Summary
Эта рукопись описывает протокол для Bimolecular очищение сродства комплементарности (BiCAP). Этот новый метод облегчает конкретные изоляции и вниз по течению proteomic характеристик любых двух взаимодействующих белков, хотя исключая ООН complexed индивидуальных белков, а также комплексы с конкурирующими привязки партнерами.
Abstract
Ассамблея белковых комплексов является центральный механизм, лежащий в основе регуляции многих клеток, сигнальные пути. Одним из основных направлений биомедицинских исследований расшифровка как эти динамические белковых комплексов действовать, чтобы интегрировать сигналы от нескольких источников для того, чтобы направлять конкретные биологической реакции, и как это становится дерегулируемых во многих заболеваний. Несмотря на важность этой ключевой биохимического механизма является отсутствие экспериментальных методов, которые могут способствовать конкретные и чувствительной деконволюция этих различных молекулярных комплексов сигнализации.
Здесь этот недостаток решается благодаря сочетанию комплементарности assay протеина с конформации конкретных наночастицы, которые мы называем Bimolecular очищение сродства комплементарности (BiCAP). Этот роман технику облегчает конкретные изоляции и ниже по течению proteomic характеристика любой пары взаимодействующих белков, к исключению ООН complexed индивидуальных белков и комплексов, сформированные с конкурирующими привязки партнерами.
BiCAP техника адаптируется к широкий спектр течению экспериментальных анализов, и высокая степень конкретности, обеспечиваемой этой техники позволяет более тонкий расследования механики сложных Ассамблеи белка, чем это возможно в настоящее время с помощью Стандарт соответствия методов очистки.
Introduction
Белка комплекс Ассамблея представляет собой ключевой процесс в поддержании пространственно-временных специфику многих сигнальных путей1,2. Хотя широко признается критический характер этой нормативной роли, есть отсутствие экспериментальных методов, доступных для изучения этих комплексов. Большинство interactomics исследования сосредоточены на взаимодействии с отдельными белками, или последовательного обогащения отдельных компонентов комплекса. Здесь мы представляем технику для изоляции определенных белков димер, хотя исключая отдельных постановление компонент белков, а также комплексы с конкурирующих обязательными партнерами3. Мы назвали эту технику Bimolecular очищение сродства комплементарности (BiCAP), как он представляет собой сочетание пробирного ранее существующие дополнения фрагмент белка, Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ), с использованием Роман конформации конкретных рекомбинантных наночастицы GFP и его производные (см. таблица материалов).
Типичный белка фрагмент комплементарности пробирного опирается на выражение «приманки» и «жертвой» белки, склеенный разделить фрагменты репортеров Люцифераза4, β-галактозидазы5или Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)6 ( Рисунок 1A). Путем взаимодействия белков приманку и добычу Сплит репортер домены предлагается сворачивают в функциональной структуры, позволяя взаимодействие приманку и prey протеины быть визуализированы или количественно. BiCAP был адаптирован от версии этого метода, который сделал использование фрагментов GFP вариант Венеры. Флуоресцентный белок комплементарности анализов являются популярным методом для визуализации белок белковых взаимодействий в живой клетке, но до сих пор были ограничены в этой одной функции7. BiCAP представляет собой значительный шаг вперед в этом отношении, как эта техника позволяет не только для визуализации, а также изоляции и допроса в результате взаимодействия протеин протеина.
Рисунок 1: структурная основным за технику BiCAP. (A) изложением основным за bimolecular флуоресценции дополнения показаны схема «наживки» и «prey» белки отмеченных N-терминальный V1 или V2 C-терминала фрагменты полнометражного Венера белка. (B) структурный анализ взаимодействия интерфейса (голубой) между GFP наночастицы (зеленый) и рекомбинированные Венеры, показывающий положение (серый) V1 и V2 (оранжевый) фрагменты (PDB 3OGO присоединения). Эта цифра составляет перепечатаны fromCroucher et al.3 печатается с разрешения AAAS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
BiCAP техника делает использование двух фрагментов не флуоресцентные Венеры (названный V1 и V2), которые связывают с низкой степенью родства, если происходит взаимодействие между партнерами их слияние. В этом случае две Сплит домены сворачивают в функциональную структуру β-баррель Флюорофор (рис. 1B)6. Основные инновации BiCAP приходит от введение рекомбинантных GFP наночастицы, который признает трехмерной epitope на β-баррель GFP (и такие варианты, как Венера), который присутствует только на правильно рекомбинированные и сложил Флюорофор ( Рисунок 1B)8. Самое главное GFP наночастицы не привязан к любой из отдельных фрагментов Венеры. Это облегчает изоляции белка димеры, только после того, как две белки сформировался комплекс по собственной воле, приводит к более репрезентативных результатов, чем тех, кто приобрел от методов, которые делают использование химически индуцированных, насильственных взаимодействий9.
BiCAP – это мощный метод, который специально посвящен мульти белковых комплексов, которые потенциально могут быть объединены с рядом нисходящие приложения для улучшения детализации нашего понимания той роли, которую играют эти комплексы в сигнальной трансдукции . Она также охватывает важную особенность позволяет визуализации белковых взаимодействий в situ. BiCAP до настоящего времени, было продемонстрировано как эффективный метод анализа interactome рецепторов тирозин киназы (РТК) димеры3, но и способность этого метода означает, что он может быть принят в контексте взаимодействия практически любого белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. плазмида клонирования
Примечание: Для создания векторов плазмида с V1 или V2 теги, сливается с N-конечная или C-конечная гена интереса, векторы БМФЦ назначения были сданы Addgene [N-терминальный тег: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-терминала тег: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Гена/s интерес будет необходимо в конкретных рекомбинации, клонирование совместимый вход вектора (то есть, pDONR223 или pENTR221), без остановки кодонов, чтобы продолжить с клонирования. Многие совместимый клоны уже доступны в различных коллекциях плазмида, включая коллекции генома млекопитающих (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).
- Выполните реакции рекомбинации для вставки гена интереса между сайтами attR соответствующие назначения вектора БМФЦ:
- В 0,2 мл трубку добавьте 150 нг вход вектора, 150 нг БМФЦ назначения вектор и 8 мкл TE буфере (рН 8,0).
- Добавить 2 мкл рекомбиназа фермент смесь (см. Таблицу материалы). Хорошо перемешайте и центрифуги кратко.
- Инкубируйте реакции на 1 ч при комнатной температуре или на 16 ° C на ночь.
- Остановите реакции, добавив 1 мкл раствора протеиназы K и инкубации при 37 ° C за 10 мин.
- Преобразования тепла шок компетентных клеток (см. Таблицу материалы) с продуктом реакции LR:
Примечание: Любые основные деформации может быть использован на данный момент, до тех пор, как он не содержит Ccdb антитоксина, который предотвратил бы конкретные выбор плазмид, содержащий вставки.- Оттепель сведущие клетки на льду и передачи 50 мкл клеток в круглодонные полипропиленовые трубы 14 мл.
- 1 мкл продукт реакции к клеткам и аккуратно перемешать. Проинкубируйте втечение 20 мин на льду.
- Тепловой шок в ванну воды 42 ° C для 45 s. немедленно вернуться на лед на 2 мин.
- Добавьте 1 mL фунта СМИ и инкубировать встряхивании при 37 ° C в течение 1 ч.
- Пластина преобразования на пластину агар 10 см, содержащий ампициллина (100 мкг/мл) и инкубировать при 37 ° C на ночь.
- Очистка БМФЦ плазмиды.
- Для очищения плазмиды от индивидуальных колонии, 100 мл LB СМИ в большой коническую колбу и добавить ампициллин (100 мкг/мл). Для блокировки нескольких колоний, 5 мл LB СМИ в 14 мл круглодонные полипропиленовые трубы и добавить ампициллин (100 мкг/мл).
- С помощью стерильных прививка цикла, выберите один колонии от плиты агара. Место прививки цикла в СМИ LB и перемешать кратко.
- Крышка в верхней части коническую колбу с алюминиевой фольгой и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании.
- Производят трансфекции класс плазмида ДНК с помощью стандартного maxiprep или midiprep плазмидной ДНК очистка kit (см. Таблицу материалы)10. Оцените качество ДНК по спектрам поглощения.
Примечание: ДНК должны иметь отношение A260/A280 > 1.8 и соотношение A260/A230 > 2.0. На данный момент мы рекомендуем вам экран несколько отдельных колоний для проверки эффективности выражение и вставить тег.
2. Культура и Transfection клетки
Примечание: Для transfection БМФЦ векторов важно для достижения высокой эффективности и относительно однородных transfection. Векторы, вероятно, будет совместима с любой стандартной трансфекции реагента, и трансфекции условия должны быть оптимизированы, соответственно. Чтобы выполнить масс-спектрометрии, мы обычно культуры клеток в пределах 10 см блюда, хотя это может также быть пропорционально уменьшен до небольших блюд или пластины для экспериментов, которые требуют меньше материала.
- Семя 1.0 × 106 HEK293T клетки в 10 см блюдо с 10 мл DMEM СМИ, с 10% FBS и пенициллин/стрептомицина (1: 100).
- Разбавить 2,5 мкг каждая БМФЦ вектора в 500 мкл трансфекции буфера (см. Таблицу материалы) в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- 10 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы).
- Вихревой смесь для 10 s, а затем кратко центрифуги. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
- Добавьте смесь трансфекции ДНК к пластине, каплям. Инкубируйте клетки достаточное количество времени для синтеза белков БМФЦ взаимодействовать и Венера складывания и Флюорофор созревания, обычно ~ 8-24 ч.
Примечание: Пик возбуждения для Венеры-515 нм и ее пик выбросов является 528 Нм, хотя это легко просмотреть, используя стандартный флуоресцентный Микроскоп, чтобы визуализировать GFP флуоресценции.
3. Пробоподготовка
-
Заготовка лизатов
- До lysate коллекции, подготовить Буфер Lysis клетки [50 мм трис-HCl (рН 7,4), 150 NaCl, 1 мм ЭДТА, 1% (v/v) неионных моющего средства (см. Таблицу материалы)]. Хранить при 4 ° C.
- Накануне сбора урожая, Дополнение 10 мл буфера Lysis клетки с ингибитором протеазы и АБС битор фосфатазы (см. Таблицу материалы). Держите дополнениями Буфер Lysis клетки на льду.
- Вымойте клетки дважды в ледяной PBS. Аспирационная PBS и добавьте 1 mL ледяной дополнениями буфера Lysis клетки. Поместите блюдо на льду, обеспечение буфер распределяется по всей поверхности.
- Инкубируйте на льду примерно 5 минут, а затем использовать скребок клеток (см. Таблицу материалы), скрести клетки и передать предварительно охлажденные 1,5 мл microcentrifuge.
- Удаление сотовой мусора центрифугированием собранные lysate на 18,000 g × 5 мин при 4 ° C и передачи очищены супернатант в свежие microcentrifuge трубы.
Примечание: на данном этапе lysate могут быть использованы немедленно, или хранятся при температуре-80 ° C. Он также рекомендовал держать Алиготе сырой lysate, так что эффективность трансфекции и очищение сродства могут быть проверены.
-
Очищение сродства
Примечание: BiCAP изоляции шаг выполняется с помощью GFP наночастицы, конъюгированных агарозы бисером (см. Таблицу материалы).- Подготовьте агарозы бусы путем промывания соответствующий объем (20 мкл на сэмпл) + 10 мкл избыток в 1 мл PBS. Центрифуга бусы на 300 x g и удалить супернатант.
- 20 мкл каждого lysate образца.
- Проинкубируйте образцы для 2 ч при 4 ° C с вращением end-to-end.
Примечание: на данном этапе образцы может быть подготовлен для SDS-PAGE и Западный blotting или анализ масс-спектрометрии.
-
Подготовка BiCAP элюанта для западный blotting.
- Центрифуга бусы на 300 x g и стирать три раза в буфер Lysis клетки.
- Ресуспензируйте промывают бусины в 50 мкл буфера надлежащим образом разреженных образца (см. Таблицу материалы) и тепла образцы на 95 ° C на 2-3 мин.
Примечание: Образцы подготовлены таким образом может храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких месяцев. - Выполните SDS-PAGE и Западный blotting11 для тега V1 и V2 Теги (см. таблицу материалов), как также как любой другой протеинов интереса.
-
Подготовка BiCAP элюанта масс-спектрометрии.
Примечание: Для анализа лейбл бесплатно количественных масс-спектрометрия (LFQ) рекомендуется по крайней мере подготовить образцы в quadruplicate для обеспечения надежной статистической мощности.- Центрифуга бусы на 300 x g и мыть шесть раз в буфер Lysis клетки без моющего средства. Это необходимо удалить избыток белка и моющих средств, что будет мешать масс-спектрометрии анализа. Немедленно приступить к следующему шагу, или храните бусы-80 ° c.
- Trypsinize шарики в 60 мкл буфера 1 [2 М мочевиной, мм 50 Tris-HCl (рН 7,5), 5 мкг/мл трипсина]. Разрешить бусины в дайджест за 30 мин при 27 ° C в thermomixer, тряски на 800 об/мин.
- Кратко центрифуга бусы, а затем собирать супернатант и передачи microcentrifuge трубы (см. Таблицу материалы).
- Вымойте бисер в 25 мкл буфера 2 [2 М мочевины, мм 50 Tris-HCl (рН 7,5), Дитиотреитол 1 мм], для уменьшения связанных белков.
- Бассейн бусины и супернатант в одном microcentrifuge трубку. Разрешить пищеварение происходит на ночь при комнатной температуре.
- Алкилата образцы, добавив 20 мкл iodoacetamide (5 мг/мл в ультрачистая вода) для каждой выборки и инкубировать в темноте за 30 мин.
- Подавляют пищеварение, рассматривая каждого образца с 1 мкл trifluoroacetic кислоты (ТФК). Этот шаг также будет подкисляет образцов в рамках подготовки к стадии чаевые.
- Конструкция C18 стадии советы путем укладки 6 слоев добычи твердой фазы 1 мм C18 (Octadecyl) мембранных дисков (см. Таблицу материалы) в кончик микропипеткой 200 мкл. Подготовьте один подсказки для каждого образца.
- Намочите стадии советы с метанолом и сбалансировать с 50 мкл 0,1% (v/v) trifluoroacetic кислоты (ТФК), Ацетонитрил 80% (v/v).
- Вымойте Советы с 50 мкл 0,1% (v/v) TFA.
- Загрузить подкисленных пептидов на стадии советы и затем элюировать используя 0,1% (v/v) TFA, Ацетонитрил 80% (v/v) в два этапа.
- Испарится образцов, с помощью вакуума концентратор.
- При необходимости Храните сушеные пептидов при температуре-80 ° C.
4. масс-спектрометрии.
- Ресуспензируйте примеров в мкл 15 5% муравьиной кислоты, Ацетонитрил 2% (в ультрачистая вода).
- Тщательно загрузки 6 мкл на LC пластины и место в nanoLC ВЭЖХ системы (см. Таблицу материалы).
- Пакет 20 см, 75 мкм внутренний диаметр колонки с 1,9 мкм C18 стационарной фазы частиц (см. Таблицу материалы). Загрузка 5 мкл пептид на каждый столбец.
- Элюировать пептиды, используя линейный градиент Ацетонитрил в 250 нл/мин свыше 140 и ввести nanoelectrospray в линейной квадрупольные ловушки (LTQ) гибридный масс-спектрометр сочетании ВЭЖХ системы nanoLC.
- Сбор данных MS тандем для топ-10 самых распространенных ионов на сканирование над 140-минутный время градиент. Случайный порядок сбора данных и обмена данными с BSA курсируют между каждой выборки, чтобы свести к минимуму временные предвзятости.
5. анализ
- Обрабатывать необработанные данные MS, используя настройки по умолчанию в MaxQuant версии программного обеспечения 1.2.7.4 и анализировать MaxQuant вывода, используя модифицированную версию рабочего процесса статистического анализа Персей в среде программного обеспечения R3.
Примечание: Процесс статистического анализа с этого момента приводится на рисунке 2. Кратко интенсивности LFQ белков, определены с использованием MaxQuant преобразования и фильтруют следуют нормализации и вменения. Взаимодействуя протеины димер пар определяются путем сопоставления с Венеры управления, чтобы исключить неспецифических фон Биндеры, с t-тест и Benjamini-Хёхберг коррекции для нескольких сравнений студента. Качество данных подтверждается сравнения отдельных гистограммы, множественная регрессия, и иерархической кластеризации.
Рисунок 2: план статистического анализа рабочего процесса. Схема трубопровода статистического анализа, используемый для анализа интенсивности LFQ белков, определены данным сырой масс-спектрометрии, обрабатываются с помощью MaxQuant. Зеленые коробки: Фильтрация, синие ящики: трансформации/нормализации/масштабирование, коричневый коробки: данных контроля качества, желтый коробки: полуколичественного исключения/сравнительный анализ, серые коробки: статистический анализ. Эта цифра составляет перепечатаны fromCroucher et al.3 печатается с разрешения AAAS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После использования рекомбинации клонирования для создания V1 и V2 меткой генов интерес с БМФЦ pDEST плазмид, Сопредседатель трансфекции двух плазмид, содержащий взаимодействующие белков приведет поколения Венера флуоресцентного сигнала после приблизительно 8-24 часа. В отсутствие позитивный сигнал, когда это возможно, что белок взаимодействия не может происходить за счет выбора клеточной линии эффективность трансфекции низкий или что ориентация БМФЦ теги не является оптимальным. Устранение неполадок для каждого из этих сценариев рассматриваются ниже.
Ранее мы наблюдали позитивного взаимодействия для целого ряда типов различных белков ~ 16 часов после совместного transfection клетки ГЭС 293T. Это включает в себя dimerisation РТК ERBB2 на плазматической мембраны (Рисунок 3А)3 и привязка убиквитин лигаза E3 UBR5, происходит преимущественно в ядро (Рисунок 3А)12. Способность визуализировать конкретные субклеточном локализации этих взаимодействий протеин протеина, отличие от поклеточного флуоресценции полнометражного Венера белка (Рисунок 3А), является основной функцией существующих БМФЦ техники. Однако основным новшеством BiCAP техника является способность специально очищают и охарактеризовать эти взаимодействия белков.
Рисунок 3: BiCAP позволяет визуализации и изоляции взаимодействующих белков. (A) анализ микроскопии конфокальный флуоресценции флуоресцентного сигнала производства полнометражного Венера белка, взаимодействие между ERBB2-V1 и ERBB2 V2 и взаимодействие между V1 UBR5 и V2-убиквитин после трансфекции в ГЭС 293T клетки. Масштаб баров, 10 мкм. (B) ГЭС 293T клетки были transfected с управления плазмида, содержащие полнометражного Венеры, ERBB2-V1, ERBB2 V2 или ERBB2-V1 и ERBB2-V2, следуют иммунопреципитации с GFP наночастицы и Западный blotting с указанного антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Этот конкретный очистки, обеспечиваемой BiCAP протокол может наблюдаться легко после трансфекции управления плазмида, содержащие полнометражного Венера белок, индивидуальных плазмиды, содержащих белки представитель V1 или V2 с тегами или Совместное трансфекции этих двух плазмид (рис. 3B). После трансфекции этих плазмид в ГЭС 293T клетки и 16 h инкубации подготовка сырой лизатов для западный blotting с V1 и V2 тег антител показывает, что каждый помеченный белок присутствует в течение соответствующего образца. Однако следующие очищение сродства с GFP наночастицы, только полноформатный белка управления Венеры и взаимодействующих V1 и V2, тегами белков в рамках совместного трансфекции выборки может быть обнаружен (рис. 3B).
Этот выборочной очистки взаимодействующих белков может сопровождаться ряд методов ниже по течению. В нашей недавней публикации3 мы использовали BiCAP рабочего процесса для анализа interactome масс спектрометрии RTK ERBB2 Антуану или гетеродимера с EGFR и ERBB3 (рис. 4). Следуя нашей данных анализа трубопровода (рис. 2) и визуализации данных с использованием Cytoscape13 мы определили различные подмножества белков, которые взаимодействовали с все три димеры ERBB2, либо были характерных для пары димеры, или индивидуальный Димер. Более тщательный анализ этих профилей взаимодействие позволило нам определить новые модели адаптер связывания белков, регулирующих димер конкретного сигнала трансдукции события, которое не было бы возможно при использовании стандартных co иммунопреципитация подходов.
Рисунок 4: анализ разнообразия interactome ERBB2-содержащих димеров. Рецептор приманок для BiCAP показаны оранжевым цветом, основной группы 10 белков общие для interactome всех трех димеры рецепторов показаны синим цветом. Взаимодействуя протеины общие для двух рецепторов димеры показаны зеленым цветом, а также один рецептор в серый. Эта цифра составляет перепечатаны fromCroucher et al.3 печатается с разрешения AAAS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiCAP это мощный метод для изоляции определенных белков димеры исключая отдельные компоненты и их конкурирующих привязки партнеров3. BiCAP основана на адаптации флуоресценции белков комплементарности пробирного под названием БМФЦ6. Существующие методы, включая БМФЦ и близость лигирование анализов, широко используются для визуализации и количественной оценке взаимодействия протеина в живые клетки7, но не являются эффективным средством изоляции и характеризующие димеры, сформированы из Эти взаимодействия.
Белка дополнения на основе очищение сродства, которую методы также продолжает развиваться. Шопп et al. недавно описал систему для белка димер близости маркировки с помощью BioID14. Смешав Сплит фрагменты биотина лигаза бира для двух взаимодействующих белков, они направлены обогащение давности2 содержащий белковых комплексов участвуют в Мирна опосредованной генов. Сплит-BioID дополняет BiCAP позволяя для селективного обогащения белков в пределах близости диапазоне BioID, где BiCAP обогащает прямой комплекс посредники.
Успех метода BiCAP зависит от эффективного трансфекции БМФЦ векторов. Хотя мы обычно используют HEK293T клетки как надежные и легко transfect клеточной линии, использование этой линии клетки могут исключать выявление потенциально клеток конкретного взаимодействия партнеров. Поэтому рекомендуется тщательно изучить выбор клеточной линии для каждого эксперимента, особенно для исследований с уделением конкретного заболевания. В дополнение к этому следует также проводить оптимизацию условий трансфекции для каждой экспериментальной установки. Ценности, изложенные в Протоколе приведены в соответствие с нашей работой по ERBB2 и были калиброванные для приближения уровня эндогенного ERBB2 в пределах линии клеток рака молочной железы. Это разумно, когда начало расследование конкретных протеин взаимодействия, выполнить несколько испытаний с использованием различных количествах обеих конструкций для достижения выражение уровнях, согласуются с присутствующим в физиологических или патолого физиологическое значение.
Другим важным элементом этого протокола является определение правильное время для образцов быть заготавливаемым следующие transfection. Хотя формирование белковых комплексов обычно переходного процесса, с отдельными компонентами объединения и разборки со временем, сложил Венера-фрагментов имеют очень медленная диссоциация ставка, которая может не отражать их слияние партнеров. В практическом плане это означает, что достаточно строгие сроки после трансфекции необходимо получить реалистичные результат и предотвратить накопление высоко чрезмерно выраженная белка агрегатов. Как правило, после БМФЦ флуоресценции наблюдаемый под стандартный-поля флуоресцентный микроскоп (например ~ 16 часов для ErbB2 димеры), клетки могут быть подготовлены для уборки лизатов или изображений, хотя это, возможно, потребуется скорректировать для каждой конкретной приманки и жертвой белка.
Наше недавнее издание продемонстрировал полезность BiCAP для изоляции RTK димеры3. Эта экспериментальная установка имел преимущество известных ориентации для взаимодействия протеина, позволяя прямое выравнивание V1 и V2 теги в внутриклеточного, C-терминал конце каждого рецептора. Тесную увязку этих тегов, необходимых для их повторного складывания, и при расследовании взаимодействия белков без известных ориентации важно создать все варианты тегов сплавливаний N- и C-терминала для того, чтобы определить комбинацию, приведет к позитивным сигналом БМФЦ. Даже с включением этот шаг оптимизации есть еще возможность ложный отрицательный результат, если выравнивание взаимодействия определенного белка полностью исключает любое взаимодействие между тегами.
И наоборот должно быть осторожность для предотвращения возникновения ложных позитивного взаимодействия. Длиннее время точках (> 36 ч), ранее мы наблюдали появление флуоресценции неспецифической фон с некоторым парам взаимодействия протеина. Там, где это возможно, не взаимодействующих элементов управления следует также включить для обеспечения специфики взаимодействия наблюдаемых белка и информировать подходящие сроки для анализа после transfection.
BiCAP является весьма гибкой техника, которая применима к почти любой пары взаимодействующих белков. Чтобы продемонстрировать полезность этой техники мы представили interactome данных, получаемых с помощью масс-спектрометрии. Однако очищенный комплексы должны быть совместимы с любой требуемой течению assay. Например в то время как BiCAP протокол позволяет очистки взаимодействующих белков, он также может иметь геномной приложений через течению использования чип seq наряду с протеомики. Применение BiCAP в этой обстановке обеспечит повышение уровня детализации для ДНК мотивы привязки конкретных транскрипционных факторов, который также широко регулируется через сложные dimerisation моделей.
BiCAP поэтому представляет собой надежный адаптация фрагмент белка дополнения анализов, которая позволяет допроса биохимических и геномных сетей с резолюцией значительно возросла. В будущем адаптации и расширения метода BiCAP увеличит нашего понимания сложности и пластичности белков сигнальной сети и их тонко роль в регуляции развития, физиологические и процессов болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
D.R.C является членом NSW институт рака и D.N.S ранее был стипендиатом NSW институт рака. Результаты исследований представлены в этой рукописи финансировались NSW институт рака (13/FRL/1-02 и 09/Кор/2-39), NHMRC (проект Grant GNT1052963), фонд науки Ирландии (11/СИРГ/B2157), NSW Управления по науке и медицинских исследований, гостевые семьи Стипендии и Фонд Mostyn семьи. J.F.H. и р.с. были получателями австралийской последипломного Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
References
- Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
- Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).
- Croucher, D. R., et al. Bimolecular complementation affinity purification (BiCAP) reveals dimer-specific protein interactions for ERBB2 dimers. Sci Signal. 9 (436), ra69 (2016).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat Methods. 8 (12), 990-992 (2011).
- Rossi, F., Charlton, C. A., Blau, H. M. Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by beta-galactosidase complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (16), 8405-8410 (1997).
- Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc. 127 (1), 146-157 (2005).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21 (5), 539-545 (2003).
- Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem Rev. 110 (6), 3315-3336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. plasmid purification. J Vis Exp. , (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Shearer, R. F., et al. The E3 ubiquitin ligase UBR5 regulates centriolar satellite stability and primary cilia formation via ubiquitylation of CSPP-L. Mol Biol Cell. , (2018).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, 15690 (2017).
