van de cel Buffer met proteaseinhibitor en fosfatase-remmer (Zie Tabel van materialen). Houd aangevuld Lysis van de cel Buffer op ijs.
- Wassen cellen tweemaal in ijskoude PBS. De PBS gecombineerd en voeg 1 mL ijskoud aangevuld cellysis-buffermengsel. Zet de schotel op het ijs, ervoor te zorgen dat de buffer is verspreid over de gehele oppervlakte.
- Incubeer op ijs gedurende ongeveer 5 min. en gebruikt u vervolgens een cel schraper (Zie Tabel van materialen) schrapen van de cellen en overbrengen naar een vooraf gekoeld 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Verwijderen van cellulaire puin door centrifugeren de verzamelde lysate op 18.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en overdracht gewist supernatant in verse microcentrifuge buizen.
Opmerking: op dit punt de lysate kunnen onmiddellijk gebruikt of opgeslagen bij-80 ° C. Het is ook aanbevolen om een hoeveelheid ruwe lysate houden, zodat de efficiëntie van transfectie en de zuivering van de affiniteit kan worden gevalideerd.
-
Affiniteit zuivering
Opmerking: De BiCAP isolatie stap wordt uitgevoerd met behulp van de nanobody van GFP geconjugeerd met agarose kralen (Zie Tabel van materialen).- Bereid de agarose kralen door het wassen van een passende omvang (20 µL per monster) + 10 µL teveel in 1 mL PBS. De kralen op 300 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Voeg 20 µL aan elke lysate monster.
- Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij 4 ° C met end-to-end rotatie.
Opmerking: op dit punt de monsters kunnen worden voorbereid voor de SDS-pagina en westelijke bevlekken, of analyse door massaspectrometrie.
-
Voorbereiding van BiCAP eluant voor het westelijke bevlekken.
- Centrifugeer de kralen op 300 x g en wassen drie keer in Lysis van de cel Buffer.
- Resuspendeer de gewassen kralen in 50 µL van adequaat verdunde monster buffer (Zie Tabel van materialen) en warmte van de monsters bij 95 ° C gedurende 2-3 min.
Opmerking: Monsters voorbereid op deze wijze kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor enkele maanden. - Het uitvoeren van SDS-pagina en westelijke bevlekken11 voor zowel de label V1 en V2 labels (Zie tabel van materialen), als goed als elke andere proteïnen van belang.
-
Voorbereiding van BiCAP eluant voor massaspectrometrie.
Opmerking: Voor analyse door label-vrije kwantitatieve massaspectrometrie (LFQ) wordt aanbevolen om de voorbereiding van de monsters in ten minste quadruplicate om ervoor te zorgen robuuste statistisch onderscheidingsvermogen.- Centrifugeer de kralen op 300 x g en wassen zesmaal in Lysis van de cel Buffer zonder wasmiddel. Dit is noodzakelijk om zowel de overtollige eiwitten, en ook het wasmiddel dat met de analyse van de Spectrometrie van de massa interfereren zal. Ga naar de volgende stap onmiddellijk, of bewaar de kralen bij-80 ° C.
- Trypsinize kralen in 60 µL Buffer 1 [2 M ureum, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 µg/mL trypsine]. Toestaan dat de kralen te verteren voor 30 min bij 27 ° C in een thermomixer schudden bij 800 RPM.
- Kort centrifugeren kralen, dan verzamelen supernatant en overdracht microcentrifuge buizen (Zie Tabel van materialen).
- Wassen van de kralen in 25 µL Buffer 2 [2 M ureum, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol], teneinde de afhankelijke eiwitten.
- Zwembad de kralen en de bovendrijvende substantie in een microcentrifuge buis. Toestaan dat de vertering 's nachts optreden bij kamertemperatuur.
- Alkylate van de monsters door 20 µL van iodoacetamide (5 mg/mL in ultrazuiver water) toe te voegen aan elk monster en broeden in het donker gedurende 30 minuten.
- Remmen spijsvertering door de behandeling van elk monster met 1 µL trifluorazijnzuur (TFA). Deze stap zal ook de monsters ter voorbereiding van fase kantelen breng.
- Construct C18 fase tips door stapelen 6 lagen van 1 mm vaste fase extractie C18 (octadecylmethacrylaat) membraan schijven (Zie Tabel van materialen) in een 200 µL micropipet tip. Het voorbereiden van een enkele tip voor elk monster.
- NAT van de etappe tips met methanol, en equilibreer met 50 µL 0,1% (v/v) trifluorazijnzuur (TFA), 80% (v/v) acetonitril.
- De tips met 50 µL 0,1% (v/v) TFA wassen.
- Laad de aangezuurde peptiden op de fase tips en Elueer vervolgens met behulp van 0,1% (v/v), TFA, 80% (v/v) acetonitril in twee stappen.
- De monsters met behulp van een vacuüm concentrator verdampen.
- Indien nodig, opgeslagen gedroogde peptiden bij-80 ° C.
4. massaspectrometrie.
- Resuspendeer monsters in 15 µL van 5% mierenzuur, 2% acetonitril (in ultrazuiver water).
- Zorgvuldig laden 6 µL op een LC-plaat en de plaats in een nanoLC HPLC-systeem (Zie Tabel van materialen).
- Pak een 20 cm, 75 µM binnendiameter kolom met 1.9 µm C18 stationaire fase deeltjes (Zie Tabel van materialen). Laden 5 µL peptide op elke kolom.
- Elueer met behulp van een lineair verloop van acetonitril op 250 nL/min meer dan 140 min peptiden en in een lineaire Trap Quadropole (LTQ) hybride-massaspectrometer gekoppeld aan het nanoLC HPLC-systeem door nanoelectrospray introduceren.
- Tandem MS gegevens voor de top 10 meest voorkomende ionen per scan verzamelen over het verloop van een 140 minuten tijd. De volgorde van de gegevensverzameling en -uitwisseling met BSA uitvoeren tussen elk monster om te minimaliseren van de temporele bias willekeurig.
5. analyse
- Ruwe MS gegevens met behulp van de standaardinstelling binnen MaxQuant softwareversie 1.2.7.4 verwerken en analyseren van MaxQuant uitvoer met gewijzigde versie van de workflow van de statistische analyse Perseus in de R software omgeving3.
Opmerking: De workflow van de statistische analyse vanaf dit punt is samengevat in Figuur 2. Kort, LFQ intensiteiten van eiwitten geïdentificeerd met behulp van MaxQuant worden getransformeerd en gefilterd gevolgd door normalisatie en beschuldiging. Interacterende eiwitten van dimeer paren worden geïdentificeerd ten opzichte van een Venus-controle, om het uitsluiten van niet-specifieke achtergrond bindmiddelen, met de Student t-test en Benjamini-Hochberg correctie voor meerdere vergelijkingen. Kwaliteit van de gegevens wordt bevestigd door de vergelijkingen van de afzonderlijke histogrammen, meervoudige regressie en hiërarchische clustering.
Figuur 2: overzicht van de statistische analyse workflow. Stroomdiagram van een statistische analyse pijpleiding gebruikt voor het analyseren van de LFQ-intensiteiten van eiwitten geïdentificeerd van spectrometrie van de massa van de ruwe gegevens die worden verwerkt met behulp van MaxQuant. Groene vakken: filteren, blauwe dozen: transformatie/normaliseren/schalen, bruine boxen: gegevens kwaliteit controle, gele vakken: semi-kwantitatieve uitsluiting/vergelijkende analyse, grijze vakken: statistische analyse. Dit cijfer is heruitgegeven fromCroucher et al.3 herdrukt met toestemming van AAAS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het gebruik van recombinatie klonen voor het genereren van V1 en V2 tagged genen van belang met de BiFC pDEST plasmiden, co transfectie van plasmiden met twee, met een paar interacterende eiwitten zal resulteren in het genereren van een signaal Venus fluorescerende na ongeveer 8-24 uur. Bij gebrek aan een positief signaal is het mogelijk dat de interactie eiwit niet kan worden voorkomen als gevolg van de keuze van cellijn, een lage transfectie efficiëntie of die de oriëntatie van de BiFC-codes is niet optimaal. Probleemoplossing voor elk van deze scenario's is besproken.
We hebben eerder gezien een positieve interactie voor een aantal verschillende eiwit soorten ~ 16 uur na de co transfectie van HEK-293T cellen. Het gaat hierbij om de dimerisation van de RTK ERBB2 op het plasmamembraan (figuur 3A)3 en de binding van Ubiquitin aan de ligase E3 UBR5, die zich overwegend in de nucleus (figuur 3A)12voordoen. De mogelijkheid om te visualiseren de specifieke sub cellulaire lokalisatie van deze eiwit-eiwitinteractie, in tegenstelling tot de fluorescentie geheel-cel van de full-length Venus proteïne (figuur 3A), is de primaire functie van de bestaande BiFC-techniek. De belangrijkste vernieuwing van de BiCAP techniek is echter de mogelijkheid om specifiek zuiveren en karakteriseren deze interacterende eiwitten.
Figuur 3: BiCAP kunt visualisatie en isolatie van interagerende proteïnen. (A) Confocal fluorescentie microscopie analyse van het fluorescerende signaal geproduceerd door de full-length Venus proteïne, de interactie tussen ERBB2-V1 en ERBB2-V2 en de interactie tussen UBR5-V1 en V2-Ubiquitin na transfectie in HEK-293T cellen. Schaal bars, 10 µm. (B) HEK-293T cellen werden transfected met een besturingselement plasmide met full-length Venus, ERBB2-V1, ERBB2-V2 of zowel ERBB2-V1 en ERBB2-V2, gevolgd door met de nanobody van GFP immunoprecipitation en westelijke bevlekken met de aangegeven antilichamen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Deze specifieke reiniging door het BiCAP protocol geboden kan gemakkelijk worden waargenomen na de transfectie van een besturingselement plasmide die full-length Venus eiwit, bevatten afzonderlijke plasmiden vertegenwoordiger V1 of V2 gelabeld eiwitten bevattende diervoeders of de Co transfectie van deze twee plasmiden (figuur 3B). Na de transfectie van deze plasmiden in HEK-293T cellen, en een 16 h-incubatie, de voorbereiding van ruwe lysates voor het westelijke bevlekken met V1 en V2 label antistoffen toont aan dat elke tagged proteïne aanwezig binnen de adequate steekproef. Echter volgende affiniteit zuiveren met het GFP-nanobody, alleen de full-length Venus controle eiwit en de interactie V1 en V2 tagged eiwitten binnen het co transfectie monster kunnen worden gedetecteerd (figuur 3B).
Deze selectieve zuivering van interacterende eiwitten kan worden gevolgd door een aantal downstream technieken. In onze recente publicatie3 we de BiCAP workflow voor het uitvoeren van massaspectrometrie interactome analyse van de RTK ERBB2 als een homodimer of een heterodimer met EGFR en ERBB3 gebruikt (Figuur 4). Volgens onze gegevens analyse pijpleiding (Figuur 2) en visualiseren van de gegevens met behulp van Cytoscape13 we geïdentificeerd verschillende subsets van eiwitten die wisselwerking met alle drie ERBB2-dimeren of waren specifiek voor een paar Dimeren, of een individu dimeer. Nader onderzoek van deze interactie profielen konden we nieuwe patronen van binding aan eiwitten adaptor regulering van dimeer-specifieke signaaltransductie gebeurtenissen, die niet mogelijk zou zijn geweest met behulp van standaard co-immunoprecipitation benaderingen.
Figuur 4: analyse van de diversiteit van de interactome van ERBB2-bevattende Dimeren. De receptor lokaas gebruikt voor BiCAP staan in oranje, de kerngroep van 10 proteïnen gemeen hebben de interactome voor alle drie receptor-Dimeren in het blauw wordt weergegeven. Interacterende eiwitten gemeen hebben twee receptor Dimeren worden weergegeven in het groen en aan een receptor in het grijs. Dit cijfer is heruitgegeven fromCroucher et al.3 herdrukt met toestemming van AAAS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiCAP is een krachtige methode voor het isoleren van de specifieke proteïne Dimeren terwijl met uitzondering van de afzonderlijke bestanddelen en hun concurrerende bindende partners3. BiCAP is gebaseerd op de aanpassing van een fluorescentie eiwit complementatie assay genaamd BiFC6. Bestaande methoden, met inbegrip van BiFC en nabijheid afbinding testen, uitgebreid om te visualiseren en te kwantificeren eiwitinteractie in levende cellen7zijn gebruikt, maar did niet zorgen voor een doeltreffend middel voor het isoleren en karakteriseren van de Dimeren gevormd uit deze interacties.
Eiwit complementatie gebaseerd affiniteit zuivering technieken zijn ook blijven evolueren. Schopp et al. beschreef onlangs een systeem voor het eiwit dimeer nabijheid labelen met behulp van BioID14. Door het smelten van de split-fragmenten van de Biotine ligase BirA aan twee interacterende eiwitten, regisseerde ze verrijking van Ago2 met eiwitcomplexen die betrokken zijn bij de miRNA-gemedieerde gene zwijgen. Split-BioID vult BiCAP in waardoor selectieve verrijking van eiwitten in de nabijheid van bereik van BioID, waar BiCAP directe complexe interactors verrijkt.
Het succes van de BiCAP techniek is afhankelijk van de efficiënte transfectie van de vectoren BiFC. Terwijl wij routinematig HEK293T cellen als een robuust en gemakkelijk-aan-transfect cellijn gebruiken, kan het gebruik van deze cellijn beletten de identificatie van potentieel cel-specifieke interactie partners. Wij raden daarom dat de keuze van cellijn zorgvuldig worden overwogen voor elk experiment, met name voor studies met een bepaalde ziekte focus. Naast dit, moet optimalisatie van de transfectie voorwaarden ook worden uitgevoerd voor elke experimentele opzet. De waarden die worden beschreven in het protocol zijn afgestemd op ons werk op ERBB2 en waren gekalibreerd om de onderlinge aanpassing van de niveaus van endogene ERBB2 binnen borst kanker cellijnen. Het is verstandig, wanneer begint het onderzoek naar een specifiek eiwit-eiwit interactie, voor het uitvoeren van de verschillende proeven met behulp van verschillende hoeveelheden van beide constructies met het oog op een expressie niveaus die stroken met de aanwezigen in een fysiologische of patho-fysiologische instelling.
Een ander cruciaal onderdeel van dit protocol is het bepalen van de juiste tijd voor de monsters te worden gekapt volgende transfectie. Terwijl de vorming van eiwitcomplexen is over het algemeen een voorbijgaande proces, met de afzonderlijke onderdelen combineren en dat na verloop van tijd worden ontleed hebben de refolded Venus fragmenten een zeer trage dissociatie die niet met die van hun fusie-partners overeen mogelijk. In de praktijk betekent dit dat een redelijk strikte termijn na transfectie noodzakelijk is om een realistisch resultaat opleveren en te voorkomen dat de accumulatie van zeer overdreven uitgedrukt eiwit-aggregaten. In het algemeen, zodra BiFC fluorescentie is waarneembaar onder een standaard breed-gebied fluorescente microscoop (b.v. ~ 16 uur voor ErbB2-Dimeren), cellen kunnen worden voorbereid voor het oogsten van lysates of imaging, hoewel dit wellicht worden aangepast voor elke specifieke aas en prooi eiwit.
Onze recente publicatie het nut van BiCAP voor het isoleren van RTK Dimeren3aangetoond. Deze experimentele opzet had het voordeel van de stand van een bekende voor het eiwit interactie, waardoor de directe aanpassing van de V1 en V2 tags aan het einde van het intracellulaire, C-terminal van elke receptor. De nauwe uitlijning van deze tags is noodzakelijk voor hun opnieuw vouwen, en bij het onderzoeken van eiwitten interacties zonder de stand van een bekende is het van cruciaal belang voor het genereren van alle varianten van N-terminale en C-terminal label samensmeltingen teneinde een combinatie die zal resulteren in een positief signaal van de BiFC. Zelfs met de opneming van deze optimalisatie stap is er nog de mogelijkheid van een vals negatief als de uitlijning van een specifiek eiwit interactie volledig verzet zich tegen elke interactie tussen de tags.
Daarentegen moet ook worden gewaakt ter voorkoming van een valse positieve interactie. Bij langere tijd punten (> 36 h), we hebben het ontstaan van niet-specifieke achtergrond fluorescentie met sommige eiwit interactie paren eerder waargenomen. Waar mogelijk, moeten niet-interactie besturingselementen ook worden opgenomen te waarborgen het specifieke karakter van de waargenomen eiwit interactie en een geschikt tijdschema voor analyse na Transfectie te informeren.
BiCAP is een hoogst aanpasbaar techniek die geldt voor bijna elk paar van interacterende eiwitten. Om aan te tonen het nut van deze techniek die wij hebben gepresenteerd interactome gegevens gegenereerd door het gebruik van spectrometrie van de massa. De gezuiverde complexen moet echter compatibel met elke gewenste downstream assay. Bijvoorbeeld, terwijl het protocol BiCAP de zuivering van interacterende eiwitten toelaat, wellicht het genomic toepassingen via de stroomafwaartse gebruik van CHIP-seq naast proteomics. De toepassing van BiCAP in deze instelling zou voorzien in toenemende detailniveaus DNA bindende motieven van specifieke transcriptiefactoren, die is ook sterk gereguleerd door middel van complexe dimerisation patronen.
BiCAP vertegenwoordigt daarom een robuuste adaptie van eiwit fragment complementatie tests, waarmee de ondervraging van biochemische en genomische netwerken met de sterk verhoogde resolutie. In de toekomst, zal aanpassing en uitbreiding van de BiCAP techniek verhogen ons begrip van de complexiteit en plasticiteit van eiwit signalering netwerken en hun fijn afgestemde rol in de regulatie van ontwikkelingsstoornissen, fysiologische en ziekteprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
D.R.C is een kanker instituut NSW Fellow en D.N.S was eerder een kanker instituut NSW kerel. De onderzoeksresultaten gepresenteerd in dit manuscript werden gefinancierd door de kanker instituut NSW (13/FRL/1-02 en 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/SIRG/B2157), NSW Office of Science en medisch onderzoek, gastgezin Fellowship en Mostyn Family Foundation. J.F.H. en R.S. waren ontvangers van een Australische Postgraduaat Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
References
- Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
- Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).
- Croucher, D. R., et al. Bimolecular complementation affinity purification (BiCAP) reveals dimer-specific protein interactions for ERBB2 dimers. Sci Signal. 9 (436), ra69 (2016).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat Methods. 8 (12), 990-992 (2011).
- Rossi, F., Charlton, C. A., Blau, H. M. Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by beta-galactosidase complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (16), 8405-8410 (1997).
- Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc. 127 (1), 146-157 (2005).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21 (5), 539-545 (2003).
- Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem Rev. 110 (6), 3315-3336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. plasmid purification. J Vis Exp. , (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Shearer, R. F., et al. The E3 ubiquitin ligase UBR5 regulates centriolar satellite stability and primary cilia formation via ubiquitylation of CSPP-L. Mol Biol Cell. , (2018).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, 15690 (2017).
