Summary
في حين أن التصوير متعدد الفوتونات فعال فقط على أعماق محدودة من سطح الأنسجة ، فمن الممكن تحقيق تصوير بدقة 3 ميكرومتر في أي عمق عبر pCLE. هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء تصوير pCLE لقياس ديناميكيات الأوعية الدموية الدقيقة في الحصين للفئران من النوع البري.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو وصف الفحص المجهري بالليزر قبل السريري البؤري المقترن بحزمة الألياف الضوئية (pCLE) في تطبيقه المحدد لتوضيح تأثيرات تدفق الدم الشعري أثناء النوبات ، مدفوعة بالخلايا الجدارية. أظهر التصوير القشري في المختبر وفي الجسم الحي أن انقباضات الشعيرات الدموية التي تقودها الخلايا المحيطة يمكن أن تنتج عن النشاط العصبي المحلي الوظيفي ، وكذلك من تطبيق الدواء ، في السليمة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول حول كيفية استخدام pCLE لتحديد دور ديناميات الأوعية الدموية الدقيقة في التنكس العصبي في الصرع ، في أي عمق الأنسجة (على وجه التحديد في الحصين). وصفنا تقنية تقييد الرأس التي تم تكييفها لتسجيل pCLE في المستيقظة ، لمعالجة الآثار الجانبية المحتملة للتخدير على النشاط العصبي. باستخدام هذه الطرق ، يمكن إجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية والتصويرية على مدار عدة ساعات في الهياكل العصبية العميقة للدماغ.
Introduction
على النقيض من طرق التصوير المجهري الأخرى1،2،3،4،5،6،7،8 ، يسمح الفحص المجهري متحد البؤر القائم على الألياف البصرية في الجسم الحي بقياس ديناميكيات تدفق الدم في أي منطقة دماغية ، في أي عمق ، بسرعة عالية (تصل إلى 240 هرتز حسب حجم مجال الرؤية9). يتيح مسبار الألياف الضوئية التصوير بالليزر متحد البؤر في الجسم الحي بدقة 3 ميكرومتر لأن طرف المسبار (هدف بدون عدسة يتكون من حزمة من الألياف الفردية بقطر 5000-6000 3 ميكرومتر) يمكن وضعه بدقة قطب كهربائي دقيق ، في حدود 15 ميكرومتر من هدف الفلورسنت محل الاهتمام. كما هو الحال مع التصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي ، يجب إدخال الفلوروفورات مسبقا في هدف التصوير. على سبيل المثال ، يمكن حقن فلوريسئين ديكستران (أو النقاط الكمومية) في الأوعية الدموية ، أو يمكن نقل البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا إلى الخلايا ، أو يمكن تحميل الأصباغ الفلورية مثل Oregon Green BAPTA-1 بكميات كبيرة في الخلايا ، قبل التصوير.
وجدت الأبحاث الحديثة التي تستخدم هذه التقنيات أن النشاط الحركي للخلايا الجدارية الذي يؤدي إلى التشنجات الوعائية الشعرية - الانقباضات المفاجئة التي تحدث في موضع الخلايا الجدارية أثناء النوبات 9 - يمكن أن يساهم في التنكس العصبي في الحصين9. في حين أظهرت دراسات التصوير السابقة في المختبر وفي الجسم الحي انقباضات pericyte مرتبطة بتطبيقات الأدوية6،7،10،11،12 ، وجد Leal-Campanario et al. أول دليل على انقباضات شعرية عفوية في الجسم الحي في دماغ الفئران. لإثبات الصلة بصرع الفص الصدغي البشري ، درسوا ذكور (P30-40 القديمة) بالضربة القاضية (KO) Kv1.1 (kcna1-null) الفئران 14,15 (مخزون JAX # 003532) ، وهو نموذج وراثي للرنح العرضي البشري من النوع 115. قادت Pericytes كلا من تضيقات الأوعية الجدارية الحصين المرضيةوالفسيولوجية 9 في المصابة بالصرع تلقائيا وزملائها من النوع البري (WT). تم تكرار هذه الملاحظات في WT التي أصيبت بالصرع بحمض الكينيك ، مما يشير إلى تعميمها على أشكال أخرى من الصرع. علاوة على ذلك ، قرر Leal-Campanario وآخرون ، باستخدام مناهج مجهرية مجهرية مجسمة جديدة ، أن الخلايا العصبية غير الصالحة - ولكن ليست صحية - في المصابة بالصرع كانت مقترنة مكانيا بالأوعية الدموية الدقيقة في الحصين. نظرا لأن السمية الاستثارية ليس لها ارتباط مكاني معروف بالأوعية الدموية ، فقد أشارت هذه النتيجة إلى أن نقص الأكسجة الناجم عن نقص الأكسجة الناجم عن نقص التروية الشعرية الشعرية غير الطبيعي يساهم في التنكس العصبي في الصرع. يوضح الشكل 1 مخططا للإعداد العام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع البروتوكول إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية التابعة لمعهد بارو للأعصاب.
1. تحديد المواقع المجسمة لحج القحف
- قم بوزن الفأر ثم تخديره بكوكتيل الكيتامين - زيلازين (100 مجم / كجم - 10 مجم / كجم i.p). تأكد من تخدير بالكامل من خلال ملاحظة عدم تفاعله مع قرصة الذيل و / أو إصبع القدم.
- ضع وسادة تدفئة تحت الماوس واستخدم مقياس حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم باستمرار أثناء جراحة زرع التخدير الأولية (الشكل 2 أ).
- تطبيق مرهم العيون لمنع جفاف العين.
- تثبيت رأس في إطار مجسم القوارض ، مجهزة محول الماوس. لتوجيه الماوس بشكل صحيح في الإطار التجسيمي ، ضع أسنان داخل فتحة شريط اللدغة (الشكل 2 أ والشكل 3 أ ، العنصر ز). شد مشبك الأنف حتى يصبح دافئا (الشكل 2 أ ، ب والشكل 3 أ ، البند ح). يجب أن يكون وضع جسم الماوس مستقيما قدر الإمكان (كما في الشكل 2 أ).
- قم بتأمين رأس باستخدام قضبان أذن الماوس مع أصفاد حامل الفك (الشكل 2A والشكل 3A ، البند i) ، لتثبيت العمليات الوجنية للجمجمة بإحكام.
ملاحظة: بمجرد تأمينه ، يجب ألا يكون لرأس الماوس نطاق حركة أفقية.
- قم بتأمين رأس باستخدام قضبان أذن الماوس مع أصفاد حامل الفك (الشكل 2A والشكل 3A ، البند i) ، لتثبيت العمليات الوجنية للجمجمة بإحكام.
- بمجرد ضبط الماوس على الإطار التجسيمي (الشكل 3B ، البند j) ، قم بتنظيف وتعقيم فروة الرأس عن طريق مسحها بفرك الكلور هيكسيدين 2-3 مرات ، في كل مرة يتبعها شطف الكحول. ثم ، ضع يدوكائين موضعي أعلى الرأس.
- قم بعمل شق على طول خط الوسط من الخلف إلى الأمام (ابدأ شق في قاعدة الجمجمة وأكمله بين العينين ؛ 12-15 مم) على طول خط الوسط السهمي للجمجمة ، باستخدام مقص دقيق أو شفرة. اسحب حدود فروة الرأس بأربعة مشابك بلدغ 28 مم لفضح الجمجمة وزيادة مساحة العمل (الشكل 2B والشكل 3C).
- استخدم مشرطا أو ملعقة دقيقة (الشكل 3 ج) لكشط السمحاق حتى حواف الشق. استخدم مقصا أو ملقطا لفصل الأنسجة (الشكل 3 ج) لسحب العضلات الموجودة في مؤخرة الرقبة بعناية (الشكل 2 ب).
- قم بتجفيف الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام قضيب ذو رأس قطني ، مبلل بالكحول أو 30٪ بيروكسيد الهيدروجين ، لتحسين تصور خيوط الجمجمة. ضع محلول ملحي على الجمجمة بمجرد إزالة النسيج الضام.
- بمجرد تثبيت رأس الفأر في الجهاز التجسيمي ، ضع طرف إبرة حقنة (21 جم) في حامل القطب (الشكل 3 ب ، البند ل) ، وقم بتوصيل حامل القطب بالمناور الدقيق التجسيمي ، وخفض طرف الإبرة إلى مستوى الجمجمة (الشكل 2 د).
- اضبط الاتجاه الإنسي الجانبي للجمجمة عن طريق قياس ارتفاع الجمجمة على أي مسافة خلفية لبريجما (أي -2.0 مم) ، ومسافتين متساويتين جانبيتين من خط الوسط على جانبي الجمجمة (أي ± 1.5 مم) (الشكل 2 د). استهدف فرق الارتفاع عبر المواقع التي تقل عن 0.05 مم في الاتجاه الظهري البطني.
- إذا كان أكبر من 0.05 مم ، فقم بتدوير جمجمة الماوس باستخدام قضيب العضة ، أو أعد وضع رأس الماوس عن طريق فك قضبان الأذن بعناية ، وتحريك الرأس وقضبان الأذن بشكل جانبي حسب الحاجة ، ثم إعادة شد قضبان الأذن.
- بمجرد وضع الجمجمة في جهاز التجسيم ، حدد وسجل الإحداثيات التجسيمية لخيوط الجمجمة bregma و lambda على طول المحاور الأمامية الخلفية (AP) والجانبية الإنسية (ML) والظهرية البطنية (DV).
- حدد النقطة المستهدفة (الحصين الأيمن) بمساعدة أطلس مجسم. ثم ، ابحث على الجمجمة عن إحداثيات النقطة المستهدفة بالنسبة إلى bregma (AP: -2.7 مم ، ML: -2.7 مم) (الشكل 2E).
- باستخدام علامة جراحية ، حدد أربع زوايا لنافذة تصوير 1.4 مم × 2 مم على الجمجمة بنقاط ، تتمحور حول النقطة المستهدفة مباشرة فوق الحصين (الشكل 2F) ، لحج القحف اللاحق.
- استخدم العلامة الجراحية لرسم نقطتين إضافيتين: واحدة فوق العظم الجداري العلوي الأيسر (الشكل 2G) والأخرى فوق العظم الجبهي الأيمن (الشكل 2H) ، للإشارة إلى الوضع المستقبلي لاثنين من البراغي العظمية (الشكل 3A ، البند ب) الذي سيثبت غطاء الرأس (الشكل 3B ، البند m) على الجمجمة.
- استخدم العلامة الجراحية لرسم ثلاث نقاط أخرى تشير إلى مكان إدخال أقطاب تسجيل EEG فوق الجافية: نقطة واحدة موضوعة 1 مم على جانبي خط الوسط ، ونقطة إضافية واحدة على خط الوسط موضوعة 1 مم خلف لامدا (الشكل 2E والشكل 4A والشكل 5B).
2. تركيب غطاء الرأس
- باستخدام نتوء قطره 0.7 مم (الشكل 3C) ، احفر بعناية فتحتين صغيرتين في الجمجمة ، في المواضع النقطية التي تشير إلى وضع مسامير العظام (انظر الخطوة 1.15 أعلاه). بعد ذلك ، خذ مسمارين عظميين (مشقوق من الفولاذ المقاوم للصدأ ، الطول: 4 مم ؛ القطر: 0.85 مم) تم تطهيرهما مسبقا بالإيثانول 70-80٪ ، وقم بتثبيتهما على الجمجمة لمزيد من ثبات غطاء الرأس (الشكل 2I-J والشكل 3A ، البند ب).
- تأكد من أن أطراف المسمار لا تبرز خارج الجزء السفلي من العظم في تجويف الجمجمة ، مما يخاطر بتلف الدماغ. لاحظ أن أحد المسمارين العظميين سيكون أماميا لبرغي غطاء الرأس ، والآخر خلفيا لهما (الشكل 2G-J).
- رش محلول ملحي على الجمجمة لتبريده وتنظيفه. ثم جفف الجمجمة تماما وضع طبقة رقيقة من cyanoacrylate حول البراغي.
- استخدم قطعة محاذاة مخصصة (الشكل 3A ، البند ج) مثبتة على محرك الأقراص الصغير المثبت على جهاز التجميع التجسيمي (الشكل 2F-J والشكل 3A ، البند d) ، بحيث يتم محاذاة موضع غطاء الرأس على طول خط الوسط ، مع التلال الأمامية التي تغطي bregma. هذه القطعة المخصصة من الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل حرف L (بزاوية 90 درجة) ، مع فتحتين مفصولتين ب 4 مم (الشكل 2F-J والشكل 3A ، البند ج).
- استخدم مناور التجسيم لوضع قطعة المحاذاة على شكل حرف L ، مع اثنين من مسامير محرك Fillister Head المشقوقة المرفقة (M1.6 x 0.35 متري خشن ، طول 12 مم ؛ الشكل 3 أ ، البند أ) فوق البريجما ، حتى تستقر قاعدة البراغي بشكل مسطح على الجمجمة ، مع الحرص على عدم ممارسة الضغط على الجمجمة (الشكل 2I-J).
- ضع cyanoacrylate متبوعا بأسمنت الأسنان لربط قاعدة البراغي بالجمجمة. احرص على عدم إعاقة العلامات المرجعية لنافذة التصوير فوق الحصين (الشكل 2K).
3. تصوير نافذة جراحة حج القحف
- في كل موضع من مواضع العلامات المرجعية لحج القحف التي تشير إلى زوايا نافذة التصوير (انظر الخطوة 1.14 أعلاه) ، قم بحفر ثقب نتوء قطره 0.7 مم ، متبوعا بتحديد محيط نافذة حج القحف 1.4 مم × 2 مم برفق باستخدام المثقاب ، مع قطع أعمق بشكل متكرر (الشكل 2L).
- احرص على عدم الحفر بعمق شديد أو بقوة كبيرة على الجمجمة ، وهي رقيقة وهشة ، ويبلغ سمكها حوالي 300 ميكرومتر. بمجرد اكتمال السديلة العظمية ، انزع السديلة السائبة بطرف مشرط ، مع الانتباه إلى عدم إتلاف الأم الجافية الأساسية.
- قم بتغطية النافذة المفتوحة بشمع العظام (الشكل 2M).
- باستخدام نتوء قطره 0.9 مم ، قم بحفر ثلاثة ثقوب لوضع أقطاب EEG فوق الجافية في المستقبل (انظر الخطوة 1.15 أعلاه) مع الحرص على عدم قطع الأم الجافية (الشكل 2E ، L).
- تغطية الثقوب الثلاثة بشمع العظام.
- ضع cyanoacrylate برفق حول حواف نافذة التصوير المغطاة بشمع العظام وثقوب EEG ، مع الحرص على عدم إغلاق حج القحف (الشكل 2L).
- قم ببناء جدار من الأسمنت السني يشمل نافذة التصوير وثقوب EEG ويربطها بغطاء الرأس الأسمنتي مسبقا (الشكل 2M والشكل 3B ، البند m).
- اترك الأسمنت يجف لمدة 10 دقائق على الأقل.
- أغلق أي هوامش جرح فضفاضة بخيوط بسيطة متقطعة ، باستخدام 4-0 أو 5-0 حرير مضفر أسود (الشكل 2N والشكل 3C).
4. ما بعد الجراحة
- استخدمي أداة تطبيق ذات رأس قطني لوضع مرهم ليدوكائين حول الجلد المكشوف لتهدئة الإحساس حول حافة الجرح.
- استخدمي أداة تطبيق معقمة ذات رأس قطني لتطبيق نيوسبورين على الجلد المكشوف.
- إزالة من الإطار التجسيمي (الشكل 2N).
- حقن كيتوبروفين (5 ملغ/كغ) IP أو IM للتسكين بعد الجراحة.
- راقب حتى يصبح في حالة تأهب ويتحرك (يحدث هذا عادة في غضون دقائق).
- ضع في قفص دافئ واستمر في مراقبة تعافيه حتى يشرب أو يأكل ويكون جاهزا للانتقال إلى سكن.
- تحقق من مرة واحدة على الأقل يوميا لمدة أسبوع تقريبا بعد الجراحة ، وراقب أي علامات على السلوك الفاتر و / أو عدم كفاية الأكل / الشرب (الشكل 2O).
5. حقن الصبغة وتسجيل EEG
- انتظر يوما واحدا على الأقل بعد جراحة زرع غطاء الرأس لبدء التسجيلات.
- ضع الماوس في جهاز تقييد الرغوة المصبوب على جسمه ، داخل الإطار التجسيمي (الشكل 3B ، العناصر n و j).
- ثبت غطاء الرأس (الشكل 3 B-I ، العنصر m) بشريط تثبيت مخصص متصل بالإطار التجسيمي (الشكل 3 أ ، ب ، العناصر ه ويي ، والشكل 4 أ). يجب أن يتراوح طول القسم الطويل من العنصر e (الشكل 3أ ، ب) بين 9.4 - 13 مم. ثبت العنصر f (لوحة تثبيت بأبعاد 1.5 سم × 0.5 سم ، مع فتحتين مفصولتين 4 مم من المركز إلى المركز) إلى العنصر e (الشكل 3أ ، ب ، العناصر ه ، و ، ك). سيضع نظام المحاذاة هذا الماوس المستيقظ بشكل آمن على الإطار التجسيمي طوال جلسات التصوير (الشكل 4).
- أدخل أقطاب تسجيل EEG فوق الجافية (الشكل 5A) ، وضع الأقطاب الكهربائية الأرضية (الأسلاك البيضاء) داخل الفتحة المركزية الخلفية ، وأقطاب التسجيل (الأسلاك الحمراء) في الثقوب الأمامية اليسرى واليمنى (الشكل 2E والشكل 4E والشكل 5E). ضع كل سلك على شكل حرف L بين الجمجمة والأم الجافية (الشكل 5C) لتحسين الاتصال الكهربائي.
- حقن الوريد الذيل مع ديكستران الفلوريسئين الأخضر القابل للتثبيت (0.2 مل / 25 غرام من وزن الجسم من فلوريسئين 5٪ وزن / وزن) ، لتصور تدفق الدم داخل الحصين.
- لتعزيز تمدد الوريد المركزي لذيل الفأر قبل الحقن ، استخدم واحدة أو أكثر من الاستراتيجيات التالية: أ) ضع 70٪ من الإيثانول على الوريد المركزي باستخدام قضيب ذو رأس قطني ؛ ب) اغمس الذيل في ماء دافئ (35-40 درجة مئوية) لمدة 1-3 دقائق ؛ ج) تعريض الذيل لمصباح التدفئة لبضع دقائق.
- قم بتأمين ذيل الماوس بإصبعين وحدد موقع الوريد المركزي ، الذي يقع أسفل الجلد مباشرة. أدخل الإبرة (حقنة الأنسولين متناهية الصغر مع إبرة مدمجة 30G) ، مع شطبة لأعلى ، في الوريد ، في منتصف الطريق تقريبا إلى الثلثين من قاعدة الذيل. الحفاظ على الإبرة موازية للذيل أثناء الحقن.
- حقن الصبغة ببطء وثبات ، مع الحرص على تجنب أي تغييرات في وضع الإبرة أو الذيل.
ملاحظة: يجب ألا تكون هناك مقاومة عند الضغط على مكبس المحقنة. - بعد الانتهاء من الحقن ، اسحب الإبرة واضغط برفق على موقع البزل لإغلاق الوعاء.
- السماح للتخثر بالحدوث.
6. في الجسم الحي الألياف البصرية حزمة مقترنة قبل السريرية المسح بالليزر المسح الضوئي بالليزر (pCLE)
- مباشرة بعد حقن الوريد الذيل (الخطوة 5.5.3 أعلاه) ، قم بتثبيت حزمة الألياف الضوئية المشطوفة 300 ميكرومتر (التي تحتوي على ألياف 5000-7000 3 ميكرومتر في كل حزمة) في الاتجاه الهبوطي إلى الذراع المتحرك للمحرك التجسيمي الروبوتي.
- إزالة الشمع العظام من حج القحف.
- قم بإزالة الجافية باستخدام الطرف المثني لإبرة حقنة.
- باستخدام نظام تحديد المواقع الروبوتي ، قم أولا بنقل هدف الألياف إلى الموقع التجسيمي الأمامي الخلفي والأيسر الأيمن المناسب ، مع تركيز الطرف في المحور z على سطح القشرة.
- بدء تسجيل EEG (الشكل 5D).
- ابدأ المسح بالليزر متحد البؤر للمستوى الخلفي لهدف الألياف ، متبوعا مباشرة بنزول الهدف ببطء في المحور z باستخدام عناصر التحكم z الخاصة بمحرك الأقراص الصغيرة الروبوتي ، حتى يصل إلى عمق الهدف داخل الدماغ (الشكل 4C). عرض نتائج التصوير في البرنامج المجهري أثناء النزول.
- إذا كان طرف الألياف داخل منطقة تسجيل X-Y-Z المستهدفة ، ودخلت سفينتان أو أكثر إلى مجال رؤية نافذة التصوير ، فقم بإيقاف الهبوط وبدء تسجيلات الفيديو. احصل على أفلام حية كاملة المجال لتدفق الدم عند 11.7 هرتز باستخدام برنامج التصوير الخاص ب Cellvizio Lab. (يمكن الحصول على سرعات أعلى باستخدام مجال رؤية أصغر). قد تتم التسجيلات لمدة 4-5 ساعات في المرة الواحدة ، في أيام متتالية إذا لزم الأمر.
- باستخدام حقنة سعة 10 مل مع أنبوب سيليكون مشطوف مثبت على طرف الإبرة ، قم بإطعام أثناء التسجيلات عن طريق توفير معجون مصنوع من كريات الفئران المطحونة بالماء بشكل دوري.
- في نهاية جلسة التصوير ، قم بإنهاء التسجيلات.
- قم بإزالة خيوط EEG برفق وتنظيفها باستخدام Tergazyme.
- قم بإزالة حزمة الألياف الضوئية ببطء من دماغ عن طريق عكس الألياف على طول المحور z للدخول.
- الافراج عن من وظيفة الرأس وقيود الجسم.
- إذا كان ذلك مناسبا ، اتبع بروتوكولات القتل الرحيم ومعالجة الأنسجة اللازمة لتصور الأوعية الدموية وإجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية.
- إذا كنت تخطط للتسجيل من نفس في جلسة مستقبلية ، فقم بتغطية نافذة التصوير بشمع العظام أو السيلاستيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد طورنا هذه الطرق لتقييم ما إذا كانت التشنجات الوعائية الشعرية غير الطبيعية التي تحركها الخلايا المحيطة بالخلايا في الحصين - والتي تحدث نتيجة للنوبات - يمكن أن تسبب نقص الأكسجة الصريح الذي يساهم في موت الخلايا في التركيز ictal 9,13.
أتاح تطوير غطاء الرأس وتركيبه المناسب ثباتا عاليا في التسجيلات ، مما سمح بالتسجيل المتزامن لتخطيط كهربية الدماغ وتدفق الدم في عمق الحصين للفئران المستيقظة من النوع البري والصرع خلال كل من الفترات البينية والفاصلة. يتطلب التقاط أحداث تدفق الدم المتعلقة بالنوبات التسجيل لفترات طويلة من الزمن ، بحيث يمكن التقاط أحداث تدفق الدم غير الدورية (مثل التشنجات الوعائية) استجابة لكل من نوبات الصرع المستحثة والتي تحدث بشكل طبيعي. سمح نظام التقييد بتسجيلات تدفق الدم المستقرة للأوعية الدقيقة العميقة في الدماغ وخلاياها الجدارية القريبة على مدار ساعات طويلة (الشكل 6A-R). وجدنا أنه في الأوعية الدقيقة بأكملها ، حدث توقف تدفق الدم في مواقع الخلايا الجدارية الموسومة.
لقد حددنا مواقع السفن بشكل موثوق في الحصين باستخدام جهاز تجسيمي آلي مستهدف بإحداثيات داخلية من أطلس تجسيمي قياسي. لقد تحققنا من جودة تسجيلات الألياف من خلال مقارنتها بتسجيلات التصوير ثنائية الفوتون عالية الدقة لتدفق الدم والتشنجات الوعائية المكافئة من الأنسجة القشرية ، على أعماق يمكن أن يصل إليها التصوير ثنائي الفوتون (الشكل 6S-AA). لقد تحققنا كذلك من نتائج pCLE باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية في مواقع التسجيل ، لنظهر باستخدام الفحص المجهري التقليدي متحد البؤر أن الخلايا الجدارية الحصين قد تم استهدافها بشكل صحيح وأنها لم تكن مقيدة فحسب ، بل كانت مرتبطة أيضا مكانيا بالتضيقات في الأوعية الدقيقة بعيدا عن الشرايين15 (الشكل 7).
تظهر النتائج المنشورة بهذه الطرق بالفعل تشنجات وعائية شعرية غير طبيعية في الحصين مدفوعة بالنوبات ، بالإضافة إلى موت الخلايا المرتبط في الفئران الطافرة الصرعية Kv1.1 والفئران الصرعية النموذجيةkainate 9،13. تشير هذه النتائج إلى دور لنقص التروية / نقص الأكسجة الموضعي في موت الخلايا أثناء النوبات ، بسبب التشنجات الوعائية غير الطبيعية ، وتساهم في مجموعة متزايدة من العمل الذي يتوسع في الآليات المحتملة لموت الخلايا الأذنية.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للتصميم التجريبي. سجلنا EEG أثناء إجراء الفحص المجهري متحد البؤر في الشعيرات الدموية الحصين لكل من الفئران المصابة بالصرع المستيقظة وزملاء WT. بعد حقن الوريد الذيلي بالفلوريسئين ، استخدمنا الفحص المجهري الداخلي بالليزر البؤري قبل السريري (pCLE) ، بهدف من الألياف بقطر طرف يبلغ 0.3 مم لتسجيل ديناميكيات تدفق الدم الشعري في عمق الدماغ. يشير اللون الأصفر إلى زيادة تدفق الدم ، ويشير اللون الأحمر إلى التدفق الثابت أو المنخفض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بروتوكول جراحة زرع غطاء الرأس. أ) تم وضع المخدر على وسادة تدفئة ووضعه داخل الإطار التجسيمي (انظر الشكل 3 ب ، البند ي) وتثبيته بقضبان أذن الماوس (الشكل 3 أ ، البند ط) وأصفاد حامل الفك (الشكل 3 أ ، العناصر ز ، ح) ، فوق وسادة تدفئة. ب) التعرض للخيوط القحفية. C-D) قياسات بريغما ولامدا. ه) تصور مواقع الحفر فوق جمجمة. تشير النقاط السوداء والمربع إلى النافذة فوق الحصين التي ستسمح بإدخال pCLI. تشير الدائرتان الأحمرتان إلى مواضع الإدخال لأسلاك تسجيل EEG. تشير النقطة البيضاء إلى نقطة إدخال الأسلاك الأرضية EEG. F) تشير النقاط السوداء الأربع على الجمجمة إلى الزوايا المستقبلية لحج القحف لنافذة التصوير فوق الحصين. قطعة المحاذاة المخصصة (الشكل 3 أ ، البند ج) ، مع غرسات عمود الرأس (الشكل 3 أ ، البند أ) متصلة بجهاز تحديد موضع microdrive التجسيمي (الشكل 3 أ ، العنصر د). G-H) تشير نقطتان إضافيتان ، واحدة خلفية (G) وواحدة أمامية (H) إلى الموقع المستقبلي لمسامير تثبيت غطاء الرأس (الشكل 3A ، البند ب). I-J) يثبت مسماران صغيران غطاء الرأس بالجمجمة (الشكل 3 أ ، البند ب). ك) يتم تطبيق Cyanoacrylate والأسمنت السني على مسامير التثبيت من الألواح I و J. L) تم حفر حج القحف لنافذة التصوير فوق الحصين ، والثقوب الثلاثة لأقطاب EEG. م) تم بناء غرفة التصوير (الشكل 3B ، العناصر i ، m) عن طريق نحت الساتر الترابي بأسمنت أسنان إضافي لتطويق ثقوب EEG الثلاثة ونافذة التصوير. N) منظر علوي لغطاء الرأس النهائي. O) الفأر المستعاد مرة أخرى في قفصه بعد جراحة الزرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المواد المستخدمة في البروتوكول (بنود محددة مذكورة بأحرف صغيرة). أ) المواد المستخدمة لبناء غطاء الرأس. (أ) مسماران آليان مقاس M1.6 × 12 مم (غرسات عمود الرأس). (ب) اثنين من البراغي الصغيرة لتأمين غطاء الرأس إلى الجمجمة. (ج) قطعة محاذاة مخصصة من الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل حرف L ، مع فتحتين تفصل بينهما 4 مم ، والتي تثبت المسمارين M1.6 أثناء الجراحة. (د) محرك ميكرودرايف قياسي مركب على جهاز تجسيمي يحمل البند ج. (ه) قضيب تثبيت مخصص مع قطعة محاذاة (و) تطابق الفتحتين من البند ج. (ز) قضيب عضة و (ح) مشبك أنف لتثبيت موضع رأس. ب) الإعداد أثناء التسجيلات. (ط) يتم تثبيت غطاء الرأس على البند و أثناء جراحة زرع التخدير. (ي) إطار تجاسي يضع محرك الأقراص الصغير (البند د). (ل) يتم توصيل إبرة 21G بمحرك الأقراص الصغير (البند d) وتستخدم لتحديد مواضع خيوط الجمجمة Bregma و Lambda. (م) يوجد هنا غطاء رأس محاكاة، مرفق بالبند و، لبيان موضع الفأر في (ن) أنبوب التقييد المبطن بالرغوة (الفأر غير موجود). البند n قوالب نفسه على شكل جسم الماوس. ج) الأدوات واللوازم اللازمة لإجراء الجراحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إعداد جلسة التسجيل. أ) رأس ثابت. ب) موقع أسلاك تسجيل EEG. يتم وضع أسلاك EEG البيضاء بشكل منفصل ، في كل جانب من الجمجمة. يتم وضع أسلاك EEG الحمراء معا في الفتحة الوسطى السفلية (الأرضية). ج) يتم إدخال حزمة الألياف الضوئية في النافذة المستهدفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تسجيلات تخطيط كهربية الدماغ. أ) يتم إجراء تسجيلات تخطيط كهربية الدماغ فوق الجافية باستخدام أجهزة إرسال Physiotel F20-EET ، في وقت واحد مع تسجيلات pCLE للألياف الضوئية في المستيقظ. ب) موقع الثقوب المحفورة لإدخال الخيوط لتسجيلات EEG. يذهب الخيطان الأحمران إلى الفتحتين المشار إليهما بنقاط حمراء. يتم إدخال السلكين الأبيضين معا في الفتحة المشار إليها بالنقطة البيضاء. يشير المربع الأحمر إلى النافذة المستهدفة فوق قرن آمون. يشير الحرف "B" الموجود على جمجمة الفأر إلى البريجما. ج) يتم ثني أسلاك تسجيل EEG على شكل حرف L لتعزيز الاتصال الكهربائي بين الجمجمة والمادة الجافية. د) أمثلة على تسجيلات EEG في الفئران المستيقظة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تسجيلات تضيقات الأوعية الدموية للخلايا الجدارية في الفئران. أ-ر) في الجسم الحي الألياف البصرية مزدوجة النطاق pCLE صورة من التشنج الوعائي الشعري (الأوعية باللون الأخضر ، المسمى مع ديكستران 2MD فلوريسئين مترافق) colocalized إلى الخلايا الجدارية (الأحمر ، المسمى عن طريق حقن ذيل الوريد الوريدي من Alexa Fluor 647) في الفئران بالضربة القاضية مستيقظة أثناء النوبة (يشير السهم إلى الخلية الجدارية والتشنج الوعائي المرتبط بها). انظر الفيديو 1 والفيديو 2. س-دبليو) في الجسم الحي المجهر بالليزر ثنائي الفوتون (TPLSM) كومة من الأوعية الشعرية (الخضراء) والخلايا الجدارية (الحمراء) من نوع الفأر البري. شاهد الفيديو 3. X-Z) في الجسم الحي TPLSM من انقباض شعري موضعي (أحمر) للفئران kainic. شاهد الفيديو 4. أأ) القياس الكمي لانقباض الأوعية من الألواح X-Z المقاسة عند الخط الأبيض. موازين الألواح A-R = 5 ميكرومتر ؛ S-W = 25 ميكرومتر ؛ X-Z = 5 ميكرومتر. تم تسجيل مقاطع الفيديو عند 11.7 هرتز. من ليال-كامباناريو وآخرون 8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الكيمياء الهيستولوجية المناعية للدماغ المسجل. أ-ب) الأوعية في التكبير المختلفة حقن مع ديكستران الفلوريسئين (الأخضر). نوى خلوية ملطخة ب DAPI باللون الأزرق (أسهم بيضاء). شريط مقياس ل A = 200 ميكرومتر ؛ شريط مقياس ل B = 100 ميكرومتر. ج) قسم مختلف من الدماغ يتم حقنه بالفلوريسئين حيث تظهر بوضوح خلية دم حمراء (سهم أحمر). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: تم تسجيل التشنج الوعائي وتدفق دم الخلايا الجدارية (11.7 هرتز) في الشعيرات الدموية الحصين KO. انظر الإطارات من نفس التسجيل في الشكل 6A-H. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2: التشنج الوعائي ، انسداد الكريات البيض ، تدفق الدم والخلايا الجدارية المسجلة في الشعيرات الدموية الحصين WT (11.7 هرتز). انظر الإطارات من نفس التسجيل في الشكل 6I-R. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 3: تدفق الدم غير المنتظم في القشرة الجدارية للفأر WT في الجسم الحي المسجل باستخدام TPLSM. انظر الإطارات من نفس التسجيل في الشكل 6S-W. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 4: انقباض شعري (أخضر) مدفوع بالخلايا الجدارية (أحمر) من القشرة الجدارية للاستيلاء على kainic المسجل باستخدام TPLSM. انظر الإطارات من نفس التسجيل الشكل 6X-Z. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قمنا بتطوير نظام تقييد غطاء الرأس لتجارب pCLE الكهربية والألياف البصرية المتزامنة في الفئران المستيقظة ، مما يقلل من تلوث الاستجابة المحتملة بسبب الأدوية المخدرة. غطاء الرأس وجهاز التركيب سهل البناء ويمكن إعادة استخدامه لتجارب التصوير المزمنة التي تتصرف مستيقظا. تحققنا من جودة التسجيلات مقابل المعيار الذهبي لتصوير تدفق الدم المجهري في الجسم الحي ، TPLSM.
المهارات الجراحية المتقنة ضرورية لتنفيذ البروتوكول الذي وصفناه هنا. يجب أن تتم الجراحة في ظل ظروف معقمة ودائما تحت مجهر التشغيل ، مع الحرص على ترك الأم الجافية سليمة عند حفر النافذة فوق الحصين. الإلمام بالأوعية الدموية الكامنة أمر ضروري ، لأن القطع فوق وعاء دموي رئيسي يخلق خطر حدوث نزيف غير مرغوب فيه.
يضمن وضع بشكل صحيح في محاذاة التجسيم أن المستوى الأمامي الخلفي مستوي قبل ربط غطاء الرأس. تسهل هذه الحماية تحديد مواقع الدماغ بمساعدة أطلس الدماغ.
يمكن أن تؤدي حركة الماوس إلى تلف الأوعية أو التسجيلات الخاطئة للتشنجات الوعائية (أي حركة الألياف بدلا من حركة الأوعية الحقيقية) ، لذلك من المهم تقليل حركة أثناء التسجيلات. تساعد حشوة الرغوة داخل أنبوب التثبيت على إطالة مدة جلسات التسجيل مع تقليل الضغط والحركة من الماوس. تفضل الفئران أن تتلاءم بشكل مريح مع الرغوة ، لذا فإن التركيب المناسب يقلل من الحركة المفرطة. بدون هذا الاحتياط ، قد تكافح الفئران. إذا أظهر الماوس علامات الصراع ، فيجب إنهاء جلسة التسجيل. قد تستأنف التسجيلات في اليوم التالي ، بمجرد أن تهدأ تفاعلات الإجهاد الفسيولوجي. في تسجيلاتنا ، كانت هادئة بشكل واضح معظم الوقت.
نلاحظ أن الحركة التي تؤثر سلبا على طريقة التصوير pCLE تحدث عندما يتحرك المسبار بشكل تفاضلي إلى أنسجة المخ. التنفس والنوبات وحركة ليست ذات صلة ما لم تحل محل مسبار الألياف فيما يتعلق بالأنسجة. أي عندما يتحرك مسبار التصوير بشكل تفاضلي إلى الأنسجة ، يتحرك مجال التصوير بأكمله كوحدة واحدة ، مما يجعل القطع الأثرية المتحركة واضحة. وبالتالي ، من الأهمية بمكان التسجيل دائما من سفينتين أو أكثر في وقت واحد: إذا تحركت جميع الأوعية في وقت واحد ، فقد يكون ذلك بسبب عدم استقرار الألياف ، بينما إذا لم يتغير وعاء واحد على الأقل ، فمن المحتمل أن تكون التغييرات التي تظهر في الأوعية الأخرى بسبب الاختلافات الفعلية في تدفق الدم ، بما في ذلك التشنجات الوعائية.
أحد قيود طريقة التصوير pCLE مقارنة ب TPLSM هو أن مسبار الألياف يثقب الحنون وبالتالي يكون غازيا للدماغ. عندما ينزل المسبار ، فإنه يسبب بعض الضرر للأنسجة العصبية التي يمر بها. وبالتالي ، يمكن أن يكون التسجيل من نفس السفينة في يومين متتاليين أمرا صعبا للغاية ، حتى عند استخدام نفس الإحداثيات الدقيقة في كلتا الجلستين (وغالبا ما يكون ذلك ممكنا فقط إذا كانت جلسة التسجيل الأولية قصيرة المدة). لذلك من الأهمية بمكان ، عند إجراء دراسات التسجيل المزمنة ، التسجيل على أعماق متزايدة في جلسات التسجيل اللاحقة.
تشير نتائج تجارب تدفق الدم إلى أن السمية الاستثارية ليست هي المسار الميكانيكي الوحيد لموت الخلايا القشرية وتصلب الحصين13. إن اكتشاف أن تقييد تدفق الدم الشعري يلعب دورا في التنكس العصبي ictal يمهد الطريق لتوسيع الطرق الموضحة هنا لتحديد تغيرات تدفق الدم المجهرية في أي عمق من الجسم ، وفي أي نسيج ، لأغراض التشخيص السريري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما نكشف عنه.
Acknowledgments
تم تمويل المشروع من خلال جائزة مبادرة بحثية من جمعية الصرع الأمريكية ، وجائزة من لجنة أريزونا للبحوث الطبية الحيوية إلى SLM ، بالإضافة إلى منحة تحدي من Research to Prevention Blindness Inc. إلى قسم طب العيون في جامعة ولاية نيويورك داونستيت للعلوم الصحية ، برنامج إمباير إمباير للابتكار في ولاية نيويورك ، ومنح أخرى من المؤسسة الوطنية للعلوم (0726113 و 0852636 و 1523614) ، ومؤسسة بارو العصبية ، والسيدة ماريان روشيل ، والسيدة جريس ويلتون ، وجوائز Dignity Health SEED ، والمنح الفيدرالية من المؤسسة الوطنية للعلوم (0726113 و 0852636 و 1523614) والمعهد الوطني للصحة (جوائز R01EY031971 و R01CA258021) ، إلى SLM و SMC تم دعم هذا العمل أيضا من قبل مكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية بموجب الجائزة رقم. W81XWH-15-1-0138 ، إلى SLM. تم دعم L.-C. من خلال زمالة José Castillejo من وزارة التعليم الإسبانية. كاباليرو والسيد ليدو على مشورتهما ومساعدتهما التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. Mouton, P. R. , John Wiley & Sons, Inc. Ames, USA. (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
